Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akciğer Epitelyal-Mezenkimal Geçişini Desteklemek için Silikaya Maruz Kalan Bir Fare Modelinde Nikotin Kullanılması

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65127

⸱

3 Mart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, deneysel silikoz farelerinde nikotinin pulmoner fibrozun ilerlemesi üzerindeki sinerjik etkisini incelemek için bir fare modelini açıklamaktadır. Çift pozlamalı fare modeli, nikotin ve silikaya aynı anda maruz kaldıktan sonra akciğerdeki patolojik ilerlemeyi simüle eder. Açıklanan yöntemler basittir ve yüksek oranda tekrarlanabilir.

Özet

Sigara içmek ve silikaya maruz kalmak meslek çalışanları arasında yaygındır ve silikanın sigara içenlerin akciğerlerine sigara içmeyenlere göre zarar verme olasılığı daha yüksektir. Sigaradaki birincil bağımlılık yapıcı bileşen olan nikotinin silikoz gelişimindeki rolü belirsizdir. Bu çalışmada kullanılan fare modeli basit ve kolay kontrol edildi ve insanlarda epitelyal-mezenkimal geçiş yoluyla kronik nikotin alımının ve tekrar tekrar silikaya maruz kalmanın akciğer fibrozu üzerindeki etkilerini etkili bir şekilde simüle etti. Ek olarak, bu model, sigara dumanındaki diğer bileşenlerin etkilerinden kaçınırken, nikotinin silikoz üzerindeki etkilerinin doğrudan incelenmesine yardımcı olabilir.

Çevresel adaptasyondan sonra, farelere 40 gün boyunca her sabah ve akşam 12 saat aralıklarla boyun üzerindeki gevşek cilde 0.25 mg / kg nikotin çözeltisi ile deri altına enjekte edildi. Ek olarak, kristal silika tozu (1-5 μm) normal salin içinde süspanse edildi, 20 mg / mL'lik bir süspansiyona seyreltildi ve ultrasonik bir su banyosu kullanılarak eşit olarak dağıtıldı. İzofluran ile uyuşturulmuş fareler, bu silika tozu süspansiyonunun 50 μL'sini burundan soludu ve göğüs masajı ile uyandırıldı. Silika maruziyeti 5-19. günlerde günlük olarak uygulandı.

Çift maruz kalan fare modeli, her iki zararlı faktöre de maruz kalan işçilerin maruz kalma geçmişiyle eşleşen nikotine ve ardından silikaya maruz bırakıldı. Ek olarak, nikotin, farelerde epitelyal-mezenkimal dönüşüm (EMT) yoluyla pulmoner fibrozu teşvik etti. Bu hayvan modeli, birden fazla faktörün silikoz gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

İşçilerde silika maruziyeti bazı mesleki ortamlarda kaçınılmazdır ve bir kez silikaya maruz kaldıktan sonra bozulma ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra bile ilerler. Buna ek olarak, bu işçilerin çoğu sigara içiyor ve geleneksel sigaralar binlerce kimyasal içeriyor ve temel bağımlılık yapıcı bileşen nikotin1. E-sigaralar genç yaş gruplarında giderek daha popüler hale geliyor2; Bu e-sigaralar bir nikotin dağıtım sistemi görevi görür ve nikotin erişimini arttırır, böylece akciğer duyarlılığını ve zatürreyi arttırır3. Sigara dumanı ayrıca bleomisine maruz kalan farelerde 4 pulmoner fibrozu hızlandırır ve silikaya maruz kalan farelerdepulmoner toksisiteyi ve fibrozu artırır 5,6. Bununla birlikte, nikotinin silikanın neden olduğu enflamatuar ve pulmoner fibroz sürecini etkileyip etkilemediği araştırılmaya devam etmektedir.

Yüksek dozda silikanın trakeaya bir kerelik solunmasıyla oluşturulan silikoz fare modeli, fareler için travmatiktir. Bu yöntem hızlı bir şekilde silikoz modeli sağlasa da, işçilerin tekrar tekrar silikaya maruz kaldığı bir ortamın gerçekliğiyle uyuşmuyor. Bu nedenle, burun akıntısı yoluyla tekrar tekrar düşük dozda silika süspansiyonu vererek silikaya maruz kalan bir fare modeli oluşturduk; Bu doz farelerde iltihaplanma ve fibrozise neden olabilir.

