Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Angelman Sendromlu Bir Fare Modelinin Davranışsal Karakterizasyonu

4.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65182

⸱

20 Ekim 2023

 ,  , 
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, bir Angelman sendromlu fare modelini doğrulamak için bir dizi yüksek oranda tekrarlanabilir davranış testi sunmaktadır.

Özet

Bu makale, yerleşik bir fare AS'de Angelman sendromu (AS) benzeri fenotipleri karakterize etmek için mevcut olan bir dizi davranışsal testi açıklamaktadır. Hayvan motor bozukluklarını tespit etmek ve karakterize etmek için rotarod öğrenme paradigmasını, ayrıntılı yürüyüş analizini ve yuva kurma testini kullanıyoruz. Açık alanda hayvan duygusallığını ve yükseltilmiş artı labirent testlerinde ve ayrıca kuyruk süspansiyon testinde etkiyi test ediyoruz. AS fareleri açık alan testinde test edildiğinde, motor işlev bozuklukları labirentteki fare davranışını etkilediğinden ve aktivite puanlarını değiştirdiğinden sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.

Sunulan davranış testlerinin tekrarlanabilirliği ve etkinliği, farklı nakavt varyantlarına sahip birkaç bağımsız Uba3a fare hattında zaten doğrulanmıştır ve bu test setini AS araştırmasında mükemmel bir doğrulama aracı olarak oluşturmuştur. İlgili yapıya ve yüz geçerliliğine sahip modeller, hastalığın patofizyolojisini aydınlatmak ve nedensel tedavilerin geliştirilmesini sağlamak için daha fazla araştırmayı garanti edecektir.

Giriş

Angelman sendromu (AS) nadir görülen nörogelişimsel bir hastalıktır. AS'nin en yaygın genetik kökeni, hastaların yaklaşık% 74'ünde bulunan maternal kaynaklı kromozomun 15q11-q13 bölgesinin büyük bir silinmesidir1. Bu bölgenin silinmesi, bir E3 ubikitin ligazını kodlayan AS'nin ana etken geni olan UBE3A'nın kaybına neden olur. Nöronlardaki UBE3A geninin baba aleli, damgalama olarak bilinen bir süreçte susturulur. Sonuç olarak, genin baba tarafından damgalanması, merkezi sinir sisteminde (CNS) yalnızca maternal ekspresyona izin verir2. Bu nedenle, maternal kaynaklı kromozomdan UBE3A gen delesyonu AS semptomlarının gelişmesine yol açar. İnsanlarda AS, tüm gelişim aşamaları boyunca devam eden ve etkilenen bireylerde ciddi zayıflatıcı semptomlarla sonuçlanan gelişimsel gerilik ile yaklaşık 6 aylıkken ortaya çıkar 3,4. Bozukluğun temel semptomları, sarsıntılı ataksik yürüyüş, ciddi konuşma bozukluğu ve zihinsel engellilik dahil olmak üzere ince ve kaba motor becerilerin eksikliğini içerir. AS hastalarının yaklaşık% 80'i uyku bozuklukları ve epilepsiden de muzdariptir. Bugüne kadar mevcut olan tek tedavi, epileptik nöbetleri azaltan ve uyku kalitesini artıran semptomatik ilaçlardır1. Bu nedenle, rafine fenotipleme analizinin yanı sıra tekrarlanabilir davranışsal fenotiplere sahip sağlam hayvan modellerinin geliştirilmesi, bozukluğun patofizyolojik mekanizmalarını aydınlatmak ve etkili ilaçları ve tedavileri keşfetmek için gerekli olacaktır.

CNS'yi etkileyen insan bozukluğunun karmaşıklığı, model organizmaların karşılaştırılabilir bir genom, fizyoloji ve davranışa sahip olmasını gerektirir. Fareler, kısa üreme döngüleri, küçük boyutları ve göreceli DNA modifikasyonu kolaylığı nedeniyle model organizma olarak popülerdir. 1984'te Paul Willner, üç temel hastalık modeli doğrulama kriteri önerdi: modelin değerini belirlemek için kullanılan yapı, yüz ve öngörücü geçerlilik5. Basitçe, yapı geçerliliği, bozukluğun gelişiminden sorumlu biyolojik mekanizmaları yansıtır, yüz geçerliliği semptomlarını özetler ve öngörücü geçerlilik, terapötik ilaçlara model yanıtını tanımlar.

