Yöntem makalesi

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

DOI:

10.3791/65215

⸱

7 Temmuz 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücre popülasyonları ile genom çapında analizler, özellikle kök hücre alanındaki çalışmalar için büyük bir kısıtlamadır. Bu çalışma, yüksek yapısal protein içeriğine sahip bir doku olan ekstremite kasından uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) izolasyonu için etkili bir protokolü açıklamaktadır. Yetişkin farelerden alınan disseke ekstremite kasları, dispas ve tip I kollajenaz ile takviye edilmiş besiyerinde kıyma ile mekanik olarak bozuldu. Sindirimden sonra, homojenat hücre süzgeçlerinden süzüldü ve hücreler FACS tamponunda süspanse edildi. Canlılık, sabitlenebilir canlılık boyası ile belirlendi ve immün boyalı uydu hücreleri FACS ile izole edildi. Hücreler Triton X-100 ile parçalandı ve serbest bırakılan çekirdekler konkanavalin A manyetik boncuklarına bağlandı. Çekirdek/boncuk kompleksleri, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne veya histon modifikasyonlarına karşı antikorlarla inkübe edildi. Yıkamalardan sonra, çekirdek/boncuk kompleksleri protein A-mikrokok nükleazı ile inkübe edildi ve CaCl2 ile kromatin bölünmesi başlatıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, kütüphaneler oluşturuldu ve dizilendi ve genom çapında transkripsiyon faktörü bağlanması ve kovalent histon modifikasyonları için profiller biyoinformatik analiz ile elde edildi. Çeşitli histon işaretleri için elde edilen pikler, bağlanma olaylarının uydu hücrelerine özgü olduğunu gösterdi. Ayrıca, bilinen motif analizi, transkripsiyon faktörünün, aynı kökenli yanıt elemanı aracılığıyla kromatine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu protokol, yetişkin farelerde uzuv kas uydu hücrelerinde gen regülasyonunu incelemek için uyarlanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet çizgili kaslar, toplam insan vücudunun ağırlığının ortalama %40'ını temsil eder1. Kas lifleri, yeni oluşan miyositlerin füzyonu ve hasarlı olanların yerini alan yeni miyoliflerin üretilmesi ile tanımlanan yaralanma üzerine rejenerasyon için dikkate değer bir kapasite sergiler2. 1961'de Alexander Mauro, uydu hücreleri3 olarak adlandırdığı bir mononükleer hücre popülasyonu bildirdi. Bu kök hücreler, transkripsiyon faktörü eşleştirilmiş kutu 7'yi (PAX7) eksprese eder ve bazal lamina ile kas liflerininsarkolemması arasında bulunur 4. Farklılaşma kümesini 34 (CD34; hematopoietik, endotelyal progenitör ve mezenkimal kök hücre belirteci), integrin alfa 7 (ITGA7; pürüzsüz, kardiyak ve iskelet kası belirteci) ve ayrıca CXC kemokin reseptörü tip 4'ü (CXCR4; bir lenfosit, hematopoietik ve uydu hücresi belirteci) ifade ettikleri bildirilmiştir5. Bazal koşullarda, uydu hücreleri, onları hareketsiz bir durumda tutan belirli bir mikro ortamda bulunur6. Kas hasarı üzerine aktive olurlar, çoğalırlar ve miyojenez7'ye uğrarlar. Bununla birlikte, toplam kas hücresi sayısının sadece küçük bir kısmına katkıda bulunan genom çapındaki analizleri, özellikle fizyolojik ortamlarda (toplam hücrelerin% <1'i) özellikle zordur.

Uydu hücrelerinden kromatin izolasyonu için, kromatin immünopresipitasyonunu takiben büyük paralel dizileme (ChIP-seq) veya hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag) deneylerini içeren çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu iki teknik, tartışmasız kalan bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Gerçekten de, ChIP-seq, sonikasyon adımı sırasında büyük bir kısmı kaybolan yeterli kromatin üretmek için yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. CUT & Tag, düşük hücre sayısı için daha uygundur, ancak Tn5 transpozaz aktivitesi nedeniyle ChIP-seq'den daha fazla hedef dışı bölünme bölgesi oluşturur. Ek olarak, bu enzim açık kromatin bölgeleri için yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, CUT & Tag yaklaşımı, susturulmuş heterokromatin8,9 yerine, genomun aktif olarak kopyalanan bölgeleriyle ilişkili histon modifikasyonlarını veya transkripsiyon faktörlerini analiz etmek için tercihen kullanılabilir.