Diğer sigara bileşenlerinin etkilerini atlatmak için, bu fare modeli, bağımlılık yapan bileşen olan nikotinin silikoz üzerindeki etkisini belirlemek için boynun gevşek derisine deri altından nikotin enjekte edildi. Deri altı enjeksiyonların uygulanmasıyla, doğru dozlama elde edilebilir, böylece nikotin maruziyet modelleri oluşturmayı ve doz-toksisite tepkilerini ve bağımlılığı gözlemlemeyi mümkün kılar. Erkek farelerde nikotin enjeksiyon dozu 0.2-0.4 mg/kg 7,8 olan bir nikotin bağımlılığı modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, bağımlı farelerin ilaç arama ihtiyaçlarını karşılamak için, 12 saatlik aralıklarla iki deri altı enjeksiyon uygulandı. Bu fare nikotin bağımlılığı modeli, insanların sigara içme alışkanlıklarını ve silikaya maruz kalmayı simüle etmek için kullanışlıdır.

Tek faktörlü hayvan modellerinin hastalık çalışmalarında sınırlamaları vardır, oysa burada açıklanan yöntem, nikotin ve silika birlikte maruz kalmanın iki faktörlü bir fare modelini içerir. Silika maruziyetinden önce, fareler sigara içen kişilerde nikotin maruziyetini çoğaltmak için nikotine önceden maruz bırakıldı. Daha sonra, sigara içme öyküsü olan bireyler için bir çalışma ortamında silika maruziyetini taklit etmek için 5. günden 19. güne kadar silika maruziyeti gerçekleşti.

Alveoler makrofajların akciğer iltihabı ve fibrozisin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Makrofajlar, silika solunduğunda silikayı parçalayamaz, bu da makrofaj polarizasyonuna veya apoptoza9 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGF-β) gibi sitokinlerin salınmasına yol açar. Yüzey belirteci CD86'nın varlığı ile tanımlanan M1 makrofajları, silikozda inflamatuar yanıtın birincil tetikleyicileri iken, CD206 ile işaretlenen M2 makrofajları, durumun10'unun fibrotik fazından sorumludur. Çift maruz kalan farelerde nikotin, silika ile yaralanmış akciğerlerde makrofajların M2 fenotipine doğru polarizasyonunu indükledi ve böylece pulmoner fibrozu teşvik etti. Ayrıca, TGF-β1, fibroz ve EMT11'in indüksiyonunun anahtarıdır; TGF-β1'in artan ekspresyonu, EMT yoluyla akciğer fibrozunun ilerlemesini hızlandırdı. Bu model, nikotinin silikoz üzerindeki etkilerini başarılı bir şekilde analiz etti ve nikotin bırakmanın önemini daha da vurguladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NRC'nin 8. baskısı) tarafından yayınlanan yönergelere göre yürütüldü ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hayvan hazırlama

  1. 8 haftalık 32 erkek C57/BL6 fareyi 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüne sahip bir laboratuvarda barındırın. Farelerin yiyecek ve suya serbestçe erişebildiğinden emin olun.
  2. Çevreye alıştıktan 2 hafta sonra, 10 haftalık fareler 23-26 g ağırlığındayken, hayvanları bölmeden rastgele gruplandırmak için bir bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele sayıları kullanın ve dört fare grubu elde edin: kontrol grubu (Con), nikotin grubu (Nic), silika grubu (SiO 2) ve silika grubu (Nic + SiO2) ile birleştirilmiş nikotin.

2. Nikotin hazırlama

NOT: Nikotin yoğunluğu 1.01 g/mL'dir.

  1. Nikotini susuz etanol içinde çözün ve 50 mg / mL'lik bir nikotin stok çözeltisi hazırlamak için 20x seyreltin.
  2. 0.05 mg / mL konsantrasyonda çalışan bir çözelti yapmak için nikotin stok çözeltisini 1.000x steril normal salin ile seyreltin.
    NOT: Nikotini ışıktan uzakta saklayın. Stok solüsyon 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

3. Silika hazırlama

  1. 20 mg / mL silika süspansiyonu hazırlamak için steril kristal silikayı tuzlu su içinde askıya alın ve 25 dakika boyunca ultrasonik çalkalama su banyosunda salın.
  2. Fareler burun damlasını almadan önce silika süspansiyonunu bir girdap osilatörü ile 3 dakika çalkalayın. Silika süspansiyonunu 200 μL'lik bir pipetle 2x-3x yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından burun damlası için 50 μL alın.
    NOT: Silikon dioksit süspansiyonu mümkün olan en kısa sürede karıştırılmalı ve burun damlası yoluyla uygulanmalıdır.