Yukarıdaki ilkelere bağlı kalmak için, AS model fareler oluşturmak için UBE3A geni de dahil olmak üzere maternal 15q11.2-13q lokusunun büyük bir delesyonunu seçtik. CRISPR / Cas9 tekniğini, tüm UBE3A genini kapsayan, genin hem kodlayan hem de kodlamayan unsurlarını kapsayan, C57BL / 6N arka planındanfarelerde 76.225 bp uzunluğunda bir bölgeyi silmek için kullandık 6. Daha sonra UBE3A+/− heterozigot fareler elde etmek için hayvanları yetiştirdik. Modelin yüz doğrulaması için, UBE3A+/- döllerini (C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph olarak adlandırılan suş) elde etmek için UBE3A+/− dişilerden ve vahşi tip erkeklerden elde edilen hayvanları kullandık ve daha sonra UBE3A mGenedel/+ olarak atandık ve yavruları kontrol ettik. İnce ve kaba motor becerilerini, duygusallıklarını ve temel AS semptomlarını özetlemek için duygulanımlarını test ettik. Önceki bir makalede, AS hastaları da zihinsel engellilikten muzdarip olduğu için hayvanların bilişsel işlevlerini de değerlendirdik6. Bununla birlikte, UBE3AmGenedel / + farelerinde, belki de test7 sırasında hayvanların genç yaşı nedeniyle bilişsel bozukluk bulamadık. Daha sonra, yaklaşık 18 haftalık olan yaşlı hayvanların incelenmesi, yer tercihi paradigmasında tersine öğrenme sırasında davranışsal esneklikte bir eksiklik olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu analiz için kullanılan ekipmanın karmaşıklığı ayrı bir metodolojik modül gerektirir ve burada yer almaz.

Burada sunulan davranış testleri, yüksek prediktif değerleri ve yeterli yapı geçerliliğisayesinde genetik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan fenotipleme araçlarına aittir 8,9,10. Bu testleri, insan hastalığının temel semptomlarını tekrarlanabilir, yaştan bağımsız bir şekilde özetleyerek bir fare AS modelini doğrulamak için kullandık. Hayvanın duygusallığı, yükseltilmiş artı labirent ve açık alan testlerinde değerlendirildi. Bu testlerin her ikisi de, hayvanların yiyecek, barınak veya çiftleşme fırsatları aramak için yeni bir ortam keşfederken aynı zamanda anksiyojenik bölmelerden kaçındığı yaklaşma-kaçınma çatışmasına dayanmaktadır11. Ek olarak, açık alan testi bir farenin lokomotor aktivitesini test etmek için kullanılır8. Kuyruk süspansiyon testi, fare nakavt modellerinde yeni antidepresan ilaçları veya depresif benzeri fenotipleri taramak için depresyon araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır12. Bu test, hayvanların kaçınılmaz bir durumda zaman içinde geliştirdikleri umutsuzluğu değerlendirir. Motor öğrenme ve ayrıntılı yürüme özellikleri sırasıyla rotarod ve DigiGait'te belirlendi. Hızlanan çubuk üzerindeki hayvan dayanıklılığı, denge ve hareket koordinasyon becerilerini karakterize ederken, bir farenin adım modellerinin ayrıntılı analizi, birçok nörojeneratif hareket bozukluğuna bağlı nöromüsküler bozuklukların hassas bir değerlendirmesidir13,14,15. Yuva parçalama testi, kemirgenlerde dürtüsel davranışı tespit etmek için standart metodolojinin bir parçasıdır ve doğal kemirgen oluşturma davranışını kullandığından, hayvanın refahınıgösterir 16,17.

Deney gruplarının büyüklüğü, 3R kuralı taleplerini karşılamak ve koloni ıslah performansının verimli kullanımı için bir uzlaşmanın sonucuydu. Bununla birlikte, istatistiksel güç elde etmek için, yeterli miktarda üreme çiftinin kurulması nedeniyle grupların en az 10 bireyi vardı. Ne yazık ki, üreme performansı her zaman yeterli sayıda hayvanla sonuçlanmadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar ve deneyler etik incelemeden geçirilmiş ve 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma, Çek Hayvan Refahı Merkez Komisyonu tarafından onaylandı. Fareler ayrı ayrı havalandırılan kafeslere yerleştirildi ve 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ile 22 ± 2 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta tutuldu. Farelere fare yemi ve su ad libitum verildi. Fareler, kafes başına üç ila altı hayvandan oluşan gruplar halinde barındırıldı. Testten önce tartım dışında herhangi bir işlem gerçekleştirilmemiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.

1. Test öncesi ve sırasında göz önünde bulundurulması gereken genel hususlar

NOT: Açıklık ve anlaşılırlık adına, bireysel testlerin açıklamasından önce genel yorumlar sunulmuştur. Bu, bir muhafaza odasında gerçekleştirilen ve herhangi bir deney ekipmanının kullanılmasını gerektirmeyen yuva parçalama testinin bariz istisnası dışında, her test için geçerlidir.

