Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Transgenik Aedes aegypti Sivrisineklerinde Kondisyon Maliyetlerinin Ölçülmesi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65136

⸱

15 Eylül 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vector-borne Infectious Diseases, Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4National Center for Microbiology, Instituto de Salud Carlos III

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, Aedes aegypti sivrisineklerinde doğurganlık, kanat boyutu, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrü dahil olmak üzere ortak yaşam parametresi verilerinin nasıl ölçüleceğini açıklamaktadır. Bu ölçümler, transgenik sivrisineklerin uygunluğunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Transgenik sivrisinekler genellikle vahşi tip muadillerine kıyasla fitness maliyetleri gösterir. Bu bağlamda, fitness maliyeti çalışmaları, genetik olarak değiştirilmiş sivrisineklerden yaşam parametresi verilerinin toplanmasını ve bunların aynı genetik geçmişe sahip transgenlerden yoksun sivrisineklerle karşılaştırılmasını içerir. Bu el yazması, sivrisinek Aedes aegypti'deki doğurganlık, kanat boyutu ve şekli, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrü dahil olmak üzere ortak yaşam öyküsü özelliklerinin nasıl ölçüleceğini göstermektedir. Bu parametreler üreme başarısını yansıttıkları, ölçülmeleri kolay oldukları ve literatürde yaygın olarak bildirildikleri için seçilmiştir. Temsili sonuçlar, bir gen nakavt edilmesi veya bir gen sürücü elemanının tek bir eklenmesi ile ilişkili uygunluk maliyetlerini ölçer. Yaşam parametresi verilerinin nasıl toplandığını standartlaştırmak önemlidir, çünkü bu tür veriler, çalışmalarda üretilen transgenik sivrisineklerin sağlığını karşılaştırmak veya simüle edilmiş bir vahşi tip sivrisinek popülasyonunda transgen fiksasyon oranını modellemek için kullanılabilir. Bu protokol transgenik Aedes aegypti için spesifik olsa da, protokol diğer sivrisinek türleri veya diğer deneysel tedavi koşulları için de kullanılabilir, ancak belirli biyolojik bağlamların özel adaptasyonlar gerektirebileceği uyarısı vardır.

Giriş

En uygun olanın hayatta kalması, çevrelerine en iyi şekilde adapte olmuş genleri barındıran bireylerin bu genleri sonraki nesillere aktaracağına dair Darwinci fikirdir1. Bu, genlerinin hayatta kalıp kalmayacağını belirleyenin zindelik olduğu anlamına gelir. 150 yıldan daha eski olan bu kavram, transgenik sivrisineklerde başarılı bir gen sürücüsü mühendisliğinin belki de en önemli belirleyicisidir. Gen sürücüleri veya bencil bir genetik elementin popülasyonlarayayılmasına izin veren süper Mendel kalıtım modeli 2, genetik haşere yönetimi3 için araştırılmaktadır. Vektör kontrolü bağlamında, bu strateji ya vahşi tip (WT) eklembacaklıları patojenlere dirençli olanlarla değiştirmeyi (popülasyon modifikasyonu) ya da hepsini birlikte ortadan kaldırmayı (popülasyon baskılama)4. Bununla birlikte, transgenik sivrisinekler, WT muadillerine kıyasla genellikle fitness maliyetleri (genetik yük olarak da adlandırılır) sergiler, bu da transgenin onları geride bırakabilecek popülasyonlarda kaybolacağı anlamına gelir. Bu nedenle, transgenlerin bir gen tahrik sistemi ile birleştirilmesi, herhangi bir uygunluk maliyetini dengelemek ve transgeni tipik Mendel kalıtımından beklenenden daha yüksek seviyelerde popülasyon boyunca itmek için gereklidir4.

Sivrisinek vektör türleri üzerinde yapılan laboratuvar çalışmaları, transgenlerin genellikle 5,6,7 fitness maliyeti gösterdiğini göstermiştir. Örneğin, Irvin ve ark. Drosophila aktin 5C veya sentetik 3XP3 promotörleri altında gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) veya transpozaz genlerini eksprese etmek için tasarlanmış Aedes (Ae.) aegypti'de çeşitli yaşam parametrelerini ölçtü ve bunları vahşi tip Orlando suşu (türetildikleri aynı genetik arka plan) ile karşılaştırdı5. En önemlisi, tüm transgenik suşların üreme uygunluğunu önemli ölçüde azalttığını buldular5. Transgene bağlı olarak, Plasmodium parazit gelişimini inhibe eden transgenleri eksprese eden bazı Anopheles (An.) sivrisinekleri de fitness maliyetleri sergiledi6. Spesifik olarak, An. stephensi, yapısal veya kan unu ile indüklenebilir promotörler altında bir arı zehiri fosfolipazı (PLA2) eksprese ederek, kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha az yumurta bıraktı6. Bu yazarlar ayrıca, farklı bir transgeni ifade eden transgenik Anofellerin, bir SM1 dodekapeptid tetramerinin uygunluk maliyetleri göstermediğini bulmuşlardır, bu da onları, transgen tarafından verilen uygunluk maliyetlerinin, en azından kısmen, üretilen transgenik proteinin etkisine bağlı olduğu sonucuna varmalarına yol açmıştır6. Gerçekten de, uygunluk maliyetleri, laboratuvarda yetiştirilen suşlarda transgen ürünlere, konumsal etkilere, hedef dışı etkilere, yerleştirme mutajenezine veya akrabalı yetiştirme etkilerine bağlanabilir7. Bu nedenle, gen sürücüleri, bu transgen kaynaklı uygunluk maliyetlerini dengeleyecek kadar sağlam olmalı ve aynı zamanda sürücünün kendisini bloke eden ekleme ve silmelerin (indels) geliştirilmesinden kaçınmalıdır.