4. Fare yakalama ve nikotin maruziyeti

  1. Fareleri tartın ve maruz kalmadan önce ağırlıkları günlük olarak kaydedin.
  2. 1-40. günlerde, Nic ve Nic + SiO2 gruplarındaki farelere günde iki kez (12 saat arayla) deri altından nikotin enjekte edin. 0.25 mg / kg'lık bir nikotin dozu kullanın; Örneğin, 25 g ağırlığındaki bir farenin 6.25 μg nikotin aldığından emin olun. Bu fare için enjeksiyon hacmi şu şekilde olacaktır: 6.25/0.05 = 125 μL. Eşzamanlı olarak, Con grubundaki farelere eşit miktarda salin enjekte edin.
  3. Her grup için gerekli 1 mL'lik şırıngaları hazırlayın ve bunları nikotin veya salin enjeksiyon hacmini aspire etmek için kullanın. Nikotini almadan önce, önce şırıngaya 0.1-0.2 mL hava çekin ve ardından 125 μL nikotin çekin. İğneyi ve şırınganın ön ucunu nikotinle doldurmak için şırıngaya dikkatlice dokunun. Nikotin içeren şırıngayı ışıktan korunan bir tepsiye yerleştirin.
    NOT: Enjeksiyon sırasında, nikotinin arkasında 0.1-0.2 mL hava bulunur ve bu da tüm sıvının fareye başarıyla uygulanmasını garanti eder.
  4. Farenin kuyruğunu sağ elinizle kavrayın ve hayvan rahatladığında, boynun arkasındaki cildi kuyruktan başağa, kulağın kenarına kadar bastırmak için sol başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın, orta derecede basınç uygulayın. Bundan sonra, sağ elinizi bırakın ve sol küçük başparmağınızı ve yüzük parmağınızı kullanarak kuyruğu ve arka bacakları sıkıştırın, bu noktada fare sol el tarafından tamamen hareketsiz hale getirilecektir.
    NOT: Fareyi uygun kuvvetle kavrayın. Yetersiz güç, farelerin ısırmasını kolaylaştırırken, aşırı güç, farelerin boğulmasına neden olabilir.
  5. Enjekte etmek için sağ elinizi kullanarak, farelerin kulak kenarına yakın boynun arkasındaki cildi şırınga ile baştan kuyruğa doğru delin ve eşit bir oranda nikotin enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonu gösteren yarım daire biçimli bir cilt çıkıntısı arayın.
    NOT: İğne cilde girdiğinde, bir direnç hissi olacaktır; İğne yerleştirildikten sonra direnç kaybolur. Bu noktada, yavaş ve eşit bir şekilde enjekte etmek için iğnenin hafifçe çekilmesi gerekir.

5. İn vivo silika maruziyeti

  1. 5-19. günlerde, silikon dioksit süspansiyonunu SiO 2 ve Nic + SiO2 gruplarındaki farelerin burun boşluğuna aşılayın. Her fareyi bir anestezi makinesinde% 2 izofluran ile 3.6 mL / s'lik bir dozda hızla uyuşturun. Anesteziden sonra, fareyi bir elin avucuna yerleştirin ve farenin burun boşluğunu ortaya çıkarın. 4-8 saniye içinde burun boşluğuna 50 μL silika süspansiyonu damlatın.
  2. Silika süspansiyonunun mümkün olan en kısa sürede akciğerlere girmesine izin vermek için, damlatmadan sonra, solunum hızını artırmak için farenin kalbine işaret parmağıyla saniyede 3-5 sn, 3x-5x hafifçe bastırın.
  3. Farenin solunumu yavaş yavaş homojen hale geldikten sonra, fareyi 3 dakika boyunca gözlemlemek için bir kafese yerleştirin.
  4. Silika süspansiyonu alan tüm fareler için 1-3 arasındaki adımları tekrarlayın. Kontrol grubunda, 5-19. günlerde burun boşluğuna 50 μL steril salin damlatın.