  1. Nakliye ve ortamdaki değişikliklerden kaynaklanan stresi en aza indirmek için testten en az 14 gün önce hayvanları araştırma tesisinde barındırın.
  2. Ağırlık, davranışsal araştırmalarda yaygın bir kafa karıştırıcı faktör olduğundan, testten önce hayvan ağırlıklarını kaydedin.
  3. Taşıma stresini en aza indirmek için barınaklarından taşındıktan sonra hayvanları en az 1 saat deney odasında alışmaya bırakın, bu tür bir taşıma gerçekleştiğinde (yani, barınak odasında gerçekleştirilen yuva parçalama hariç aşağıda açıklanan tüm testler).
  4. Deney sırasında hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için kuyruktaki her hayvanı toksik olmayan, su bazlı bir işaretleyici ile etiketleyin.
  5. Her denemeden sonra test sırasında hayvanlar tarafından deney aparatında bırakılan tüm idrar ve dışkıları çıkarın.
  6. Test edilen her hayvandan önce ve sonra tüm deney cihazlarını% 75 alkolle silin. Temizleme, test sırasında biriken koku izlerini giderir ve kararlı deney koşullarının korunmasına yardımcı olur.
  7. Hayvanları ev kafeslerinden deney aparatına mümkün olduğunca özenle, tercihen küçük opak bir kapta taşıyın ve ardından başka manipülasyonlara gerek kalmadıkça serbestçe serbest bırakın.
  8. Ev kafesindeki test edilmemiş hayvanları etkilemelerini önlemek için her hayvanı testten sonra geçici bir tutma kafesine yerleştirin.
  9. Erkekleri ve kadınları ardışık günlerde test edin. Deney grupları arasındaki öngörülemeyen çevresel faktörleri dengelemek için test sırasında farklı genotiplerin sırasını değiştirin.
  10. Tüm hayvanlar test edildikten sonra hayvanları ev kafeslerine geri koyun ve barınma odasına geri koyun.
  11. Hayvanların tekrar tekrar test edilmesi durumunda, her test arasında en az 1 günlük bir aralık bırakın.

