Yöntem makalesi

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

DOI:

10.3791/65172

⸱

7 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir 1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.

Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler3. Kemik ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksika) tavsiyelerine dayanarak, Meksika Hayvan Bakımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş, onaylanmış ve tescil edilmiştir.

1. Sıçanlardan yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılması

  1. 20 mL steril 1x fosfat tamponlu salin-antibiyotik antimikotik (PBS-AA) çözeltisi (1x PBS, gentamisin [20 μg / mL] ve amfoterisin [0.5 μg ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu, 3-4 aylık ve vücut ağırlığı 401 ± 41 g (geometrik ortalama ± SD) olan yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından elde edildi. Ortalama 3.8 g epididim ve perirenal yağ dokusu değeri, 15 deneysel ekstraksiyonun analizine karşılık geldi. 24 saatlik kültürden sonra, hücre popülasyonları plastik yüzeye yapışmış kaldı ve heterojen bir morfoloji sergiledi. İlk pasaj, toplam sekiz deneyde 1.4 ± 0.6 x 106 hücre verimi ile 8 ± 2 günde gerçekleştirildi. Doğrudan parlak alan gözlemi (Şekil 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC'lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC'leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC'leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC'lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Meksika Sosyal Güvenlik Enstitüsü (IMSS) ve Meksika Çocuk Hastanesi, Federico Gomez (HIMFG) ve IMSS Araştırma Koordinasyonu'nun Bioterio personeline bu projenin yürütülmesine verilen destek için minnettardır. AOC (815290) bursu için Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'ne ve görsel-işitsel materyaldeki teknik destek için Antonio Duarte Reyes'e teşekkür ederiz.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amfoterisin BHyCloneSV30078.01
Analitik dengeSartoriusAX224
Antikor anti-CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antikor anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antikor anti-C63Santa CruzSc-5275
Antikor anti-Endoglin / CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antikor anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antikor Keçi anti-rabitt IgG (H + L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antikor Eşek anti-keçi IgG (H + L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antikor anti-fare IgG FITC konjuge keçi F (ab&akut;)Ar-Ge Sistemleri.No. F103B
Şişe Üstü Filtre SterilCORNING10718003
Hücre ve Doku Kültürü ŞişeleriBIOFIL170718-312B
Hücre sayma odası kızaklı Hücre Sayacı Parlak Çizgili HemasitometreSIGMA Aldrich Z359629
Hücre kuyuları: Kapaklı 6 kuyuCORNING25810
Santrifüj konik tüplerHeTTICHROTANA460R
Santrifüj eppendorf tüpleriFischer ScientificM0018242_44797
Kollajen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Yaşam Bilimleri43112
Kültür tüpleriGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0 BeckmanCoulterÜcretsiz sürüm
CytoFlex LX sitometreBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 BoyaTermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin sarımsıHycel300
Etanol %96Baker64-17-5
Falcon tüpleri 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tüpleri 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Sığır Serumu CORNING35-010-CV
JelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamisinGIBCO15750045
Gliserin-Yüksek SaflıktaHerschi Trading 56-81-5
HematoksilenAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2< / sub> İnkübatör Thermo Sc.
Ketamin Pet (Ketamin clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamin GIBCO / Thermo Sc. 25030-081
LSM yazılımı Zen 2009 V5.5Ücretsiz sürüm
Biyolojik Güvenlik Kabini Sınıf IINuAire12082100801
Epifloresan mikroskop Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Ters mikroskop Olympus CK40CK40-G100
Esansiyel olmayan amino asitler 100XGIBCO11140050
Mikro tüpler 2 mL Sarstedt 72695400
Mikro tüpler 1,5 mLSarstedt 72706400
Mikropipetler 0.2-2 & mu; LFinnpipetteE97743
Mikropipetler 2-20 μ LFinnpipetteF54167
Mikropipetler 20-200 μ LFinnpipetteG32419
Mikropipetler 100-1000 μ LFinnpipette FJ39895
Azot tankı sıvısıTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehitSIGMA AldrichSLBC3029V
Penisilin / Streptomisin GIBCO / Thermo Sc.
Petri kabı Hücre kültürüCORNING Inc480167
Pipet UçlarıAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodyum)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potasyum klorür J.T.Baker7447-40-7
Potasyum Fosfat DibazikJ.T Baker2139900
S1 Pipet DolgularıThermo Sc9531
Serolojik pipet 5 mLPYREXL010005
Serolojik pipet 10 mLPYREXL010010
Sodyum bikarbonatJ.T Baker144-55-8
Sodyum klorür J.T.Baker15368426
Sodyum Fosfat Dibazik SusuzJ.T Baker7558-79-4
Sodyum piruvatGIBCO BRL11840-048
Şırınga Filtresi SterilCORNING431222
SpektrofotometrePerkinElmer Lambda 25L6020060
Titre plakası çalkalayıcıLAB-LINE1250
Transfer pipetleriSamco/Thermo Sc728NL
Tripan Mavisi lekeGIBCO1198566
Domuz Pankreasından TripsinSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Evrensel Bloke Edici Reaktif 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet %2 (ksilazin hidroklorür)Pet ' s İlaçQ-7972-025
5011604715140122

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k H cre zolasyonuStromal Vask ler FraksiyonAk Sitometrisimm nofloresan AnalizAdipojenik DiferansiyasyonH cre Y zey MarkerlarRejeneratif T p

İlgili makaleler