Gelişimsel veya üreme uygunluğu maliyetleri, laboratuvar veya kafes çalışmalarında7 ölçülebilir, ancak alandaki bilinmeyen faktörlerin de bir etkisi olabileceği konusunda bir uyarı vardır. Bununla birlikte, kontrollü uygunluk çalışmaları, transgenik hattın sonraki nesiller boyunca devam edip etmeyeceğini belirlemek için bir gen sürücü programı gibi genetik olarak değiştirilmiş sivrisinek salınımlarını planlarken veya değerlendirirken önemli bir ilk adımdır. Örneğin, Hammond ve ark. Kadın doğurganlığı için gerekli genleri bozmayı amaçlayan bir gambiae CRISPR/Cas9 tabanlı gen sürücülerideğerlendirildi 8. Yazarlar, en az 25 nesil boyunca sürdürülen kafes çalışmaları sayesinde, sivrisineklerin CRISPR hedefli bölünmeyi bloke eden ve kadın doğurganlığını geri kazandıran gen güdümlü dirençli alellere maruz kaldığını buldular8. Modelleme çabaları, gen sürücüsü için heterozigot olan dişilerde doğurganlığın, simüle edilmiş koşullarda gen sürücü fiksasyonu üzerinde en dramatik etkilere sahip olduğunu göstermiştir8. Aynı doğrultuda, farklı promotörler altında veya farklı intergenik lokuslarda otonom gen sürücü kasetlerini eksprese etmek için tasarlanan Ae. aegypti (Higgs'in Beyaz Göz suşu, HWE), simüle edilmiş popülasyonlarda farklı gen sürücü fiksasyonu oranları sergiledi9. Yazarlar, MGDrivE modelleme10'u, ölçülen indel oluşum oranları, maternal etkiler ve laboratuvarda toplanan yaşam parametresi verileriyle birlikte kullanarak, sivrisinek uygunluğunun simüle edilmiş koşullarda gen sürücüsünün kalıcılığını en güçlü şekilde etkilediğinibuldular 9. Gen sürücü verimliliğini bozma olasılığı en yüksek olan uygunluk maliyetleri, içsel sürücünün kendisinden ziyade, somatik Cas9 (aşırı) ekspresyonuna veya özellikle heterozigotlarda hedeflenen genden kaynaklanabilir 11,12,13,14,15,16,17.

Önemi göz önüne alındığında, uygunluk, bir transgenik hattın sonraki nesiller boyunca devam etme yeteneği için önemli bir faktördür ve bir transgen ile ilişkili herhangi bir fizyolojik etki için bir gösterge olarak kullanılabilir. Örneğin, hedef dışı etkiler fitness maliyetleriyle ilişkilendirilebilir. Bu durumda, birkaç nesil boyunca transgenik bir çizginin geri çaprazlanması önerilir. Ayrıca, transgenik popülasyonun gerçek dünyada ne kadar iyi rekabet edebileceğini araştırmak için transgenik çizgiyi bir alan popülasyonunu yansıtan bir çizgiyle geçmek de gerekli olabilir. Uygunluk maliyetlerini karşılaştırılabilir olacak şekilde ölçmek için, bu el yazması, Ae. aegypti sivrisinekleri, transgenlerle ilişkili fitness maliyetlerine özel bir vurgu yaparak, bu tür çalışmaların daha kolay çoğaltılabilmesi için ortak yaşam öyküsü özelliklerini ölçmek için basit protokoller sağlar. Protokoller doğurganlık, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrünü içerir. Kanat uzunluğu ve alanının ölçülmesi de toraks uzunluğu18,19 ve kan unu boyutu, doğurganlık ve bağışıklık20,21 ile doğrudan bağlantılı olan vücut büyüklüğü ölçümleri ile ilişkili olduğu için bir kondisyon ölçümü olarak seçilmiştir. Uygunluğu değerlendirmenin birçok yolu olmasına rağmen, bu parametreler üreme başarısını yansıttıkları, ölçülmesi kolay oldukları ve literatürde yaygın olarak bildirildikleri için seçilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokol, daha önce doğrulanmış ve kurulmuş transgenik ve vahşi tip Ae için yazılmıştır. Transgenik Ae. aegypti üretimi hakkında daha fazla bilgi için, bakınız Kistler et al.22 ve Coates ve ark.23. Aşağıda özetlenen tüm deneyler standart Ae altında gerçekleştirilmiştir . aegypti yetiştirme prosedürleri. Sivrisinekler 28 °C'de% 75 -% 80 bağıl nem ve 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsü ile tutuldu. İstatistiksel amaçlar için sivrisinek lekesi başına en az 100 ayrı yumurta kağıdı şiddetle tavsiye edilir. Kapsamlı fitness çalışmalarının tamamlanması yaklaşık 3 ay sürer (Şekil 1).

