Yöntem makalesi

Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

8.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65232

⸱

9 Haziran 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Özet

Yüksek kaliteli fare dorsal kök ganglionu (DRG) kriyostat kesitleri, enflamatuar ve nöropatik ağrı, kaşıntı ve diğer periferik nörolojik durumların araştırılmasında uygun immünokimya boyama ve RNAscope çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, DRG dokusunun küçük numune boyutu nedeniyle cam slaytlar üzerinde tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat bölümleri elde etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şimdiye kadar, DRG kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale bulunmamaktadır. Bu protokol, DRG kriyoseksiyonu ile ilgili sık karşılaşılan zorlukları çözmek için adım adım bir yöntem sunar. Sunulan makale, DRG doku örneklerinden çevreleyen sıvının nasıl çıkarılacağını, DRG bölümlerinin aynı yöne bakacak şekilde slayt üzerine nasıl yerleştirileceğini ve cam slayt üzerindeki bölümlerin yukarı kıvrılmadan nasıl düzleştirileceğini açıklamaktadır. Bu protokol DRG örneklerinin kriyoseksiyonu için geliştirilmiş olmasına rağmen, küçük bir örnek boyutuna sahip diğer birçok dokunun kriyokesiti için uygulanabilir.

Giriş

Dorsal kök ganglionu (DRG), birincil duyusal nöronları, doku makrofajlarını ve birincil duyusal nöronları çevreleyen uydu hücreleriniiçerir 1,2,3,4. Zararsız ve zararlı sinyallerin işlenmesinde önemli bir anatomik yapıdır ve ağrı, kaşıntı ve çeşitli periferik sinir bozukluklarında kritik rol oynar 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Fare omuriliğinden DRG dokusunu incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiş olsa da14,15,16, DRG dokusu oldukça küçük olduğundan ve DRG örneklerinin kriyostat bölümleri rulolar halinde kıvrılma eğiliminde olduğundan DRG dokusunun kriyoseksiyonu zor olmaya devam etmektedir, bu da kriyostat bölümlerinin cam slaytlara düzgün bir şekilde aktarılmasını zorlaştırır. Bununla birlikte, DRG dokusunun uygun kriyoseksiyonu, immünohistokimya çalışmaları ve DRG duyusal nöronlarının yapısı için çok önemlidir 17,18,19,20,21,22,23. Ayrıca, tek hücreli RNA dizileme sonuçları, hem insanlarda24 hem de farelerde25 DRG duyusal nöronlarının dikkate değer heterojenliğini ortaya çıkardığından, DRG dokusunun uygun şekilde kriyoseksiyonu, çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda farklı DRG hücrelerinin fonksiyonel rolünü araştırmak için kritik öneme sahiptir.

DRG'nin kriyoseksiyonunun alternatif bir tekniği olarak DRG26'nın 3D rekonstrüksiyonunu araştırmak için doku temizleme tekniği uygulanmış olsa da, doku temizleme tekniği zaman ve emek alıcıdır. Buna karşılık, DRG'nin kriyoseksiyonu hızlı ve nispeten kolaydır ve bu nedenle DRG'nin ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinin immünohistokimyası ve yapı çalışmaları için anahtar bir teknik olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, cam slaytlar üzerine yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat kesitleri elde etmek, DRG ve belirli beyin bölgeleri gibi dokuların küçük örneklem boyutu nedeniyle sinirbilim araştırmalarında bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bu noktada fare DRG'leri gibi küçük boyutlu doku örneklerinin kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale yoktur.

Bu protokol, sonraki DRG çalışmaları için slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde çok sayıda yüksek kaliteli DRG kesiti elde etmek için fare DRG'sinin kriyostat kesiti için kolay, adım adım bir teknik sağlar. DRG numunelerinin kriyoseksiyonu için özel olarak tasarlanmış olsa da, bu teknik, küçük numune boyutuna sahip diğer çeşitli dokuların kriyoseksiyonu için potansiyel olarak kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma için, hayvan deneyleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütüldü. Burada yetişkin, 8-12 haftalık C57BL / 6 erkek ve dişi fareler (evde yetiştirilmiş) kullanıldı.