6. Taze ve sabit akciğer dokularının alınması

  1. 41. günde, fareleri vücut ağırlıklarına göre 0.1 mL / 20 g'lık bir dozda intraperitoneal olarak uyuşturmak için 50 mg / kg sodyum pentobarbital kullanın. Uzuvları bir köpük test plakasına sabitleyin ve kürkü% 75 alkol püskürtün.
  2. Taze akciğer dokusu elde etmek için kardiyak perfüzyon yapın, göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için karnın orta hattını kesin ve sağ kalbin tepesinde küçük bir açıklık açın. Daha sonra, sol kalbin tepesinden 20 mL önceden soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS) yavaşça ve eşit bir şekilde enjekte edin ve kanın sağ kalbin tepesinde oluşturulan açıklıktan dışarı akmasına neden olun. Tüm akciğer lobunu çıkarın, önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve protein ekstraksiyonunu bekleyen depolama için −80 ° C'ye aktarın.
  3. Tüm akciğerleri sabitlemek için diğer fareleri 20 mL önceden soğutulmuş PBS ve ardından aynı yerde 10 mL% 4 paraformaldehit ile perfüze edin; her akciğeri 30 mL% 4 PFA'da koruyun.
  4. 72 saat sonra, sabit akciğer dokularını parafine gömün.
    1. Akciğer dokusunu hazırlanan fiksatife 40 ° C'de 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosuna daldırın, ardından her biri 50 dakika boyunca% 75 etanol,% 95 etanol ve susuz etanol içinde bir dehidrasyon işlemi yapın.
    2. Her biri 50 dakika boyunca 2x ksilen ile yıkayın.
    3. Dokuyu 55-60 °C'de 2-3 saat eritilmiş parafin mumuna yerleştirin, böylece akciğer dokusundaki ksilen yavaş yavaş parafin mumu ile değiştirilir.
    4. Akciğer dokusunu gömme çerçevesine parafin ile sabitleyin ve balmumu bloğunun sertleşmesini bekleyin. Balmumu bloğu sertleştikten sonra, akciğeri 4-5 μm'de dilimlemek için parafin kesitleme makinesini kullanın.
  5. Akciğer bölümlerini 45 °C'de ultra saf suya koyun. Parafin eridikten sonra, akciğer bölümünü yapışık bir mikroskop lamına yükleyin.

7. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama

  1. Slaytları 60 °C'de 2 saat pişirin ve slaytları 2 x 30 dakika mumdan arındırmak için ksilen içine koyun. Ardından, slaytları her biri 5 dakika boyunca susuz etanol, %95 etanol, %85 etanol ve %75 etanol içine yerleştirin. Son olarak, ultra saf suyla 3 x 5 dakika yıkayın.
  2. Bir pipet tabancası ile akciğer dokusuna 50 μL hematoksilen boyama solüsyonu damlatın ve 5 dakika boyayın; Daha sonra dilimleri 5 dakika akan su ile yıkayın.
  3. Bölüme etanol içinde 50 μL% 2 hidroklorik asit ekleyin ve 30 saniye boyunca damıtılmış su ile durulayın. Daha sonra, 1 dakika boyunca boyamak için akciğer dokusuna 50 μL eozin boyama solüsyonu ekleyin.
  4. Parafin bölümlerini kurutun, şeffaflaştırın ve kapatın.
    1. Kombine bir plastik boyama tankına 100-150 mL %75 etanol, %85 etanol, %95 etanol, susuz etanol ve ksilen ekleyin. Slaytları kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %75, %85, %95 ve susuz etanol içine yerleştirin.
    2. Ardından, slaytları şeffaflaştırmak için 5 dakika ksilen içine yerleştirin.
    3. Son olarak, akciğer bölümüne 20 μL nötr sakız damlatın ve sızdırmaz hale getirmek için lamel üzerine bir lamel yerleştirin.
      NOT: Yukarıdaki adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