2. Davranış testleri

  1. Yükseltilmiş artı labirent (EPM)
    NOT: C57BL / 6NCrl ve UBE3AmGenedel / + fare suşlarının her iki cinsiyeti bu çalışma için 9-12 haftalıkken test edildi. Test sırasında hayvanların ağırlıkları erkekler için 22 ila 36 g ve dişiler için 18 ila 28 g arasında değişmektedir.
    1. Artı şeklindeki labirenti kameranın hemen altındaki test platformuna yerleştirin. Duvardaki potansiyometreyi kullanarak, ayarlama sırasında sensörü labirentin ortasına yerleştirilmiş olarak, bir lüksometre yardımıyla ışık şiddetini merkezinde 70 lux'e ayarlayın.
    2. Viewer yazılım simgesine çift tıklayarak yazılımı açın ve Yapılandırma sekmesinin sol üst tarafındaki simgeye tıklayarak EPM testi için yapılandırmayı yükleyin. Dosya menüsünden EPM eklentisini yükleyin. Deney sekmesinin ilgili alanlarında bilgisayar klavyesini (hayvan kimliği, genotip, cinsiyet ve deney bilgileri (tarih, ışık yoğunluğu) kullanarak hayvan bilgilerini doldurun. Bölgenin konumunun, açık kollarının ve kapalı kollarının doğru yapılandırılıp yapılandırılmadığını kontrol edin. Görsel bir kontrol ve bilgisayar faresi yardımıyla, sanal anahatlı bölgelerin video önizlemesinde karşılık gelen EPM bölgeleriyle eşleştiğinden emin olun.
    3. EPM, bir hayvanın yaklaşma-kaçınma çatışmasına dayanan genel kaygısını değerlendirmek için kullanılan bir testtir. Kemirgenler doğal olarak iyi aydınlatılmış korunmasız alanlardan (açık kollar) kaçınma eğilimindedir, daha güvenli olanlar (kapalı kollar) lehine. Bu tam otomatik test bir video izleme sistemine dayandığından, yazılımın her bölgede harcanan süreyi ve giriş sayısını otomatik olarak hesaplamasına izin verin.
    4. Test sırasında, hayvanları endüstriyel, kızılötesi ışığa duyarlı bir kamera aracılığıyla videoya kaydedin. Yazılımın kayıt sırasında hayvanın konumunu gerçek zamanlı olarak algılamasına izin verin. Bunu takiben, hayvanın labirentteki davranışını tanımlayan tüm parametreleri hesaplamak için yazılımın hayvanın izlerini otomatik olarak değerlendirmesine izin verin. Hayvanlarda anksiyete benzeri davranış düzeyini değerlendirmek için anksiyojenik açık kollarda geçirilen zamanı ve açık kol ziyaretlerinin yüzdesini kullanın.
      NOT: Özel yapım labirent, kızılötesi ışık geçirgen malzemeden yapılmıştır ve bir ışık yayan diyot (LED) kızılötesi ışık kaynağı platformuna yerleştirilmiştir.
    5. Fare imlecini Edinme sekmesinin sol üst tarafındaki ok simgesinin üzerine getirin. Bir hayvanı ev kafesinden elinizle çıkarın ve yavaşça EPM'nin ortasına yerleştirin. Bilgisayar faresine sol tıklayarak protokolü başlatın ve deney odasından hemen çıkın.
    6. 5 dakikalık ücretsiz labirent keşfinden sonra kayıt protokolü bittiğinde, protokol sonlandırıldıktan sonra görünen pencerede Tamam'a tıklayarak kaydedilen verileri kaydedin, dosyayı uygun şekilde adlandırın ve Kaydet'e tıklayın. Veri analizi sekmesinin sol dikey panelindeki simgeye tıklayarak çevrimdışı analiz için test edilen her hayvan için sonuçları bir .csv dosyasına aktarın.
    7. Hayvanı labirentten elle çıkarın ve geçici tutma kafesine koyun. Tüm hayvanları aynı şekilde test etmeye devam edin. Elevated Plus labirent eklentisinin sonuçlar sekmesindeki Sonuçları Kopyala simgesine tıklayarak çevrimdışı analiz için test edilen tüm hayvanların sonuçlarını bir Not Defteri dosyasına kopyalayın.
      NOT: Yazılım ve donanım farklılık gösterebilir ve ilgili kılavuzlara uyulmalıdır. Ek olarak, aydınlatma veya bilgisayar yerleştirme gibi deney düzeneği, hayvan tesisinin inşasına bağlı olarak değişebilir.
  2. Açık alan (OF) testi
    NOT: Açık alan testi, bir hayvanın yeni bir ortamda keşif davranışı tarafından tetiklenen genel hareketini değerlendirir. Ek olarak, korumasız, iyi aydınlatılmış bir alanda genel kaygıyı tespit etmek için yaygın olarak bir tarama aracı olarak kullanılır. Bu, önceki testte de kullanılan bir video izleme sistemini kullanan tam otomatik bir testtir.
    1. Dört OF test kutusunu kameranın hemen altındaki test platformuna yerleştirin. Duvardaki potansiyometreyi kullanarak, ayarlama sırasında sensörü her kutunun ortasına yerleştirilmiş olarak, bir lüksometre yardımıyla her OF testinin merkezinde ışık yoğunluğunu 200 lux'e ayarlayın.
    2. Viewer yazılım simgesine çift tıklayarak yazılımı açın ve Yapılandırma sekmesinin sol üst tarafındaki simgeye tıklayarak OF testi için yapılandırmayı yükleyin. Deney sekmesinin ilgili alanlarında bilgisayar klavyesini (hayvan kimliği, genotip, cinsiyet ve deney bilgileri (tarih, ışık yoğunluğu) kullanarak hayvan bilgilerini doldurun. Bölgenin konumunun (merkez ve çevre) OF test kutularıyla eşleşip eşleşmediğini kontrol edin ve gerekirse bunları ayarlayın. Görsel bir kontrol ve bilgisayar faresi yardımıyla, sanal ana hatlı merkez ve çevre bölgelerinin video önizlemesinde karşılık gelen OF test bölgeleriyle eşleştiğinden emin olun.