1. DRG numune hazırlama

  1. Fareleri% 2.5 Avertin ile uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). Ağrılı stimülasyona yanıt verilmemesi nedeniyle yeterli anestezi sağlayın. Hayvanları transkardiyal olarak 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından daha önce tarif edildiği gibi %4 formaldehit ile perfüze edin14,15,16.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi omurilikten DRG dokusunu inceleyin14,15,16.
  3. Diseke edilen DRG'leri oda sıcaklığında 3 saat boyunca% 4 formaldehit içinde sabitleyin.
  4. DRG'leri gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 30 sükroz içine koyun.
  5. Temel optimum kesme sıcaklığının (OCT) hazırlanması
    1. Alüminyum bloğun üst yüzeyini kaplamak için OCT bileşiğini ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'de 5-10 dakika dondurun (Şekil 1A).
    2. Kriyostatı kullanarak OCT'nin üst kısmını (Malzeme Tablosuna bakınız) 30 μm kalınlıkta, yüzeyi taban OCT kadar düz olana kadar kesin (Şekil 1B).
    3. Alüminyum bloğu kriyostattan çıkarmadan önce, yönünü işaretlemek için taban OCT'nin altında (saat altı konumunda) bir işaret yapın (Şekil 1C).
    4. Aşağıdaki adımlarda, aynı yönü korumak için işareti saat altı konumunda tutun, bu da DRG örneğinin daha fazla bölümünün elde edilmesini sağlayabilir.
      NOT: Oryantasyon kaybolursa ve DRG numunesi farklı bir açıyla kesilirse, DRG numunesi yukarıdan aşağıya tamamen kesilemez, bu da bazı numunelerin baz OCT'de kalmasına ve boşa gitmesine neden olur, çünkü DRG numunesi kesilmeye çalışılırken baz OCT ile karşılaşılır (Şekil 1C).
  6. DRG'lerin OCT yerleştirmesini gerçekleştirme
    1. DRG dokusunu OCT'ye koymadan önce kurutun.
      1. DRG'yi bloğa eklemeden önce, numunenin etrafındaki %30 sakaroz/PBS solüsyonunu çıkardığınızdan emin olun.
      2. DRG örneğini kuru bir Petri kabına yerleştirerek (Şekil 2A) ve kuru cımbızla iki veya üç kez bir yerden diğerine taşıyarak kurutun (Şekil 2B).
      3. Başka bir DRG örneğini taşımadan önce cımbızı tüy bırakmayan bir bezle kurulayın (Şekil 2C).
    2. Kuru DRG'yi OCT tabanına koyun.
      1. Kuru cımbızla, kuru DRG'yi saat 12 konumunda taban OCT'sine yerleştirin (Şekil 1D).
      2. DRG'nin üst kenarı ile OKT tabanının üst kenarı arasında en az 5 mm mesafe bırakın.
      3. DRG'nin dorsal kısmını saat 12 konumuna ve ventral kısmını saat altı konumuna getirin (Şekil 1D).
    3. DRG dokusunu OCT ile gömün.
      1. DRG ortada olacak şekilde tüm DRG örneğini yuvarlak veya oval bir şekilde kaplamak için daha fazla OCT ekleyin (Şekil 1E).
      2. OCT'nin üst kenarının, taban OCT'nin üst kenarındaki DRG'yi kapladığından emin olun (Şekil 1F), çünkü bu, bölümün cam slayt üzerine aktarılmasını kolaylaştırır (Şekil 3A).
        NOT: Kapak OCT'si taban OCT'nin ortasındaysa, taban OCT'sinin üst kenarı, bölümü toplamak için cam sürgüyü bloke edecektir (Şekil 3B).
      3. Kapak OCT ve DRG örneğini -20 °C'de 5 dakika daha dondurun (Şekil 1G). OCT'yi DRG örneğinin etrafında kesmeyin.
      4. DRG görünene kadar kapağın üst kısmını 30 μm kalınlığında kesin.