Burada, fare uzuv kas uydu hücrelerinin FACS ile hedeflerin altında bölünme için izolasyonuna ve nükleaz (CUT & RUN)10,11 analizi kullanılarak serbest bırakılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çeşitli adımlar, dokunun mekanik olarak bozulmasını, hücre sıralamasını ve çekirdek izolasyonunu içerir. Yöntemin, canlı bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasına ilişkin etkinliği, kovalent histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörleri için CUT & RUN analizi yapılarak gösterilmiştir. İzole edilmiş hücrelerin kalitesi, tarif edilen yöntemi, doğal genomik doluluk durumunu aslına uygun olarak yakalayan kromatin hazırlamak için özellikle çekici kılar ve kromozom konformasyonunu, spesifik lokuslarda (4C-dizilimi) veya genom çapında seviyelerde (Hi-C) yüksek verimli dizileme ile kombinasyon halinde yakalamak için uygun olması muhtemeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler, Ulusal Hayvan Bakım Yönergelerine (Avrupa Komisyonu direktifi 86/609/CEE; Fransız kararnamesi no.87-848) laboratuvar hayvanlarının araştırma için kullanımına ilişkindir. Amaçlanan manipülasyonlar, 2010/63/EU direktifine göre etik değerlendirme ve yetkilendirme için Etik Komite'ye (Com'Eth, Strasbourg, Fransa) ve Fransız Araştırma Bakanlığı'na (MESR) APAFIS numarası #22281 altında sunulmuştur.

1. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile uydu hücrelerinin izolasyonu için hücre süspansiyonunun hazırlanması (Şekil 1)