    3. Test sırasında, hayvanları endüstriyel, kızılötesi ışığa duyarlı bir kamera aracılığıyla videoya kaydedin. Yazılımın kayıt sırasında hayvanın konumunu gerçek zamanlı olarak algılamasına izin verin ve OF test kutusunda hayvanın davranışını tanımlayan tüm parametreleri hesaplamak için hayvanın izlerini otomatik olarak değerlendirin. Yürünen mesafe, ortalama hız ve dinlenme süresi, yeni bir ortamda hayvan aktivitesini değerlendirmek için kullanılan parametreler iken, merkeze giriş sayısı ve merkezdeki süre, hayvanlarda anksiyete benzeri davranışları tanımlar.
      NOT: Özel yapım labirent, kızılötesi ışık geçirgen malzemeden yapılmıştır ve bir LED kızılötesi ışık kaynağı platformuna yerleştirilmiştir.
    4. Fare imlecini Edinme sekmesinin sol üst tarafındaki ok simgesinin üzerine getirin. Dört hayvanı ev kafesinden elle çıkarın ve her bir OF test kutusunun köşesine nazikçe yerleştirin. Bir bilgisayar faresine sol tıklayarak protokolü başlatın ve hemen deney odasından çıkın.
    5. 10 dakikalık ücretsiz labirent keşfinden sonra protokol bittiğinde, protokol sonlandırıldıktan sonra görünen pencerede Tamam'a tıklayarak verileri kaydedin, dosyayı uygun şekilde adlandırın ve Kaydet'e tıklayın. Veri analizi sekmesinin sol dikey panelindeki simgeye tıklayarak çevrimdışı analiz için test edilen her hayvan için sonuçları bir .csv dosyasına aktarın.
    6. Hayvanları labirentten elle çıkarın ve geçici tutma kafesine koyun. Tüm hayvanları aynı şekilde test etmeye devam edin. Dışarı aktarılan verileri analiz edin.
      NOT: Yazılım ve donanım farklılık gösterebilir ve ilgili kılavuzlara uyulmalıdır. Ek olarak, aydınlatma, labirent sayısı veya bilgisayar yerleşimi gibi deney düzeneği, hayvan tesisinin inşasına bağlı olarak değişebilir.
  3. Kuyruk süspansiyon testi (TST)
    NOT: Otomatik kuyruk süspansiyon aparatı ile üç fare aynı anda test edilir.
    1. Oda ışık yoğunluğunu 100-120 lükste tutun.
    2. TST sistemini bir USB kablosuyla bilgisayara bağlayın. USB dongle'ı bilgisayara takın ve BIO-TST yazılım simgesine çift tıklayarak yazılımı başlatın. Ayarlar sekmesinde Genel'in altında, alım süresini 360 sn olarak ayarlayın. Deneme sekmesinde Yeni konu listesi'ni seçin ve açılan sekmedeki yönergeleri izleyerek yeni bir deney dosyası ve yeni bir test edilen konu listesi oluşturun.
    3. Edinme sekmesinde Çalıştırmayı başlat | devam et'e tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Transpore tıbbi bant gibi tek taraflı yapışkan bandı, tabandan başlayarak hayvanın kuyruğunun 3/4'ü etrafına sararak hayvanları teste hazırlayın.
    4. Askı kancasını banttan geçirin ve hayvanı üzerine asın. Her hayvan için görselleştirilmiş konumun altındaki Başlat simgesine tıklayarak kancaya astıktan hemen sonra her hayvan için ayrı ayrı veri toplamaya başlayın ve test sırasında hayvanları sürekli olarak gözlemleyin.
    5. İlk hayvan grubu için satın alma işlemi tamamlandıktan sonra, Bir sonraki çalıştırmayı başlat'a tıklayın, hayvanları kancadan çıkarın, yapışkan bandı kuyruklarından ayırın, bandı kuyruk boyunca makasla dikkatlice kesin ve hayvanları geçici tutma kafesine koyun.
    6. Aparatı %75 alkol ve kağıt mendille temizleyin ve yukarıda anlatıldığı gibi diğer hayvanlarla devam edin. Analiz sekmesinde, analiz için alımın son 4 dakikasını seçin, ardından Analiz dönemindeki tüm geçerli çalıştırmaları seçin, Seçili konuları analiz et'e tıklayın, istediğiniz veri biçimini seçin ve toplanan verileri daha fazla analiz için dışa aktarmak için Seçili verileri dışa aktar'a tıklayın.
      NOT: Test 6 dakika sürer. İlk 2 dakika boyunca hayvanlar şiddetli bir şekilde mücadele edecekler, ancak kalan 4 dakika boyunca umutsuzluk reaksiyonu yaygınlaştıkça, bu süre boyunca hareketsizlik süresi analiz için alınır. Yazılım ve donanım farklılık gösterebilir ve ilgili kılavuzlara uyulmalıdır. Ek olarak, ekipmanın kendisi değişebilir (örneğin, test konumlarının sayısı).
  4. Yürüme analizi
    1. Koşu bandını açın ve hız göstergesinin yanında bulunan + veya - sembolüne tıklayarak ekipman panelinde kayış hızını manuel olarak 20 cm/s'ye ayarlayın. Düğmeyi saat yönünde çevirerek aparat ışığını açın. Yazılım simgesine çift tıklayarak DigiGait Imager yazılımını başlatın ve deklanşör hızı için deklanşör hızını albino fareler için 100 veya alandaki siyah/koyu fareler için 130 olarak ayarlayın.
