Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Özet

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Özet

Yüksek kaliteli fare dorsal kök ganglionu (DRG) kriyostat kesitleri, enflamatuar ve nöropatik ağrı, kaşıntı ve diğer periferik nörolojik durumların araştırılmasında uygun immünokimya boyama ve RNAscope çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, DRG dokusunun küçük numune boyutu nedeniyle cam slaytlar üzerinde tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat bölümleri elde etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şimdiye kadar, DRG kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale bulunmamaktadır. Bu protokol, DRG kriyoseksiyonu ile ilgili sık karşılaşılan zorlukları çözmek için adım adım bir yöntem sunar. Sunulan makale, DRG doku örneklerinden çevreleyen sıvının nasıl çıkarılacağını, DRG bölümlerinin aynı yöne bakacak şekilde slayt üzerine nasıl yerleştirileceğini ve cam slayt üzerindeki bölümlerin yukarı kıvrılmadan nasıl düzleştirileceğini açıklamaktadır. Bu protokol DRG örneklerinin kriyoseksiyonu için geliştirilmiş olmasına rağmen, küçük bir örnek boyutuna sahip diğer birçok dokunun kriyokesiti için uygulanabilir.

Giriş

Dorsal kök ganglionu (DRG), birincil duyusal nöronları, doku makrofajlarını ve birincil duyusal nöronları çevreleyen uydu hücrelerini^içerir 1,2,3,4. Zararsız ve zararlı sinyallerin işlenmesinde önemli bir anatomik yapıdır ve ağrı, kaşıntı ve çeşitli periferik sinir bozukluklarında kritik rol oynar 5,6,7,8,9,10,11,12,13.

Protokol

Bu çalışma için, hayvan deneyleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütüldü. Burada yetişkin, 8-12 haftalık C57BL / 6 erkek ve dişi fareler (evde yetiştirilmiş) kullanıldı.

1. DRG numune hazırlama

1. Fareleri% 2.5 Avertin ile uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). Ağrılı stimülasyona yanıt verilmemesi nedeniyle yeterli anestezi sağlayın. Hayvanları transkardiyal olarak 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından daha önce tarif edildiği gibi %4 formaldehit ile perfüze edin

Sonuçlar

Mevcut çalışma, bir fare L4 DRG'den yaklaşık 16 sürekli, yüksek kaliteli DRG bölümü topladı. Elde edilen kesitlerde herhangi bir bozulma yoktu. Şekil 1 , kriyoseksiyon için adım adım prosedürü göstermektedir. Doku kesitlerinden fazla sıvının uzaklaştırılması Şekil 2'de gösterilmiştir. Dokuların OCT gömülmesi süreci Şekil 3'te vurgulanmıştır. Şekil 4 , DRG bölümlerinin cam kızaklar üzerine uygun şekilde .......

Tartışma

Bu protokol, slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli DRG kesitleri elde etmek için fare DRG'sinin kriyostat kesitleri için adım adım kolay bir prosedür sağlar. Bu protokolde dört kritik adım vardır. İlk olarak, DRG numunesini OCT tabanına koymadan önce DRG numunesi ve cımbız kuru olmalıdır. DRG örneğini çevreleyen herhangi bir sıvı, etrafında bir buz kabuğu oluşturacak ve DRG bölümlerinin OCT'den ayrılmasına ve yukarı doğru kıvrılmasına neden olacaktır. İkincisi, alüminyum bloğun bir işareti yoksa veya ta.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Hayvan
Epredia'yı Anestezi Altına Alın. Kriyotom Kriyostat Kriyokasetleri, 25 mm çap. Çapraz Çizgili	Fisherbrand	1910	OCT bölümünü altta tutun
Ergo Cımbız	Fisherbrand	S95310	Cımbızın ucunu kullanarak tabana hafifçe dokunmak (6 o' saat) bölümün rulo halinde geriye doğru kıvrılmasını önlemek için platform yüzeyine yapışacak şekilde
Balıkçı markası  Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Fisherbrand	1255015	DRG bölümünü toplamak için
İşaretleme kalemleri	Fisherbrand	133794	Baz OCT
Scigen'in yönünü işaretleyin  Doku Artı O.C.T. Bileşik	Fisherbrand	23730571	Optimum kesme sıcaklığını (OCT) sağlamak için donmuş doku örnekleri için gömme ortamı.