1. Dişi sivrisineklerde doğurganlığın ölçülmesi

  1. Transgenik ve WT sivrisineklerini (aynı genetik geçmişe sahip ancak transgenden yoksun), standart yetiştirme koşullarını izleyerek yumurta kağıtlarını böcek içinde gece boyunca steril suya koyarak yumurtadan çıkarın. Birkaç damla (her biri yaklaşık 50 μL) öğütülmüş balık yemi (Tetramin) bulamacı (kabaca %30 a/h) sağlayarak larvaların ad libitum beslemesine izin verin. İlk instar larvaları yumurtadan çıktıktan 1 gün sonra tanınabilir. Larvaları kalabalık olmayacak şekilde daha büyük kaplara koyun, genellikle 1 L hacimde yaklaşık 250cm2 yüzey alanına sahip bir suda 100-150 larva yetiştirilebilir. Tetramin bulamacını bir besin kaynağı olarak sağlamaya devam edin ve larvaların ad libitum beslemesine izin verin. Yiyecek bulamacını ayrı damlacıklar halinde ekleyin, böylece larvalar için her zaman yeterli yiyecek bulunur ve böylece su bulanık görünmez. Larvalar her girişte boyut olarak artacak ve sonuçta larva tavalarında pupaya girecektir.
  2. Pupalar ortaya çıkmaya başladığında, yumurtadan çıktıktan ~ 5-6 gün sonra, aşağıda açıklandığı gibi, yetişkinlerin ortaya çıktıklarında (sonraki çiftleşme için) bakire olduklarından emin olmak için onları cinsiyetlerine göre ayırın.
    1. Pupaları cinsiyete göre sıralamak için, 3 mL plastik pipetleyiciler kullanarak pupaları temiz musluk suyu içeren küçük plastik kaplara toplayarak başlayın. Erkek pupalar daha küçük olma eğilimindedir ve dişilere kıyasla ilk önce ortaya çıkma eğilimindedir. İlk olarak, pupaları boyuta göre sıralayın ve ardından bu ilk ekranı morfolojiye göre onaylayın.
    2. Pupa'yı bir cam mikroskop lamına taşıyın ve fazla suyu bir mendille birlikte alın. Bu pupayı hareketsiz hale getirir. 2x-4x büyütmeli bir stereoskop altında, ince uçlu bir boya fırçası kullanarak pupa ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın.
    3. Genital lob şeklindeki farklılıklar için kuyruğu görsel olarak analiz edin (pupa karın segmentlerinin sonunda, küreklerin arkasında; Şekil 2). Dişiler, genital lobları aşan, kabaca bir taç veya vampir dişlere benzeyen sivri yüzgeçlere sahipken, erkek genital lobları yuvarlaktır ve bu sivri yapılara sahip değildir. Bkz. Carvalho ve ark.Ek rakamlar için 24.
  3. Erkek ve dişi pupaları ayrı su bardaklarına koyun ve uygun muhafazaya koyun, örneğin, her biri ~ 150 pupa içeren 0,2 m x 0,2 m (8 inç x 8 inç) beyaz organik kumaşla 1,9 L karton (1/2 galon veya 64 oz).
  4. Kafeslerin üzerine bir şeker ve su kaynağı sağlayın (örneğin, kuru üzüm ve gazlı bezle kaplı, iki lastik bantla sabitlenmiş su dolu bir kap). Kartonlara kalem büyüklüğünde bir delik açın ve lastik bir tıpa ile örtün, böylece kafesler ortaya çıktıkça kafeslere ek pupa eklenebilir.
  5. Erişkin çıkışından 3-5 gün sonra, kartonları ~ 2-5 dakika boyunca 4 ° C'ye yerleştirerek sivrisinekleri uyuşturun. Hala seğirebilseler de, sivrisinekler çoğunluk kartonun dibine düştüğünde yeterince uyuşturulur. Sivrisinekleri ~ 30 dk-1 saat boyunca buz üzerinde bir cam Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Sivrisinekleri çok uzun süre 4 ° C'de bırakmak sağlıklarını önemli ölçüde etkileyebilir, ancak 1 saate kadar buz üzerinde bırakıldıklarında herhangi bir etki bulamadık.
  6. WT veya transgenik GD1 veya GD29 (CRISPR / Cas-9 tabanlı gen sürücüsü) erkekleri, her biri ~ 150 sivrisinek içeren sivrisinek kartonlarına beş WT veya transgenik erkeğe bir WT dişisine oranlarda anestezi uygulanmış sivrisinekler ekleyerek, bakire WT (kontrol) dişilerle toplu halde çaprazlayın. Kafesleri erkek türüne göre etiketlediğinizden emin olun.
    NOT: Bu geçiş şeması, GD1 veya GD29 hemizigotların (yani, transgenin bir kopyasını barındıran sivrisinekler) uygunluğunu belirlemek içindir. Homozigot transgenik çizgilere uygunluğu belirlemek için, geçiş şeması, transgenik erkek ve dişilerin, WT erkek ve dişilerinin çaprazlamalarına kıyasla çiftleşmesine izin verilecek şekilde uyarlanabilir.
  7. 2-3 gün sonra, kafesin üstünde bir kan kaynağı sağlayarak dişileri standart yetiştirme uygulamalarına25 göre kanla besleyin. Besleme verimliliğini artırmak için şeker kaynağını 24 saat kan öncesi beslemeyi ve su kaynağını ~ 2-3 saat kan öncesi çıkarın.
  8. Kanla beslendikten sonra, sivrisinekleri adım 1.5'teki gibi 4 °C'ye yerleştirerek uyuşturun.
  9. Kanla beslenen (tamamen tıkanmış) dişileri, karınlarını büyüme açısından görsel olarak tarayarak beslenmemiş dişilerden ayırın. Beslenmemiş, kısmen beslenmiş ve erkekleri atın.
  10. Tıkanmış dişileri kendi kafeslerine geri koyun ve kafeslerin üzerine bir şeker ve su kaynağı sağlayın.
  11. 2-3 gün sonra, tek tek dişileri, kurşun kalemle önceden etiketlenmiş filtre kağıdı ile kaplı 50 mL'lik konik tüplere yerleştirin (Şekil 3). Konik boruları ağ ile örtün ve iki lastik bantla kapatın.
  12. Dişiler uyandığında, tüm tüpleri ~ 5 mL musluk suyu ile doldurun. Her konik tüpün üzerine küçük bir parça kuru üzüm veya şekere batırılmış pamuk topu yerleştirin. Dişileri böcekte 1-2 gün bekletin ve yumurtlamalarına izin verin.
  13. 1-2 gün sonra, her bir konik tüpü boşaltın ve sivrisinekleri 4 ° C'ye yerleştirerek uyuşturun. Hızlı işleme için, her bir konik tüpten suyu boşaltmak için ağa bastırılmış 3 mL'lik bir plastik pipetörün ucunu kullanın. Tüpleri ters çevirin ve boşaltmak için bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin. 50 mL'lik konik tüpleri bir tüp tutucuya yerleştirin ve rafı 4 °C'ye yerleştirin.
  14. Yumurta kağıdını toplayın ve her kağıda yumurta sayısını sayın. Yumurtlamayan dişileri 0 olarak sayın ve analize dahil edin. Ortalama doğurganlığı, her bir kağıtta sayılan toplam yumurta sayısının, taranan toplam dişi sayısına bölünmesiyle hesaplayın.
    NOT: Tek tek yumurta kağıtlarının dijital resimleri, sayım onayı için görsel bir kayıt görevi görebilir (Şekil 4).
  15. Yumurta kağıtlarını kurutun ve tekrar böceğin içine yerleştirin. Optimum kuluçka için yumurta kağıtlarının en az 3-5 gün kuruması tavsiye edilir25.