    2. İlk hayvanı ev kafesinden elle çıkarın ve yavaşça koşu bandı kayışına yerleştirin. Hayvan bölmesinin kapısını kapatın. Hayvanın kuyruğunun kapı ile çerçeve arasına sıkışmadığından emin olmak için görsel olarak inceleyin.
    3. Kayıttan önce farenin koşu bandı kayışını keşfetmesine izin verin. Koşu bandını ~3 saniye boyunca yavaş bir yürüme hızına ayarlayarak ve ardından durdurarak hayvanı sürekli gözlemleyerek hayvanın testi gerçekleştirebildiğinden emin olun.
    4. Ekipman panelindeki Başlat düğmesine basarak kayışı çalıştırın ve yaklaşık 10 saniye boyunca kayıt yapın. En az 10-15 adımlık net ve akıcı bir hareketin gözlemlenebilir olduğundan emin olun. Ekipman panelindeki Durdur düğmesine basarak kayışı durdurun ve fareyi elle geçici tutma kafesine geri koyun.
    5. OYNAT'a tıklayarak ve EDIT modunda görsel kontrolle kaydı gözden geçirerek bir dizi görüntü için kaydı akıcı adımlarla tarayın. Başlangıç ve bitiş kare numaralarını ilgili alanlara manuel olarak yazarak 10-15 akıcı hareket seçin (ilk kare için From frame# ve son kare için To tuşu). Hayvanın bilgilerini (hayvan kimliği, doğum tarihi, cinsiyeti, kilosu, kemer hızı ve kemer açısı) doldurun ve gerektiğinde ilgili alanlara yorum yapın. Kaydet'i tıklatarak daha fazla analiz için dosyayı kaydedin.
    6. Kayışı suyla temizleyin ve diğer hayvanlarla aynı şekilde devam edin. Bir sonraki hayvan yürüyüşünü kaydetmeye devam etmek için KAMERA'yı seçin. Tüm hayvanlar için kayıtlar alındığında, analize devam edin.
      NOT: Bandın belirli bir hızında yürüyemeyen hayvanlar testin dışında tutulur. Deneyimlerimize dayanarak, yaşlı hayvanların (50 haftadan fazla) koşu bandında yürürken daha fazla zorluk yaşadığını ve genotipe bağlı olarak %2 ila %50 arasında değişken bir sıklıkta olduğunu gözlemliyoruz. Hayvan atıkları, koşu bandının önündeki veya arkasındaki tepsilerde toplanır. Tepsiler her çalışmadan sonra boşaltılır ve ılık sabunlu su ile yıkanır. Kemer nemli bir bezle silinir.
    7. Hayvan ayak izlerinin video kayıtlarının tam otomatik analizine dayalı yürüyüş analizi gerçekleştirin. DigiGait Analiz yazılımında verileri ayarlayın.
      NOT: Yürüme analizi sadece motor koordinasyonunun bir ölçüsünü değil, aynı zamanda dinamik yürüyüş sinyalinin analizine dayalı, sıralı adımlarla pati yerleşiminin zamansal geçmişini temsil eden ayrıntılı bir kinematik açıklama sağlar. Aşağıdaki parametreler yazılım tarafından otomatik olarak ölçülür: salınım süresi, sallanmada adım süresi yüzdesi, frenleme süresi, frenlemede adım süresi yüzdesi, itme süresi, itmede adım yüzdesi, duruş süresi, duruşta adım yüzdesi, adım süresi, duruşun frenleme yüzdesi, duruş aşamasının itme yüzdesi, duruş oranı, adım uzunluğu, adım sıklığı, pati açısı, pati açısı değişkenliği, duruş genişliği, adım açısı, adım uzunluğu değişkenliği, adım genişliği değişkenliği, adım açısı değişkenliği, adım uzunluğu değişim katsayısı, duruş genişliği değişim katsayısı, adım açısı değişim katsayısı, salınım süresi değişim katsayısı, tepe duruşunda pati alanı, tepe duruşunda pati alanı değişkenliği, Arka Bacak Ortak Duruş Süresi, Ortak Duruş Yüzdesi, Sol ve Sağ Arka Duruş Sürelerinin Oranı, Yürüyüş Simetrisi, Frenleme Aşamasında Koşu Bandı Kemeri ile Temas Halinde Pençe Alanının Maksimum Değişim Oranı, İtki Aşamasında Koşu Bandı Bandı ile Temas Halinde Olan Pençe Alanının Maksimum Değişim Oranı, Tau-Tahrik, Pençe Üst Üste Binme Mesafesi, pençe yerleştirme konumlandırması, ataksi katsayısı, orta hat mesafesi, eksen mesafesi ve pençe sürüklemesi. Yazılım, istatistiksel analizden önce tamamlanması gereken adım izi gürültüsünün küçük bir düzeltmesine izin verir. Yazılım ve donanım farklılık gösterebilir ve ilgili kılavuzlara uyulmalıdır.
  5. Rotarod (Rotarod)
    NOT: Rotarod testi, kemirgen motor fonksiyonlarını-dengesini ve motor koordinasyonunu değerlendirmek için kullanılır. Test, bir farenin sabit çaplı (5 cm) dönen bir çubuk üzerinde yürümesini gerektirir ve dönüş, hayvan artık kalamayacak duruma gelene kadar belirli bir süre (5 dakika) boyunca hızlanır.
    1. Ekipman üzerindeki açma/kapama düğmesine basarak rotarod ekipmanını açın ve Rod yazılım simgesine çift tıklayarak yazılımı başlatın. Dosya sekmesinde yeni bir dosya başlatın ve uygun bir ad altında kaydedin. Kurulum penceresinde tarih, kullanıcı adı ve olası yorumlar gibi deneme ayrıntılarını doldurun. Hız Profilini 300 s'ye, başlangıç hızını 4 rpm'ye ve terminal hızını 40 rpm'ye ayarlayın.