  1. Kas dokusunun izolasyonu
    1. Forseps, neşter ve makas dahil olmak üzere kas diseksiyonu aletlerini bir temizlik maddesi kullanarak dekontamine edin (Tablo 1) ve damıtılmış suyla iyice durulayın.
    2. Her biri 1 mL kas izolasyon tamponu içeren iki adet 2 mL tüp hazırlayın (Tablo 1) ve hasat edilen kasları toplamak için bunları buzun üzerine yerleştirin.
    3. 10 haftalık iki C57 / Bl6J erkek fareyi CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık ile kurban edin. Her farenin tamamına% 70 etanol püskürtün. Forseps kullanarak cildi arka bacaktan soyun. Femur, tibia ve fibulayı çevreleyen tüm uzuv kaslarını inceleyin (fare başına yaklaşık 1 mg kas).
      NOT: Uydu hücre sayısı 15 haftalıktan sonra azalır.
    4. Hasat edilen uzuv kaslarını, adım 1.1.2'de hazırlanan 1 mL kas izolasyon tamponu içeren 2 mL'lik tüplere yerleştirin. Aynı prosedürü izleyerek ikinci fareden kasları toplayın. Hasat edilen kasları 1 mm'den küçük3 parça elde edilene kadar buz üzerinde makasla kıyın.
      NOT: Kaslar esas olarak tarif edildiği gibi toplandı ve kıyıldı12. Adım 1.2 veya 1.3'ü izleyerek doku sindirimi gerçekleştirin.
  2. Kollajenaz enzimi ile doku sindirimi
    1. Kıyılmış kas süspansiyonunu iki fareden 18 mL kas izolasyon tamponu (5 mL [5 U / mL] dispas ve 5 mg tip I kollajenaz ile desteklenmiş) içeren 50 mL'lik bir tüpe (Tablo 1) dökerek aktarın (Tablo 1).
    2. Tüpü sıkıca kapatın ve laboratuvar filmi ile kapatın (Tablo 1). 37 °C'de 100 rpm'de 30 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosuna (Tablo 1) yatay olarak yerleştirin.
    3. 30 dakika sonra 5 mg tip I kollajenaz ekleyin. Tüpleri 30 °C'de 37 °C'de 100 rpm'de çalkalanan bir su banyosunda çalkalama altında 30 dakika daha tutun.
    4. Sindirimden sonra, ayrışma etkinliğini artırmak için kas süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde berrak bir pelet görünecektir. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve tüpte 5 mL ortam bırakın.
      NOT: Ortamı terk etmek, hücrelerin gerilmesini önlemeye yardımcı olur. 10 mL taze kas izolasyon tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
    5. 100 μm, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerini (her türden bir tane) (Tablo 1) açık 50 mL'lik tüplere yerleştirin. Süspansiyonu ardışık hücre süzgeçlerine (100 μm, 70 μm, 40 μm) pipetleyin ve akışı 40 μm'nin altındaki hücreler içeren 50 mL'lik tüplerde toplayın.
    6. Süspansiyonu 4 °C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. 2 mL kalana kadar 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve ardından 100-200 μL kalana kadar 0,2-1 mL'lik bir pipet kullanın. Peletin 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi (Tablo 2). Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
    7. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın. Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). Buzun üzerine yerleştirin.
  3. Liberase termolizin düşük (TL) enzimi ile doku sindirimi için alternatif yöntem
    1. Adım 1.1'deki açıklamaları izleyin. doku izolasyonu için.
    2. Liberaz aracılı doku ayrışması için, adım 1.1.2'de açıklanan kas izolasyon tamponu yerine 2 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) izolasyon tamponunda (Tablo 2) kasları hasat edin.
    3. Kıyılmış kas süspansiyonunu iki fareden 50 mL'lik bir tüpe (Tablo 1) dökerek aktarın 18 mg / mL'de 300 veya 600 μL Liferaz TL ile desteklenmiş 5 mL RPMI izolasyon tamponu içeren (Tablo 1) (yani, 0.083 mg / mL ve 0.167 mg / mL nihai konsantrasyonlar, sırasıyla)13.
    4. Tüpü sıkıca kapatın ve laboratuvar filmi ile kapatın (Tablo 1). 37 °C'de 100 rpm'de 30 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosuna (Tablo 1) yatay olarak yerleştirin.