2. Kanat uzunluğunun, alanının ve merkez boyutunun ölçülmesi

  1. Sivrisinek kafeslerini yaklaşık 15 dakika boyunca -20 ° C'ye yerleştirerek tamamlanan doğurganlık çalışmasından en az 25 WT veya transgenik yaşa uygun kanla beslenen dişileri dondurun.
    NOT: Daha uzun süre donmayın ve kabı sallamayın veya düşürmeyin, çünkü bu, kanatların sivrisineklerden düşmesine neden olabilir.
  2. Her sivrisineğin sol kanadını inceleyin, kanadın ve göğüs kafesinin eklemini eksize edin, kanadın tamamını çıkarın, aşağıdaki protokolü izleyin.
    1. Bir elinde, sivrisinekleri forseps ile tutun, kanatların altındaki göğüs bölgesini kavrayın.
    2. Öte yandan, başka bir forseps çifti kullanarak, her sivrisineğin sol kanadını inceleyin, kanadı çıkarmak için hafif bir baskı kullanarak kanadın eklemini ve göğüs kısmını çıkarın, kanat damarlarını yırtmadan kanadın tamamını çıkarın.
  3. Forseps kullanarak, kanadı düz bir şekilde uzanarak bir cam slayt üzerine yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, slayttaki kanada% 70 etanol içeren 15 mL'lik bir stok çözeltisinden bir damla ve bir damla bulaşık deterjanı ekleyin.
  4. Lameli bir damla% 80 gliserol ekleyin ve etanol-sabun çözeltisinde kanadın üzerine yerleştirin.
  5. 65 mm lensli bir kamera kullanarak kızaklara monte edilmiş kanatları fotoğraflayın (7D-65 mm-1x; yakınlaştırma = 1, 200, 6.3, ISO = 100). Piksel/mm ölçeğine dikkat edin ve bunun tüm görüntüler için aynı kaldığından emin olun. Birden fazla kanat birlikte görüntüleniyorsa, fotoğrafları tek tek kanatlara kırpın ve her fotoğrafa ölçek çubukları ekleyin. Görüntüleri LZW sıkıştırmalı TIFF formatında kaydedin ve her görüntü ayrı kanat için tüm bilgilerle açıkça etiketlendi.
    NOT: Çalışmada fotoğrafı çekilen her kanat için ayarlar aynı kalırsa ve piksel/mm ölçeği aynı kalırsa, kanatlar farklı bir kamera ve büyütme kullanılarak veya diğer çalışmalar için mikroskoba bağlı bir kamera ile fotoğraflanabilir. Ölçümler belirlenirken piksel/mm oranı dikkate alınacaktır.
  6. Ücretsiz, morfometrik görüntü işleme yazılımları olan tpsUtil ve tpsDig'i indirin. Yazılım hakkında daha ayrıntılı bilgi için Rohlf 26,27'ye bakın.
  7. Dijitalleştirmenin bir sonraki adımı için kanat fotoğraflarının bir TPS dosyasını oluşturmak için tpsUtil kullanarak kanatları dijitalleştirin.
    1. Bunu yapmak için tpsUtil'i açın ve işlem altında Görüntülerden tps dosyası oluştur'u seçin. Giriş'e tıklayın, tek tek kanat görüntülerini içeren dosyayı seçin ve ardından bu klasörü seçmek için herhangi bir görüntüyü seçin. Çıktıya tıklayın ve oluşturulacak dosyayı .tps biçiminde adlandırın. Kaydet'i tıklayın.
    2. Ardından, eylemler altında, Kurulum'a tıklayın. Tümünü dahil et'i seçin, oluştur'a tıklayın ve açılır kutuyu kapatın. İşlem altında, şimdi Numuneleri rastgele sırala'yı seçin. Girişe tıklayın ve yeni oluşturulan .tps dosyasını seçin. Çıktı'ya tıklayın, .tps dosyasını, örneklerin rastgele seçildiği dosya sürümü olduğunu belirtmek için yeniden adlandırın ve kaydet'e tıklayın. Ardından, Oluştur'u tıklayın. tpsUtil programını kapatın.
      NOT: Ölçüm hatasını azaltmak için, kanat fotoğrafları çoğaltılabilir ve teknik bir kopya için iki kez kullanılabilir.
  8. Yer işaretleri için iki boyutlu Kartezyen koordinatları tanımlamak için tpsDig yazılımını kullanın. Giriş altında, adım 2.7'de oluşturulan .tps dosyasını seçin. Ölçeği adım 2.5'te belirlenen ölçeğe ayarlayın; Seçenekler'in altında Görüntü Araçları'nı seçin ve ardından Ölç'e tıklayın.
  9. Yer işaretlerini sayısallaştırmayı temsil eden mavi artı işareti simgesine tıklayarak görüntüye yer işaretleri ekleyin ve ardından Şekil 5'te Yer İşareti 1'den Yer İşareti 14'e kadar sırayla gösterilen kanat bağlantılarına tıklayın.
    NOT: Bu yer işaretleri, daha önce kanat yer işareti sayısallaştırma ve analizinde19 kullanıldıkları, birçok örnekte kanat damarlarının birleşim yerlerinde bulunmalarının kolay olduğu ve kanadın boyutunu ve şeklini yakalamak için yeterli kanat yer işareti sağladıkları için seçilmiştir.
  10. Yer işaretlerini işaretlerken, eksik veya belirsiz yer işaretlerini (kanat katlanması veya hasar nedeniyle) analizden çıkarmak ve yer işaretlerinin doğru sırasını korumak için M simgesini tıklayarak tpsDig'de eksik olarak işaretleyin. Dosyadaki tüm görüntüler tamamlanana kadar sonraki görüntüler için yer işareti sayısallaştırmayı tekrarlamak için sağa bakan kırmızı oka tıklayın. Dosyayı kaydedin ve kapatın.
    NOT: Kanat uzunluğu, alanı ve boyutu hesaplamalarının doğru olması için yer işaretlerinin kanat görüntüsüne her görüntü için doğru sırayla eklenmesi gerekir.
  11. Ek Dosya 1'de sağlanan R betiğini kullanarak kanat uzunluğunu ve alanını hesaplayın, .tps dosya konumunu ve görüntü ölçeğini denemeye göre değiştirin.
  12. Şekilden istatistiksel olarak bağımsız bir boyut ölçüsü olan kanat merkezi boyutunu hesaplayın vekanat 28,29'un merkez noktasından her bir yer işaretinin kare mesafelerinin toplamının karekökü olarak tanımlanır.
  13. Şekil dışı varyasyonu kaldırmak için genelleştirilmiş bir procrustes hizalaması kullanın ve tüm yer işaretlerinin sağlam olduğu kanatları kullanarak ortalama yer işareti koordinatlarını çizin. Hem kanat merkezi boyutu hem de ortalama yer işareti belirlemesi için, Ek Dosya 2'de sağlanan R betiğini kullanın ve deneye göre .tps dosya konumunu ve görüntü ölçeğini değiştirin.