    2. Hayvan alanında test edilen hayvanlar için bir program hazırlayın ve her hayvanı çubuk üzerindeki konumuna atayın. Pozisyonlar yazılımda açıkça belirtilmemiştir, ancak liste satırına karşılık gelirler; Örneğin, ilk satır çubuğun ilk konumunu, beşinci satır çubuğun beşinci konumunu vb. gösterir. Deney grupları arasındaki her çubuk konumunu dengelemeyi unutmayın.
      NOT: Beş hayvan aynı anda test edilebilir.
    3. Kapat'ı tıklatarak Kurulum panelini kapatın ve Ölç'ü tıklatarak ölçü panelini açın. Başlat/Durdur'a tıklayarak çubuğun ilk dönüşünü 4 rpm'de başlatın ve ilk beş hayvanı atanmış konumlarına yerleştirin. Tüm hayvanlar çubuğun üzerindeyken, Profili Başlat'a tıklayarak test protokolünü başlatın ve çubuk 5 dakika içinde kademeli olarak 40 rpm'ye çıkacaktır. Bir hayvan çubuktan düşerse, protokol başlamadan önce onu çubuğa geri koyun.
      NOT: Hayvanlar genellikle ilk denemede tüm fareleri bir kerede üzerine yerleştirecek kadar uzun süre çubuğun üzerinde kalmazlar. Başlangıçta sabit dönme hızı ile hayvanları çubuğa yerleştirirken sabırlı olmak önemlidir. Testin amacı, hayvanın çubuk üzerindeki dayanıklılığını sabit bir dönüş hızında belirlemek değil, hayvanın çubuk üzerinde kalamadığı hızı bulmaktır. Çubuğun hızı, üzerinde kalma gecikmesi ile orantılıdır; Böylece hayvanın dengesini ifade etmek için kullanılır.
    4. Hayvanları, hepsi çubuktan düştükten sonra veya 5 dakika geçtikten sonra geçici tutma kafesine taşıyın. Hayvan atıklarını temizleyin ve çubuğu ve tepsiyi alkolle temizleyin.
    5. Bir sonraki hayvan grubuna aynı şekilde devam etmek için Hayvanlar ->'a tıklayın. Tüm hayvanları test ettikten sonra, Kapat'a tıklayarak Ölç penceresini kapatın ve toplanan verileri görüntülemek için Göster'e tıklayın. Daha fazla analiz için CSV'yi Dışa Aktar'a tıklayarak elde edilen verileri .csv dosya biçiminde dışa aktarın.
    6. Her hayvanı çubuk üzerinde 15 dakikalık denemeler arası aralıklarla üç kez test edin. Daha fazla istatistiksel analiz için üç denemenin üzerine düşmek için gecikmenin ortalama değerini kullanın. Testi art arda 5 gün boyunca tekrarlayarak hayvanın motor öğrenmesini değerlendirin.
      NOT: Yazılım ve donanım farklılık gösterebilir ve ilgili kılavuzlara uyulmalıdır. Ek olarak, ekipmanın kendisi, örneğin test konumlarının sayısı, genel yapı ve çubuk boyutu açısından farklılık gösterebilir.
  6. Yuva parçalama yuvası binası
    1. Hayvanları 1 hafta boyunca standart ekipmanla (yatak takımı, yiyecek ağı ve su temini) tek polikarbonat fare kafeslerine ayırın. Forseps kullanarak yaklaşık 12 g pamuk yuvası alın, ağırlığını terazi kullanarak manuel olarak kaydedin ve rastgele bir kafese, ancak su kaynağının karşı tarafına yerleştirin. Kafesleri hayvanlarla birlikte barınma odasına iade edin.
    2. Sonraki 4 gün boyunca her yuvayı her gün aynı saatte terazi kullanarak manuel olarak tartın. Ağırlıkları kağıda veya önceden hazırlanmış bir elektronik tabloya kaydedin. Tartıldığında her yuvanın kuru olduğundan emin olun; Değilse, bir ısıtma yastığı üzerinde kurutun ve tüm yuvaları, farenin yuvasını yaptığı yerde aynı anda atanmış kafeslerine geri koyun. Yuvacık birkaç parçaya bölünmüşse, en büyüğünü tartın.
    3. Veri analizi için, başlangıç ağırlığına göre her gün yuva ağırlığındaki azalmayı ifade edin ve bunu kullanılan malzemenin yüzdesi olarak sunun.
      NOT: Erkekleri ortak bir kafese geri getirmek, hayvanlar arasında saldırganlığın artmasına ve istenmeyen yaralanmalara neden olabilir. Bu nedenle, hayvan refahından ödün vermemek için yuva parçalama testi, test rejiminin sonuna doğru planlanmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yükseltilmiş artı labirent ve açık alan testleri
EPM ve OF testleri, kemirgenlerin yeni ortamları keşfetme konusundaki doğal eğilimini kullanır18,19. Keşif, kemirgenlerin yeni bir çevrenin keşfi ile olası tehlikelerden kaçınma arasında seçim yaptığı bir yaklaşma-kaçınma çatışması tarafından yönetilir. Hayvanlar barınak, sosyal temas veya yiyecek arama arayışı içinde bilinmeyen yerleri keşfederler. Bununla birlikte, yeni yerler avcılar veya rak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Farklı fare suşlarında oluşturulan AS modelleri, insan semptomlarıyla karşılaştırmayı kolaylaştırmak için genellikle hayvanların duygusal durumu, motor işlevleri ve bilişsel yetenekleri testleriyle doğrulanır31,32. AS modellerinde motor eksikliği, laboratuvarlar arasında en tutarlı bulgudur, bunu mutantların değişmeyen duygusallık durumu ve yuva oluşturmada zorluklarizlemektedir 31,32,33