8. Masson boyama

  1. Parafin bölümlerini adım 7.1'de açıklandığı gibi mumdan arındırın, nemlendirin ve yıkayın.
  2. Bölümleri 7 dakika boyunca 50 μL yapılandırılmış Weigert'in hematoksilen boyama solüsyonu, ardından 10 saniye boyunca 50 μL asidik etanol fraksiyonlama solüsyonu ile boyayın ve çekirdekleri maviye çevirmek için akan su ile yıkayın.
  3. Bölümleri 50 μL Masson trikrom çözeltisi ile 4 dakika boyayın ve suyla yıkayın.
  4. Bölümleri 1 dakika damıtılmış suyla durulayın ve ardından 7 dakika boyunca Lichun kırmızı asit macenta ile boyayın.
  5. Bölümleri 1-2 dakika zayıf asit çalışma solüsyonu (% 30 hidroklorik asit), 1-2 dakika fosfomolibdik asit solüsyonu ve 1-2 dakika zayıf asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.
  6. Bölümleri anilin mavisi boyama solüsyonunda 2 dakika boyayın ve ardından 1 dakika boyunca zayıf bir asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.
  7. Bölümleri %95 etanol ve ardından 1 saniye susuz etanol ile kurutun, 1 saniye ksilen ile şeffaflaştırın ve son olarak adım 7.4'te açıklandığı gibi nötr reçine ile kapatın.

9. İmmünohistokimya

  1. Dilimleri 60 °C'de 6 saat pişirin. Parafin bölümlerini adım 7.1'de açıklandığı gibi mumdan arındırın, nemlendirin ve yıkayın.
  2. Antijen alımı: Dilimleri, dilimleri daldırmak için yeterli sitrat antijen alma solüsyonu içeren ısıya dayanıklı plastik bir dilimleme kutusuna koyun ve 20-30 dakika kaynatın.
  3. Oda sıcaklığına soğutun, bölümleri çıkarın ve deiyonize su ile durulayın. Daha sonra,% 0,5 Tween-20 (PBST) içeren PBS'de 2 x 5 dakika bekletin.
  4. Hidrofobik bir daire oluşturmak için hidrofobik bir kalemle slayttaki akciğer bölümünün yanına bir halka çizin.
  5. Dilimlere damla damla 50 μL %3 hidrojen peroksit çözeltisi (%3H2O2) ekleyin ve endojen peroksidazın inaktivasyonu için ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  6. Dilimleri PBST'de 3 x 5 dakika bekletin.
  7. Dilimlere damla damla 50 μL sığır serum proteini (BSA)-PBST ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat bloke edin.
  8. Bloke edici çözeltiyi atın, 50 μL seyreltilmiş primer antikor CD206 (seyreltme: 1:1,500), TGF-β1 (seyreltme: 1:200) ve vimentin (seyreltme: 1:2.000) dilimlere damla damla ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Bu çalışmada, tüm antikorlar %5 BSA'da seyreltilmiştir.
  9. Ertesi gün dilimleri oda sıcaklığına getirin (40 dakika). Dilimleri adım 9.6'da anlatıldığı gibi yıkayın.
  10. İkincil antikoru% 5 BSA'da seyreltin. Damla damla 50 μL yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor (seyreltme: 1:500) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Dilimleri adım 9.6'da anlatıldığı gibi yıkayın.
  11. Enzim etiketli sekonder antikora karşılık gelen 50 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) solüsyonunu akciğer dokusuna damlatın ve siyah bir immünohistokimyasal ıslak kutuda 5-10 dakika inkübe edin. Renk güçlü bir kahverengiye dönüşene kadar mikroskop altında gözlemleyin. Reaksiyonu sonlandırmak için dilimleri damıtılmış suyla durulayın.
    NOT: Kahverengi boyama pozitif boyama olarak kabul edilir.
  12. 30 saniye boyunca 50 μL hematoksilen boyası ile boyayın ve akan su ile yıkayın. Daha sonra dilimleri %75, %85, %95 ve susuz etanolde her biri 3 dakika ve ardından 2 x 10 dakika ksilen içinde bekletin. Slaytları adım 7.4'te açıklandığı gibi kapatın.