3. Yumurta verimliliğinin değerlendirilmesi

  1. Tek dişilerden (1. adımda toplanan) toplanan kağıtlardan tek tek F1 yumurtaları, ~100 mL taze sterilize edilmiş deiyonize su içeren polipropilen berrak şarküteri kaplarına yumurtadan çıkarın. Ad libitum besleme için iki veya üç damla öğütülmüş balık yemi bulamacı ekleyin. Kapların üst kısımlarını ağ veya organik ile hizalayın ve bir lastik bantla sabitleyin.
  2. Yumurtadan çıktıktan 2-3 gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve bir kapak veya ağ ile kapatılmış yeni bir kaba koyarak ve böceğin içinde bırakarak gece boyunca kurumaya bırakın.
  3. Yumurta kağıtlarını, tekrar su kabına koyarak, başlangıçta yumurtadan çıktıkları kaplarda yeniden çatlatın.
    NOT: Yumurta kağıtlarının kurutulması ve yeniden taranması, kuluçka verimliliğini büyük ölçüde artırır. Bu, diğer sivrisinek türleri için gerekli olmayabilir.
  4. İlk yumurtadan çıktıktan 3-5 gün sonra, larvaları (2. ila 4. instar) transgenik bir belirteç (varsa; Şekil 6). Birkaç larvayı aynı anda floresan mikroskop altında, kağıt havlularla kaplı bir organik veya ağın üzerine yerleştirilmiş bir filtre kağıdına yerleştirerek inceleyin. Kağıt havlular fazla suyu emer, böylece filtre kağıdı hareketsiz hale getirilmiş larvaları taramak ve manipüle etmek için kullanılabilir.
  5. Pozitif veya negatif transgenik larva sayısını kaydedin. Negatif larvaları atın.
  6. Optimum gelişme sürelerini sağlamak için larva suyunu temizleyin. Bunu yapmak için larvaları küçük bir kaba pipetleyin, kirli suyu atın ve taze musluk suyu ile değiştirin Pozitif larvaları ekleyin ve yeterli miktarda öğütülmüş balık yemi bulamacının mevcut olduğundan emin olun.
  7. Doğurganlığı, transgenik veya kontrol larvalarının sayısının toplam yumurta sayısına bölünmesiyle hesaplayın.

4. Pupalarda cinsiyet oranının belirlenmesi

  1. Yumurtadan çıktıktan 14 gün sonrasına kadar, erkek ve dişi pupa sayısını toplamaya ve kaydetmeye devam edin (adım 1.2.3'te açıklandığı gibi). Dişiler veya erkekler, cinsiyete göre 1,9 L'lik kaplarda bulunan küçük kaplara toplanabilir.
  2. Cinsiyet oranını belirlemek için, her bir yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan F1 dişi sayısını veya F1 erkek sayısını ekleyin. Bu sayıyı, tek bir dişiden üretilen aynı sivrisinek hattı için toplanan toplam pupa sayısına bölün.

5. Larva canlılığının belirlenmesi

  1. Larva canlılığını belirlemek için, her bir yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan toplam pupa sayısını ekleyin.
  2. Bu sayıyı, 3. adımda sayılan aynı çizgi için her bir yetişkin dişi sivrisinek başına sayılan toplam larva sayısına bölün.

6. Larva-pupa gelişim zamanının belirlenmesi

  1. Larvalardan pupalara gelişimini belirlemek için, larva sayısını ve hat başına pupa sayısını günlük olarak takip edin.
  2. Larvadan pupaya gelişimini, yumurtadan çıktıktan sonra pupa gelişimine kadar geçen ortalama süre olarak hesaplayın.