    5. Sindirimden sonra, ayrışmayı ve ayrışma etkinliğini artırmak için kas süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    6. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde berrak bir pelet görünecektir. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve tüpte 5 mL ortam bırakın. Ortamı terk etmek, hücrelerin strese girmesini önlemeye yardımcı olur. 10 mL taze RPMI izolasyon tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
    7. 100 μm, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerini (her türden bir tane) (Tablo 1) açık 50 mL'lik tüplere yerleştirin.
    8. Süspansiyonu ardışık hücre süzgeçlerine (100 μm, 70 μm, 40 μm) pipetleyin ve akışı 40 μm'nin altındaki hücreler içeren 50 mL'lik tüplere toplayın.
    9. Süspansiyonu 4 °C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. 2 mL kalana kadar 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve ardından 100-200 μL kalana kadar 0,2-1 mL'lik bir pipet kullanın.
    10. Peletin 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi (Tablo 2). Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
    11. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın.
    12. Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). Buzun üzerine yerleştirin.
  4. FACS izolasyonu için hücre süspansiyonunun hazırlanması
    1. Adım 1.2.12'de elde edilen hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Bu numune, boyanmamış kontrolü veya negatif kontrolü oluşturacaktır (Şekil 2). 190 μL FACS tamponu ekleyin, 5 mL'lik bir tüpe aktarın (Tablo 1) ve buz üzerinde saklayın.
    2. Adım 1.2.12'de elde edilen hücre süspansiyonunun kalan 90 μL'sini 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak atın. Hücreleri, oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) seyreltilmiş 400 μL sabitlenebilir canlılık boyası (Tablo 3) ile inkübe edin.
    3. Hücreleri 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın ve 100 μL FACS tamponu ekleyin. Tüpleri üç kez nazikçe ters çevirin ve 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    4. Santrifüj süresi boyunca, floroforlara bağlı ve CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 ve CXCR4'e karşı yönlendirilmiş 100 μL'lik bir ana primer antikor karışımı hazırlayın (Tablo 3), FACS tamponunda seyreltilmiş.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin, bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak hücre süpernatanını atın ve 100 μL antikor karışımını ekleyin. Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. Girdap yapmayın. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    6. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın ve hücreleri yıkamak için 500 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da yeniden santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın.
    7. Hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: Liferaz sindiriminden elde edilen hücre süspansiyonu da aynı şekilde işlenir.
  5. FACS ile uydu hücresi seçimi
    1. Hücre süspansiyonunu kısaca vorteksleyin (2-5 saniye) ve hücreleri 100 μm'lik bir nozul ile donatılmış bir akış sitometresinde işleyin (Tablo 1).
    2. Adım 1.4.1'de saklanan boyanmamış numuneye dayalı olarak çeşitli kapı boyutlarını belirleyin (Şekil 2).
    3. Hücre koleksiyonunu iyileştirmek için 5 mL'lik bir tüpü 1 mL saf fetal buzağı serumu (FCS) ile kaplayın ve 500 μL FACS tamponu ekleyin.
    4. Boyanmamış numuneyi antikor etiketli numune ile değiştirin.
    5. İleri saçılma alanına (FSC-A) ve yan saçılma alanına (SSC-A) göre ilgilenilen popülasyonu seçin (Şekil 3A) ve FSC-A ve ileri saçılma yüksekliğine (FSC-H) sahip çift hücreleri çıkarın (Şekil 3B)14.
    6. Sabitlenebilir canlılık lekesi negatif boyama ile canlı hücreleri tanımlayın (Şekil 3C).
    7. CD31, CD45, TER119 ve CD11b için negatif hücreleri seçin (Şekil 3D).
    8. Uydu hücrelerini tanımlamak için, önce CD34 ve ITGA7 için pozitif olan hücreleri seçin (Şekil 3E) ve ardından CD34 ve ITGA7 ile seçilen popülasyondaki CXCR4 pozitif hücreleri seçin (Şekil 3F).
    9. Seçilen hücreleri (preparatın kalitesine göre 40.000 ila 80.000 hücre arasında) 500 μL FACS tamponu içeren 5 mL kaplı tüpte toplayın.