10. Batı lekesi analizi

  1. Akciğer dokusunu dondurucudan çıkarın ve tartın. Daha sonra, 20 mg akciğer dokusu başına PMSF içeren 150 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. El tipi bir homojenizatör kullanarak fare akciğerlerini 3-5 dakika buz üzerinde parçalayın, akciğer dokusunun yeterli parçalanmasını sağlamak için 4 ° C'de 2 saat hafifçe çalkalayın, 4 ° C'de santrifüj edin ve 15 dakika boyunca 14.800 × g ve süpernatanı toplayın.
    NOT: RIPA lizis tamponunu kullanmadan birkaç dakika önce 100 mM fenilmetansülfonilflorür (PMSF) ekleyin. PMSF'nin nihai konsantrasyonu 1 mM'dir (ör., 10 μL PMSF + 990 μL RIPA).
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için bir BCA protein konsantrasyon kiti kullanın. Belirlemeden sonra, en küçük protein lizat konsantrasyonunu baz olarak kullanarak, aynı kütle ve hacmi elde etmek için aynı protein lizat partisini RIPA ile en küçük konsantrasyona seyreltin.
    NOT: Toplam akciğer dokusu yükleme miktarı 30 μg'dır.
  3. 160 μL protein lizatına 40 μL 5x yükleme tamponu ekleyin ve 100 °C'de 10 dakika ısıtın.
  4. Hazırlanan% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelini batı lekeleme elektroforez sisteminde birleştirin, SDS-PAGE elektroforez tamponunu ekleyin, elektroforez tarağını yavaşça dışarı çekin ve 20 μL protein numunesi ekleyin. Gücü açın ve elektroforezi 30 dakika boyunca 80 V'ta başlatın. Proteinler alt jel tabakasına ulaştıktan sonra 100 V'a geçin ve elektroforeze 60-70 dakika devam edin.
    NOT: Elektroforez, taze elektroforez tamponuna ihtiyaç duyar.
  5. Proteinleri ıslak transfer yoluyla bir PVDF membranına aktarın. PVDF membranını önceden metanol ile etkinleştirin (5-30 s). Elektroforez jel plakasını çıkarın, dikkatlice kaldırın, ayırıcı jeli ıslak transfer tamponuna yerleştirin, elektrikli transfer sandviçini yapın ve ıslak transfer sistemini monte edin. Elektroforez tankını transfer tamponu ile doldurun ve 400 mA'da 90 dakika boyunca aktarın.
    NOT: Islak transfer sırasında yüksek sıcaklıkların etkilerini önlemek için transfer tamponu önceden soğutulur.
  6. PVDF membranını %0,5 Tween-20 (TBST) içeren Tris tamponlu salin ile 3 x 5 dakika yıkayın. PVDF membranını TBST ile seyreltilmiş% 5 yağsız sütle bloke edin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika inkübe edin; daha sonra TBST ile 2 dakika yıkayın. Yıkadıktan sonra, membranı gece boyunca 4 °C'de% 5 BSA içinde seyreltilmiş birincil antikor vimentin (1: 5.000) ve GAPDH (1: 10.000) ile inkübe edin.
  7. Membranı 30 dakika oda sıcaklığına getirin ve TBST ile 5 x 5 dakika yıkayın. Yıkadıktan sonra, membranı oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 5 yağsız sütle seyreltilmiş ikincil antikor (1: 10.000) ile inkübe edin.
  8. Membranı protein tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, hazırlanan ECL çalışma solüsyonunu bırakın, 1-2 dakika inkübe edin ve sonuçları bir jel görüntüleyici ile gözlemleyin. Protein ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için jel görüntüleyicideki yazılım tarafından ölçülen gri tonlama değerlerini kullanın.
    NOT: Burada, GAPDH dahili bir referans olarak hizmet vermiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farelerde silikozun ilerlemesinde nikotinin potansiyel rolünü araştırmak için silika maruziyeti ile birlikte nikotini incelemek için bir fare modeli oluşturulmuştur. Şekil 1 , bir nikotin enjeksiyonunu bir silika süspansiyonunun nazal damlatmasıyla eşleştiren çift pozlamalı bir fare modelini kullanmak için deneysel prosedürü göstermektedir. Her gruptaki farelerin patolojik değişiklikleri HE boyama kullanılarak gözlendi. Silika ile birlikte nikotine maruz kalan fareler, tek başına nikotin vey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nikotin ve kristalin silikon dioksite eşzamanlı maruz kalmanın rolünü ve potansiyel mekanizmalarını araştırmak için çift maruziyetli bir hayvan modeli gereklidir. Bu model, bu