7. Erkek katkı payının belirlenmesi

  1. Yaş uyumlu erkekleri kullanarak, yetişkin bakire transgenik erkek sivrisinekleri buz üzerinde ve ayrıca yetişkin bakire erkek ve dişi kontrol sivrisineklerini uyuşturun.
  2. 64 oz kartona 50 transgenik veya 50 kontrol erkeği (yaşa uygun) 100 kontrol dişisi ekleyerek transgenik veya kontrol dişi erkek yetişkinleri kontrol dişi yetişkinlerle çaprazlayın, böylece 100 dişi ile toplam 50 erkek olur (iki kontrol dişi: bir kontrol veya transgenik erkek). Hangi kartonda transgenik erkeklerde ve hangi kartonda kontrol erkekleri bulunduğunu etiketlediğinizden emin olun.
  3. Çiftleşmenin 2-3 gün gerçekleşmesine izin verin. Bu süreden sonra, standart yetiştirme uygulamalarını izleyerek sivrisineklere kan unu verin.
  4. Kan beslemesinden üç gün sonra, tamamen tıkanmış dişileri, adım 1'de (doğurganlık testi) açıklandığı gibi, önceden etiketlenmiş beyaz filtre kağıdı ile kaplı 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Beslenmeyen dişileri atın veya ertesi gün onlara başka bir kan yemeği verin. Tüm tüpleri ~ 5 mL musluk suyu ile doldurun. Her bir konik borunun üzerine yerleştirilen ağın üzerine küçük bir parça kuru üzüm yerleştirin.
  5. Dişileri böcekte 1-2 gün bekletin ve yumurtlamalarına izin verin. Yumurta kağıtlarını kan yemeğinden sonra 4-5 gün boyunca yumurta kağıtlarını görsel olarak inceleyin. Yumurtlama oranlarını artırmak için dişilerin yumurtlamaları için bir gün daha izin verin.
  6. Yumurta kağıtlarını toplamak için suyu boşaltın ve daha önce tarif edildiği gibi 4 °C'de konik tüpler yerleştirerek dişileri uyuşturun. Dişi sivrisinekleri% 70 etanol içine koyarak atın.
  7. Kağıtları kuruması için en az 5 gün böcekteki tüplerde bırakın. Kağıtları çıkarmak için forseps kullanın ve kuluçka için ~ 100 mL taze sterilize edilmiş deiyonize su içeren polipropilen şeffaf şarküteri kaplarına yerleştirin. Ad libitum besleme için 2-3 damla öğütülmüş balık yemi bulamacı ekleyin. Kapların üst kısımlarını bir lastik bantla sabitlenmiş ağ veya organik ile hizalayın.
  8. Yumurtadan çıktıktan 2-3 gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve bir kapak veya ağ ile kapatılmış yeni bir kaba koyarak ve tekrar böceğin içine yerleştirerek gece boyunca kurumaya bırakın.
  9. Yumurta kağıtlarını tekrar su kabına koyarak aynı kaplarda tekrar çatlatın.
  10. İlk yumurtadan çıktıktan 3-5 gün sonra, larvaları (2. ila 4. inç) transgenik bir belirteç (varsa) açısından görsel olarak inceleyin. Erkek katkısını,F2 transgenik larva sayısının sivrisinek hattı başına toplam larva sayısına bölünmesiyle hesaplayın.