2. İzole edilen popülasyonun doku kültüründe doğrulanması

  1. Hidrojel ile slayt kaplama
    1. 280 μL saf hidrojel insan embriyonik kök hücresi (hESC) nitelikli matrisi (Tablo 1) 12 mL serumsuz DMEM / F12 ortamında seyreltin.
    2. Bir hazne sürgüsünü (Tablo 1) hidrojel çözeltisiyle kaplayın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    3. Ertesi gün, hücre tohumlamadan önce hazne slaytını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
  2. Hücre büyümesi ve farklılaşması
    1. Kuyucuk başına adım 1.5.9'dan elde edilen yaklaşık 20.000 hücreyi plakalayın ve bunları 5 gün boyunca büyüme ortamında (Tablo 2) büyütün. Preparatın kalitesinden emin olmak için immünofloresan analizi için işlemeden önce parlak alan mikroskobu (Şekil 4A) kullanarak faz kontrastlı görüntüler alın (Şekil 4B).
    2. Miyogenezi indüklemek için, miyojenik ortamda (Tablo 2) adım 2.2.1'den 7 gün daha amplifiye edilmiş uydu hücrelerini büyütün. Preparatın kalitesinden emin olmak için immünofloresan analizi için işlemeden önce parlak alan mikroskobu (Şekil 4C) kullanarak faz kontrastlı görüntüler alın (Şekil 4D).
  3. İmmünositofloresan analizi
    1. Ortamı nazikçe çıkarın, hazne lamında kültürlenen hücreleri 100 μL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca RT'de 100 μL %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
      NOT: Bu adım dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Hücrelerin gerilmesini önlemek için haznede her zaman küçük bir hacimde ortam tutulmalı ve PBS haznenin duvarlarından dökülmelidir.
    2. Hücre zarlarını geçirgen hale getirmek için% 0.1 Tween 20 (PBST) ile desteklenmiş 100 μL 1x PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
    3. RT'de 1 saat boyunca% 5 FCS (PBST-FCS) ile desteklenmiş 100 μL 1x PBST'de inkübasyon yoluyla spesifik olmayan sinyalleri bloke edin.
    4. Uydu hücrelerini ve miyofiberleri tespit etmek için hücreleri 100 μL anti-PAX7 ve anti-distrofin (DMD) antikorlarının ana karışımı (1x PBST-FCS'de seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. Hücreleri 100 μL 1x PBST ile üç kez yıkayın ve 100 μL keçi anti-fare Cy3 veya keçi anti-tavşan Alexa 488 sekonder antikorları ile inkübe edin (Tablo 3) 1x PBST-FCS'de 1 saat boyunca seyreltilmiş.
    6. Tedarikçi tarafından sağlanan ekipmanı kullanarak hazne kuyularını slayttan ayırın, 20',4-diamidino-6-fenilindol (DAPI) ile 2 μL sulu montaj ortamı ekleyin ve slaydı bir lamel ile kapatın (Tablo 1).
    7. Lekeli hücrelerin görüntüsünü konfokal mikroskopla gözlemleyin ve yakalayın.
    8. Görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin (Şekil 4B,D).