çalışmada deri altı nikotin enjeksiyonu ve silika burun damlası yoluyla elde edildi. Başarılı bir nikotin enjeksiyonu sağlamak için, operatörün fareleri kavramaya aşina olması gerekir, çünkü boynun arkasındaki cildi kavramak onlar için acı verici olabilir. Bu nedenle, farelerin yavaş yavaş kavramaya uyum sağlamasına izin vermek önemlidir. Ek olarak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma, Anhui Eyaleti Üniversite Sinerji İnovasyon Programı (GXXT-2021-077) ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Fonu (2021CX2120) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 formalin nötr fiksatifNanchang Yulu Deney Ekipmanları A.Ş.
alkol dezenfektanXintai Kanyuan Dezenfeksiyon Ürünleri A.Ş.
BSA, Fraksiyon VBeyotime BiyoteknolojiST023-200g
CD206 Monoklonal antikorProteintech60143-1-IG
Sitrat Antijen Alma Çözeltisibiosharp yaşam bilimleriBL619A
dimetil benzenBatı Asya Kimya Teknolojisi (Shandong) Co
Geliştirilmiş BCA Protein Test KitiBeyotime BiyoteknolojiP0009
GAPDH Poliklonal antikorProteintech10494-1-AP
Hematoksilen ve Eozin (H & E)Beyotime BiyoteknolojiC0105S
HRP substratMillipore CorporationP90720
HRP-konjuge Affinipure Keçi Anti-Fare IgG (H + L)ProteintechSA00001-1
HRP konjuge Affinipure Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)ProteintechSA00001-2
ImmPACT [R] DAB EqV Peroksidaz (HRP) SubstratVektör LaboratuvarlarıSK-4103-100
Masson'un Trikrom Leke KitiSolarbioG1340
MetanolMacklin
NikotinSigmaN-3876
fosfat tamponlu salin (PBS)  BiosharpBL601A
Fizyolojik tuzlu su Huainan Şehri
PMSFBeyotime BiyoteknolojikST505
Pozitif floresan mikroskobuOlympusCorporationBX53 + DP74
Önceden Boyanmış Renk Proteini Moleküler Ağırlık  Marker veya Önceden Boyanmış Renk Protein MerdiveniBeyotime BiyoteknolojiP0071
PVDF membranlarKırlangıç3010040001
RIPA Lizis TamponuBeyotime BiyoteknolojiP0013B
SDS-PAGE jel hazırlama kitiBeyotime BiyoteknolojiP0012A
Silikon dioksitSigma#BCBV6865
TGF- βBiossbs-0086R
Vimentin Poliklonal antikorProteintech10366-1-AP
Malzeme/ Ekipman AdıŞirketKatalog Numarası
0.5 mL TüpBiosharpBS-05-M Salınımlı
termostatik metal banyoAbson
Parafin Gömme MakinesiHassas (Changzhou) Tıbbi Ekipman A.Ş.PBM-A
Parafin DilimleyiciJinhua Kratai Instruments Co.
PipetlerEppendorf
Polarize ışık mikroskobuOlympusBX51
Hassas TeraziAcculabALC-110.4
RODI IOT akıllı çok fonksiyonlu su arıtma sistemiRSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D ÇalkalayıcıScilogex
Küçük hayvan anestezi makinesiAnhui Yaokun Biotech Co., Ltd.ZL-04A Üniversal Pipet Uçları
KIRGENKG1011
Üniversal Pipet UçlarıKIRGENKG1212
Üniversal Pipet UçlarıKIRGENKG1313
Vorteks  Mikserler VWR
Malzeme/Ekipmanın adı
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0
İlk Halk Hastanesi

Kaynaklar

  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
  2. Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794(2019).
  3. Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604(2021).
  4. Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
  5. Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
  6. Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
  7. Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
  8. Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517(2013).
  9. Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364(2020).
  10. Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066(2022).
  11. Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
  12. Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
  13. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  14. Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nikotin MaruziyetiSilika Fare ModeliAkci er FibrozisiPulmoner FibrozisSubk tan EnjeksiyonNazal Silika Maruziyetimm nohistokimyasal BoyamaKollajen BirikimiTGF Beta Bir
Akciğer Epitelyal-Mezenkimal Geçişini Desteklemek için Silikaya Maruz Kalan Bir Fare Modelinde Nikotin Kullanılması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.