8. Sivrisinek ömrünün belirlenmesi

  1. 50 erkek ve 50 dişi WT veya transgenik yaşa uygun kanla beslenmeyen sivrisinekleri uygun bir muhafazaya aktarın. Deney ilerledikçe sivrisineklere kolay erişim ve manipülasyon için üst açıklığı külotlu hortumla kaplanmış, bükülmüş ve düğümlenmiş 64 oz kartonlar kullanın (Şekil 7).
    NOT: İstatistiksel amaçlar için bunun üç nüsha halinde yapılması önerilir.
  2. Şeker ve su kaynağı sağlayın. Burada kuru üzüm ve gazlı bezle kaplı, iki lastik bantla sabitlenmiş su dolu bir kap kullanıldı.
  3. Her gün ölü erkek ve dişi sivrisineklerin sayısını takip edin. Uzun ömürlülüğü, sivrisineklerin kafesler boyunca ölmeden önce geçen ortalama gün sayısı olarak hesaplayın, bilgilendirici olmayan nedenlerden ölen sivrisinekleri atlayın (ezilme veya şekerde boğulma gibi sivrisinek ömrüne bağlı olmayan nedenler) ve çalışmanın sonunda hala hayatta olan sivrisinekleri atlayın.
    NOT: Hayatta kalma, t zamanına kadar hayatta kalma olasılığı veya S(t) = Pr(T>t) fonksiyonu olarak tanımlanır. Medyan sağkalım, hayatta kalma olasılığının 0.5 veya T_0.5 = S-1 x 0.5 olduğu zamandır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü takiben, iki sivrisinek hattının uygunluğu değerlendirildi: (1) Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) tükürük proteininden CRISPR / Cas9 aracılı nakavt ve (2) Ae. otonom CRISPR / Cas9 aracılı gen sürücülerini ifade eden aegypti hatları9. İlki durumunda, D7L1 genine özgü sgRNA'larla embriyoların mikroenjekte edilmesinden sonra bozulmayı oluşturmak için homolog olmayan uç birleştirme yolundan (NHEJ) yararlanılarak homozigot bir D7L1 nakavt hattı oluşturulmuştu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ae. aegypti uygunluk çalışmaları, bu yazıda tartışıldığı gibi, transgenik kargo (örneğin, gen sürücü elemanları) veya gen nakavtları ile ilişkili uygunluk maliyetlerini değerlendirmek için genellikle laboratuvarda gerçekleştirilir; bununla birlikte, bu çalışmalar çeşitli amaçlar için yapılabilir - Wolbachia ile enfekte30,31, böcek ilacına dirençli32,33 veya arbovirüs ile enfekte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, bu protokole verdikleri destek için Missouri Üniversitesi'nden Dr. Bill Reid ve Alexander Franz'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca NIH / NIAID'den Dr. Benjamin Krajacich'e R analizine verdiği destek için teşekkür eder. Bu çalışma NIH, hibe numarası R01 AI130085 (KEO) ve NIH/NIAID Intramural Araştırma Programı Bölümü AI001246 (EC) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 oz. yarı saydam plastik sufle kaplarıWebstaurantStore301100PC
2 oz. yarı saydam polistiren sufle kaplarıWebstaurantStore760P200N
3 mL plastik pipetleyiciler Kornin357524
50 mL konik tüplerHerhangi bir marka
64 oz. beyaz çift poli kaplamalı kağıt gıda bardağıWebstaurantStore999SOUP64WBsivrisinek muhafazası için
65 mm lens CanonMP-E 65mm f/2.8 1-5x makro fotoğrafCanon makro fotoğraf MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom = 1, 200, 6.3, ISO = 100; kanatları veya yumurta kağıtlarını fotoğraflamak için, diğer kameralar muhtemelen yeterli olsa da
Aedes aegypti  sivrisineklerdeBEI yumurta olarak çoklu suşlar mevcuttur
Yapay membran besleyicilerhttps://lillieglassblowers.com/Meduim membran besleyici, Özel yapım, 33mmChemglass da sunuyor, ancak boyutlar bizim için yanlış. Bizimki yaklaşık 3 cm?
ATPMP BiyomedikalICN15026605Herhangi bir kaliteli ATP, 10mM filtre steril alikotları -20'de
Kuluçka için suyu sterilize etmek içinotoklav
Canon EOS 7D fotoğraf makinesi Canon3814B004kanatları veya yumurta kağıtlarını fotoğraflamak için, ancak diğer kameralar muhtemelen
defibrine koyun kanı için yeterlidir Colorado Serum A.Ş.60 ml, her 2 haftada birhttps://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Çift Deveboynu Mikroskop AydınlatıcıDolan Jenner Fiber-Lite 180181-1 Sistem
Etanol
ForsepsDumont5SF
Gazlı Bezomnisorb ii4 "dokunmamış süngerler
cam mikroskop slaytFisher Scientific12-544-2
Cam Petri kapları, 100 > 15 mmVWR75845-546sivrisinekleri buz üzerinde uyuşturmak/manipüle etmek için
Domuzların bağırsağıherhangi bir Şarküteri, 50 ml konik Buz
kovası
Kimwipe'de -20'de ~ 4X12 "'lik küçük alikotlarda saklar, böler, yıkar ve saklarızFisher Scientific06-666A