3. CUT & RUN analizi

  1. FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerinde CUT&RUN analizi için numune hazırlama
    NOT: CUT&RUN esasen açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir10,15. Tampon bileşimi şurada sunulur: Tablo 2.
    1. CUT & RUN testi için, test edilmesi gereken numune / antikor başına yöntem 1, adım 1.5.9'da elde edilen hücrelerin yaklaşık 40.000'ini kullanın.
    2. FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerini RT'de 500 x g'de 10 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak atın.
    3. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın, RT'de 500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı bir pipet (0.2-1 mL uç hacmi) kullanarak atın ve 1 mL soğuk nükleer ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    4. İnkübasyon sırasında, 850 μL soğuk bağlama tamponu içeren 1.5 mL'lik bir tüp hazırlayın (Tablo 2) ve numune başına 20 μL concanavalin A kaplı manyetik boncuk ekleyin (Tablo 1).
    5. Boncukları manyetik bir raf kullanarak 1 mL soğuk bağlama tamponu ile iki kez yıkayın (Tablo 1). Prosedür boyunca her yıkama veya tampon değişimi için, temizlenmiş süpernatanı bir pipetle (0,2-1 mL uç hacmi) çıkarmadan önce boncukların tüpün yanında manyetik rafta 5 dakika birikmesine izin verin. Ardından, 300 μL soğuk bağlama tamponunda hafifçe yeniden süspanse edin.
    6. Çekirdekleri 4 °C'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve 600 μL nükleer ekstraksiyon tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. 600 μL ekstrakte edilmiş çekirdeği 300 μL concanavalin A boncuk bulamacı ile nazikçe karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    7. Adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir raf kullanarak süpernatanı çıkarın ve boncukla bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk bloke edici tampon ile hafifçe yeniden süspanse edin (Tablo 2). RT'de 5 dakika inkübe edin.
    8. Süpernatanı manyetik bir raf kullanarak çıkarın ve boncukla bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın (Tablo 2). İkinci yıkama sırasında, boncukla bağlı çekirdekleri 1.5 mL'lik tüplere eşit olarak bölün. Her tüp, bir sonraki adımda spesifik bir antikor ile tedavi edilecektir.
      NOT: Bu örnekte, 250 μL boncuk bağlı çekirdek, dört adet 1.5 mL tüpe bölünmüştür.
    9. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir raf kullanarak ayırın ve bir pipetle aspire edin. Çekirdek/boncuk komplekslerini spesifik bir primer antikor (Tablo 3) veya 250 μL soğuk yıkama tamponu içinde seyreltilmiş başka bir türün IgG'si (burada tavşan) ile nazikçe yeniden süspanse edin. Hafif çalkalama ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Burada kullanılan antikorlar AR, H3K4me2 ve H3K27ac'ye yöneliktir.
    10. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir rafla çıkarın, boncuk bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve 100 μL soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
    11. Protein A-mikrokok nükleazını soğuk yıkama tamponu numunesi başına 100 μL'de 1.4 ng / μL'de seyreltin.
    12. 3.1.11'de elde edilen 100 μL numuneye 100 μL protein A-mikrokok nükleaz ekleyin ve çalkalama ile 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    13. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir rafla çıkarın, 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve boncuk bağlı çekirdekleri 150 μL soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
    14. DNA bölünmesini başlatmak için, 150 μL numuneye 3 μL 100 mM CaCl2 ekleyin, hafifçe vurarak hızlı bir şekilde karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 150 μL durdurma tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve RNA'yı sindirmek ve DNA parçalarını serbest bırakmak için 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    15. DNA ekstraksiyonu için, numuneleri 16.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    16. Süpernatanı yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın ve pelet ve boncukları atın.
    17. 3 μL %10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 2.5 μL 20 mg/mL proteinaz K ekleyin. 70 °C'de 10 dakika inkübe edin (çalkalamayın).
    18. 300 μL fenol/kloroform/izoamil alkol ekleyin, girdap yapın, 2 mL faz kilitli tüplere aktarın (16.000 x g'da 5 dakika önceden döndürülmüş) ve 4 ° C'de 16.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
    19. Aynı tüpe 300 μL kloroform ekleyin ve 4 °C'de 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı (~ 300 μL) bir pipetle (0.2-1 mL uç hacmi) toplayın ve yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
    20. 1 μL glikojen (20 mg/mL konsantrasyon) ekleyin.
    21. 750 μL %100 etanol ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de çökeltin.
    22. DNA'yı 4 ° C'de 16.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Peleti 1 mL %100 etanol ile yıkayın, 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, 16.000 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve sıvıyı bir pipetle (20-200 μL uç hacmi) çıkarın.
    23. Peleti ~5 dakika havayla kurutun. 25 μL 1 mM Tris-HCl (pH 8) ve 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA; pH 8) içinde yeniden süspanse edin.
  2. Biyoinformatik analizi
    1. İmmünokparçalanmış DNA'dan kütüphaneler hazırlayın ve bunları açıklandığı gibi genomik platformun yardımıyla eşleştirilmiş uç 100 bp okumaları olarak sıralayın16.
    2. ENCODE kara liste bölgesi (V2) ile çakışan okumaları kaldırın ve kalan okumaları iki gruba ayırın: parça boyutu <120 bp (nükleozom olmadan, genel olarak transkripsiyon faktörleri için) ve parça boyutu >150 bp (nükleozomlarla, normalde histon işaretleri için). Papyon 2 (v2.3.4.3)17 kullanarak mm10 referans genomuna eşleyin.
    3. bamCoverage ile bigwig dosyaları oluşturun (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Daha fazla analiz için benzersiz bir şekilde eşlenmiş okumaları saklayın.
    5. genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0) ile ham bedgraph dosyaları oluşturun.
    6. Yoğun arama için SEACR 1.3 algoritmasını (sıkı seçenek) kullanın. Hedef veri bedgraph dosyasını, sıfır sinyal içeren bölgeleri atlayan UCSC bedgraph biçiminde yükleyin ve tepe çağrısı18 için ampirik bir eşik oluşturmak üzere kontrol (IgG) veri bedgraph dosyasını kontrol edin.
    7. Örnekler arasındaki benzerliği belirlemek için derin araçlarla bir Pearson korelasyon analizi yapın19. Komut satırını kullanın multiBamSummary bölmeleri --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, ardından plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Okuma Sayılarının Pearson Korelasyonu" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Genom çapında yoğunluk profillerini IGV20 ile yatak grafiği dosyalarını ve SEACR'den elde edilen yatak dosyası piklerini kullanarak görselleştirin.
    9. Tepe açıklama ve motif araması için HOMER'ı kullanın21.
    10. Son olarak, IGV'de görselleştirmek için veri kümelerini ChIP-Atlas Peak tarayıcısıyla daha önce yayınlanmış olanlarla karşılaştırın ve/veya SEACR tarafından oluşturulan yatak dosyalarını girdi veri kümesi olarak kullanarak zenginleştirme analiziyapın 22.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare iskelet kaslarından uydu hücreleri, Gunther ve ark. (bundan sonra Protokol 1)12 ve Liu ve ark.23 (bundan sonra Protokol 2 olarak anılacaktır). Protokol 1'de önerilen kollajenaz ve dispas konsantrasyonu kullanılırken sindirimden sonra sindirilmemiş kas lifleri gözlendiğinden, adım 1.2.1 ve 1.2.3'te açıklandığı gibi kas lifi ayrışmasını iyileştirmek için enzim miktarı arttırılmıştır. Protokol 2'de belirtildiği gibi, numuneler hücre canlılığını korumak için bir su banyosu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, fare uydu hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış, güvenilir ve gerçekleştirmesi kolay bir yöntemin yanı sıra CUT & RUN yöntemi ile transkripsiyonel regülasyonun değerlendirilmesini bildirmektedir.