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma Çek Bilimler Akademisi RVO 68378050, LM2018126 MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Çek Fenogenomik Merkezi'nin yükseltilmesi: MEYS ve ESIF tarafından çeviri araştırmalarına doğru geliştiriliyor), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (MEYS ve ESIF tarafından CCP Infrastructure Upgrade II) ve OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (MEYS ve ERDF tarafından transgenik modeller için daha yüksek kalite ve kapasite) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından sağlanan "Gen Terapisi Derneği (ASGENT)", Çekya (https://asgent.org/) ve Çek Fenogenomik Merkezi LM2023036 STK'sından fon almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kafesler, ayrı ayrı havalandırılanTechniplast
DigiGaitMouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, ABD		Ekipman ihale edildi, katalog numarası verilmedi ve şirketin web sitesinde bulunamadıFare yürüyüşünün ayrıntılı analizi, sağlanan donanım ve yazılım.
FDA Nestlet squaresDatesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UKMalzeme, doğrudan e-posta talebi yoluyla Velaz satıcısından satın alındı. Velaz herhangi bir katalog numarası sağlamaz.Yuva kurma testi için pamuklu yuvalar. Nestlet tanımı: Her biri 2-3 g, çapı yaklaşık 5 x 5 x 0,5 cm.
Mouse chowAltramion
RotarodTSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Almanya		Ekipman ihale edildi, herhangi bir katalog ve nbsp; numarası verilmedi ve 5 fare için şirketin web sitesi Rotarod'da bulunamadı, donanım ve yazılım sağlandı. Tambur boyutları: Çap: 30 mm, şerit başına genişlik: 50 mm, düşme mesafesi 147 mm.
Kuyruk Süspansiyon TestiBioseb, In Vivo Araştırma Cihazları, 13845 Vitrolles
FRANSA		Referans: BIO-TST5Kuyruk tarafından asılan 3 farenin hareketsizlik süresi değerlendirmesi için tam otomatik ekipman, sağlanan donanım ve yazılım
Transpore tıbbi bantMedical M, Ltd.P-AIRO1291Bir hayvanı kuyruğundan kancaya tutturmak için kullanılan bant.
Viewer - Video Takip Sistemi BiobserveGmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Almanya		Yazılımlı ekipmanlar ihale edildi, katalog ve numara verilmedi ve şirketin web sitesinde bulunamadıÖzel yapım donanıma sahip yazılım: labirent, IR tabanı, IR'ye duyarlı kameralar. Özel yapım OF boyutları: 42 x 42 cm alan, 49 cm yüksekliğinde duvar, merkezi bölge alanı: 39 cm2. Özel yapım bir EPM, 79 cm uzunluğunda açık bir kol ile yerden 50 cm yüksekte yükseltildi. 9 cm genişliğinde ve 77 cm uzunluğunda, 7,6 cm genişliğinde kapalı kol.

Kaynaklar

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman's syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815(2022).
  7. Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478(2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145(2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92(2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20(2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354(2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47(2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451(2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509(2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426(2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Davranışsal TestlerRotarod TestiYürüyüş AnaliziYuva YapımıAçık Alan TestiYükseltilmiş Artı LabirentKuyruk Asma TestiUBE3A Nakavt
Angelman Sendromlu Bir Fare Modelinin Davranışsal Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.