Transgenik sivrisinekleri taramak içinStereoZoom mikroskobu
Boya fırçasıAIT sentetik fırça larvaları/pupaları manipüle etmek için10-0 numara
Külotlu hortumWalmartL'eggs Her gün  Kadın Naylon Artı < / güçlü>Diz Yüksekleri Dik Parmak, 16 çift (artı kartona uyar)
KalemlerHerhangi bir marka
Kartonların 2 derece depolanması için plastik kaplarWalmartSterilite 58 Qt Saklama Kutusu Şeffaf Taban Beyaz Kapak 8'li Set
Larva yetiştirmek için plastik kaplarWalmartSterilite 28 Qt. Saklama Kutusu Plastik, Beyaz,
Larvaların kuluçkalanması için 10 Plastik kapWalmartSterilite 6 Qt. Saklama Kutusu Plastik, Beyaz
polipropilen şeffaf şarküteri kapları WebstaurantMağazası  127DM12BULK12 oz veya gerekirse daha büyük (127RD16BULK) için 16 oz
Lastik bantlarOffice Max #100736/#909606 /#377741512", #64 ve #10
Sivrisinek muhafazası içinkauçuk tıpaVWR217-0515
Küp şeker veya kuru
Tetramin pul yemTetramin16106
tpsDigStony Brook MorphometricsÇevrimiçi olarak dağıtılan ücretsiz bir morfometrik görüntü işleme yazılımı https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtilStony Brook MorphometricsÇevrimiçi olarak dağıtılan ücretsiz bir morfometrik görüntü işleme yazılımı şu adreste mevcuttur: https://www.sbmorphometrics.org/
Beyaz organze kumaş 8" & times; 8"FabricWholesale.com 4491676Joann Casa Collection Organze Kumaş by Casa Collection 
Whitman Grade 1 Kalitatif Filtre kağıdı Whitman1001-824. Beyaz renk, siyah yumurtaları görmeyi kolaylaştırır.
Toplu olarak satın aldığımız Leica GZ4 (varsa) (Amazon) seti üzüm gibi şeker kaynağı adresinde mevcuttur Yumurta kağıtları için

Kaynaklar

  1. Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
  2. Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
  3. Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
  4. Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
  5. Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
  6. Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
  7. Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
  8. Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
  9. Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
  10. Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
  11. Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
  12. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
  13. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  14. Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
  15. Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
  16. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
  17. Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
  18. Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
  19. Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
  20. Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
  21. Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
  24. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
  25. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
  26. Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
  27. Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
  28. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
  29. Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
  30. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  31. Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
  32. Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
  33. Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
  34. Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
  35. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  36. David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
  37. Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
  38. Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
  39. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
  40. Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
  41. Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
  42. Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
  43. Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Transgenik SivrisineklerYaşam Öyküsü ÖzellikleriGen SürücüsüKanat MorfometrisiDoğurganlık ÖlçümüLarval CanlılıkCinsiyet Oranı AnaliziErişkin Yaşam Süresi
Transgenik Aedes aegypti Sivrisineklerinde Kondisyon Maliyetlerinin Ölçülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.