Bu protokol birkaç kritik adımı içerir. Birincisi, çok sayıda toplanan hücreyi sağlamak için kas bozulması ve lif sindirimidir. Artan enzim konsantrasyonuna rağmen, Protokol 1 kullanılandan daha fazla canlı hücre elde edildi. Uydu hücreleri, çeşitli zar proteinlerinin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mükemmel teknik yardım sağladığı için Anastasia Bannwarth'a teşekkür ederiz. IGBMC hayvan barınağı tesisine, hücre kültürüne, Fare Klinik Enstitüsü'ne (ICS, Illkirch, Fransa), görüntülemeye, elektron mikroskobuna, akış sitometrisine ve 'France Génomique' konsorsiyumunun (ANR-10-INBS-0009) bir üyesi olan GenomEast platformuna teşekkür ederiz.

Strazburg Üniversitesi, CNRS ve Inserm'in ITI 2021-2028 programının bir parçası olarak Disiplinlerarası Tematik Enstitüsü IMCBio'nun bu çalışması, Geleceğe Yönelik Fransız Yatırımları Programı çerçevesinde IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ve SFRI-STRAT'US projesi (ANR 20-SFRI-0012) ve EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) tarafından desteklenmiştir. INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon stratejik programı 24376 (DD'ye), INSERM genç araştırmacı hibesi (DD'ye), ANR-10-LABX-0030-INRT ve ANR tarafından Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) çerçeve programı kapsamında yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından ek finansman sağlandı. J.R., Université franco-allemande ve Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation'dan CDFA-07-22 Programı ve K.G. Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikrotüpEppendorf2080422
2 mL mikrotüpStar LabS1620-2700
5 mL tüplerCORNING-FALCON352063
50 mL tüplerFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acAktif Motif39133
anti-H3K4me2Aktif Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM< / sup>553673
BoncukPolysciences86057-3BioMag ® Plus Concanavalin A
Hücre Süzgeci 100 & mCorning®  
Hücreli Süzgeç 40 & mCorning®  431750
Hücre Süzgeci 70 & mCorning®  
Santrifüj 1Eppendorf521-0011Santrifüj 5415 R
Santrifüj 2Eppendorf5805000010Santrifüj 5804 R
Hazneli Slayt Sistemi ThermoFischer171080Systè ben Nunc&ticaret; Lab-Tek ve ticaret; Hazne Slayt
Temizleme maddesiSigma   SLBQ7780VRNaseZAPTM
Kollajenaz, tip I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase KÖK HÜCRE teknolojileri79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Sabitlenebilir Canlılık LekesiBD Biosciences565388
Akış sitometresiBD FACSAria™ Füzyon Akış Sitometresi23-14816-01
Invitrogen00-4959-52ile Fluoromount G
&IGV
http://software.broadinstitute.org/software/igv/ Gliserol Sigma-AldrichG9012
HidrojelCorning®  354277Matrigel hESC onaylı matris
Görüntü işleme yazılımıImage J®V 1.8.0
Laboratuvar filmiSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberaz LTRoche5401020001
Propil gallatSigma-Aldrich2370
Sıralayıcı Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Sallanan su banyosuBiyoblok Bilimsel polytest 2018724
431752431751DAPI Genom tarayıcısı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366(2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35(2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CUT And RUNFACS zolasyonuFare Uzuv KasKromatin KesimiGenom Boyu AnalizTranskripsiyon Fakt r Ba lanmasHiston ModifikasyonlarKas K k H creleriCistrom Analizi

İlgili makaleler