2. DRG'nin kriyoseksiyonu

  1. DRG bölümlerini slayt üzerinde kesmek için kriyostat kesit kalınlığını 12 μm olarak değiştirin (Şekil 1H).
  2. OCT bölümünü -20 °C'ye soğutulmuş küçük bir boya fırçası ile altta tutun.
    NOT: Tüm kesitin tamamen kesilmemesi, 1-3 mm'nin kesilmeden bırakılması önemlidir (Şekil 1I).
  3. Platform yüzeyine yapışması için bölümün altına (saat altı konumu) hafifçe dokunmak için oda sıcaklığındaki bir cımbızın ucunu kullanın (Şekil 1J). Bu, bölümün rulo halinde geriye doğru kıvrılmasını önler ve bu da bölümün slaytta toplanmasını zorlaştırır.
    NOT: Bölümün alt kısmı platform yüzeyine yapıştığında ve bölümün üst kısmı hala OCT kapağına bağlandığında, bölüm düz bir şekildedir (Şekil 1K), bu da bölümün slayt üzerinde toplanmasını çok daha kolay hale getirir.
  4. Şarjlı bir cam slayt alın (Malzeme Tablosuna bakın) ve slaytı yavaşça bölümün üzerine yerleştirin. Bölüm slayta yapışmaya başlar başlamaz, slaytı yavaşça geriye doğru çekin (Şekil 1L).
  5. Bölümleri üst üste bindirmeden slayta daha fazla DRG bölümü almak için aynı işlemi uygulayın (Şekil 1M). Yeni bir DRG kesitinin başka bir DRG bölümünün OCT'sinin üzerine yerleştirilmediğinden emin olun (Şekil 4), çünkü böyle bir kesit slayt üzerinde iyi duramaz ve immünokimya boyama işlemi sırasında yıkanabilir.

3. Cam slayt üzerindeki DRG bölümünün Nissl boyaması

  1. Bölümleri PBS artı% 0.1 Triton X-10'da 10 dakika yıkayın. Ardından, bölümleri PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Slayta 1:300 Nissl boyası uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  3. Bölümü PBS artı% 0.1 Triton X-100 ile yıkayın. Ardından, bölümleri PBS ile iki kez 5 dakika ve ardından oda sıcaklığında 2 saat yıkayın.
  4. Bölümleri bir lamel ile kaplamak için 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) floromount-G ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mevcut çalışma, bir fare L4 DRG'den yaklaşık 16 sürekli, yüksek kaliteli DRG bölümü topladı. Elde edilen kesitlerde herhangi bir bozulma yoktu. Şekil 1 , kriyoseksiyon için adım adım prosedürü göstermektedir. Doku kesitlerinden fazla sıvının uzaklaştırılması Şekil 2'de gösterilmiştir. Dokuların OCT gömülmesi süreci Şekil 3'te vurgulanmıştır. Şekil 4 , DRG bölümlerinin cam kızaklar üzerine uygun şekilde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli DRG kesitleri elde etmek için fare DRG'sinin kriyostat kesitleri için adım adım kolay bir prosedür sağlar. Bu protokolde dört kritik adım vardır. İlk olarak, DRG numunesini OCT tabanına koymadan önce DRG numunesi ve cımbız kuru olmalıdır. DRG örneğini çevreleyen herhangi bir sıvı, etrafında bir buz kabuğu oluşturacak ve DRG bölümlerinin OCT'den ayrılmasına ve yukarı doğru kıvrılmasına neden olacaktır. İkincisi, alüminyum bloğun bir işareti yoksa veya ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AvertinSigma-AldrichT48402-25GHayvan
Epredia'yı Anestezi Altına Alın. Kriyotom Kriyostat Kriyokasetleri, 25 mm çap. Çapraz ÇizgiliFisherbrand1910OCT bölümünü altta tutun 
Ergo CımbızFisherbrandS95310Cımbızın ucunu kullanarak tabana hafifçe dokunmak (6 o' saat) bölümün rulo halinde geriye doğru kıvrılmasını önlemek için platform yüzeyine yapışacak şekilde 
Balıkçı markası  Superfrost Plus Mikroskop SlaytlarıFisherbrand1255015DRG bölümünü toplamak için 
İşaretleme kalemleriFisherbrand133794  Baz OCT
Scigen'in yönünü işaretleyin  Doku Artı O.C.T. BileşikFisherbrand  23730571Optimum kesme sıcaklığını (OCT) sağlamak için donmuş doku örnekleri için gömme ortamı.

Kaynaklar

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264(2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752(2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DRG KriyoseksiyonlamaFare DRG KesitleriKriyostat KesitlemeOCT G mmeCam Lam Haz rlamamm nohistokimyasal BoyamaRNAscope al malarKonfokal MikroskopiPeriferik N rolojik Durumlar

İlgili makaleler