Method Article

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

DOI:

10.3791/65236

⸱

May 5th, 2023

 ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Institute of Genetics and Biotechnology, University of Warsaw, 2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel süreçlerin büyük çoğunluğu, en yaygın taşıyıcısı ATP molekülü olan sürekli bir enerji kaynağı gerektirir. Ökaryotik hücreler ATP'lerinin çoğunu mitokondride oksidatif fosforilasyon ile üretirler. Mitokondri eşsiz organellerdir, çünkü kopyalanan ve yeni nesil hücrelere aktarılan kendi genomlarına sahiptirler. Nükleer genomun aksine, hücrede mitokondriyal genomun birden fazla kopyası vardır. Mitokondriyal genomun replikasyonu, onarımı ve bakımından sorumlu mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesi, mitokondri ve tüm hücrelerin hem normal hem de hastalık koşulları altında düzgün çalışmasını anlamak için gereklidir. Burada, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mitokondriyal DNA'nın (mtDNA) sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) katılımı ile etiketlenmiş aktif olarak sentezlenmiş DNA moleküllerinin immünofloresan tespitine ve tüm mtDNA moleküllerinin anti-DNA antikorları ile eşzamanlı olarak tespit edilmesine dayanmaktadır. Ek olarak, mitokondri spesifik boyalar veya antikorlarla görselleştirilir. Hücrelerin çok kuyucuklu bir formatta kültürlenmesi ve otomatik bir floresan mikroskobunun kullanılması, mtDNA'nın dinamiklerini ve mitokondrinin morfolojisini nispeten kısa sürede çeşitli deneysel koşullar altında incelemeyi kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu ökaryotik hücre için mitokondri, çok sayıda hücresel süreçte çok önemli bir rol oynadıkları için temel organellerdir. Her şeyden önce, mitokondri, hücre1'in kilit enerji tedarikçileridir. Mitokondri ayrıca hücresel homeostazın (örneğin, hücre içi redoks2 ve kalsiyum dengesi3), hücre sinyalizasyonu 4,5, apoptoz6, farklı biyokimyasal bileşiklerin sentezi 7,8 ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisi9'un düzenlenmesinde rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon çeşitli patolojik durumlar ve insan hastalıkları ile ilişkilidir10.

Mitokondrinin işleyişi iki ayrı genomda bulunan genetik bilgiye bağlıdır: nükleer ve mitokondriyal genomlar. Mitokondriyal genom, nükleer genoma kıyasla az sayıda geni kodlar, ancak mtDNA ile kodlanmış tüm genler insan yaşamı için gereklidir. MtDNA'yı korumak için gerekli mitokondriyal protein mekanizması nDNA tarafından kodlanır. Mitokondriyal replisomenin temel bileşenleri ve bazı mitokondriyal biyogenez faktörleri zaten tanımlanmıştır (önceki araştırmalarda gözden geçirilmiştir11,12). Bununla birlikte, mitokondriyal DNA replikasyonu ve bakım mekanizmaları hala anlaşılmaktan uzaktır. nDNA'nın aksine, mitokondriyal genom, mitokondriyal gen ekspresyonunu düzenlemek için ek bir katman sağlayan çoklu kopyalarda bulunur. Şu anda mtDNA'nın organeller içindeki dağılımı ve ayrışması, bu süreçlerin ne ölçüde düzenlendiği ve eğer öyleyse, hangi proteinlerin dahil olduğu hakkında çok daha az şey bilinmektedir13. Ayrışma paterni, hücreler karışık bir vahşi tip ve mutasyona uğramış mtDNA popülasyonu içerdiğinde çok önemlidir. Eşit olmayan dağılımları, zararlı miktarda mutasyona uğramış mtDNA'ya sahip hücrelerin oluşumuna yol açabilir.

Şimdiye kadar, mtDNA'nın korunması için gerekli protein faktörleri esas olarak biyokimyasal yöntemler, biyoinformatik analizler veya hastalıkla ilişkili çalışmalar yoluyla tanımlanmıştır. Bu çalışmada, daha önce tanımlamadan kaçan faktörleri belirleme şansının yüksek olmasını sağlamak için farklı bir strateji tanımlanmıştır. Yöntem, timidinin bir nükleozid analoğu olan 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) ile replikasyon veya onarım sırasında mtDNA'nın etiketlenmesine dayanır. BrdU, DNA sentezi sırasında ortaya çıkan DNA iplikçiklerine kolayca dahil edilir ve genel olarak nükleer DNA14'ün replikasyonunu izlemek için kullanılır. Bununla birlikte, burada geliştirilen prosedür, anti-BrdU antikorlarının immünofloresansını kullanarak mtDNA'ya dahil edilen BrdU'yu tespit etmek için optimize edilmiştir.

Bu yaklaşım, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mtDNA sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin verir. Farklı deney koşulları altında testleri nispeten kısa sürede yapmak için yüksek verimli bir strateji gereklidir; Bu nedenle, protokolde hücre kültürü için çok kuyucuklu bir format ve görüntüleme için otomatik floresan mikroskobu kullanılması önerilmektedir. Protokol, insan HeLa hücrelerinin bir siRNA kütüphanesi ile transfeksiyonunu ve daha sonra BrdU ile yeni sentezlenen DNA'nın metabolik etiketlenmesini kullanarak mtDNA replikasyonunun veya onarımının izlenmesini içerir. Bu yaklaşım, anti-DNA antikorlarının yardımıyla DNA'nın immün boyanması ile birleştirilir. Her iki parametre de kantitatif floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir. Ek olarak, mitokondri belirli bir boya ile görselleştirilir. Protokolün özgüllüğünü göstermek için, BrdU boyaması, mtDNA'dan (rho0 hücreleri) yoksun hücrelerde, iyi bilinen mtDNA bakım faktörlerinin susturulması üzerine HeLa hücrelerinde ve bir mtDNA replikasyon inhibitörü ile tedaviden sonra HeLa hücrelerinde test edildi. MtDNA seviyeleri ayrıca bağımsız bir yöntemle, yani qPCR ile ölçüldü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SiRNA karışımının hazırlanması

  1. Deneyin başlamasından bir gün önce, tohum hücreleri (örneğin, HeLa) 100 mm'lik bir tabakta ertesi gün% 70 -% 90 birleşime ulaşacak şekilde toplanır.
    NOT: Tüm işlemler laminer akış odasında steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
  2. Opti-MEM ortamında 140 nM'lik bir konsantrasyona seyreltilmiş uygun miktarda siRNA hazırlayın ( bkz. 96 delikli bir plaka rezervuar olarak kullanılabilir.
  3. Siyah 384 delikli hücre kültürü mikroplakasının her bir kuyucuğuna 5 μL siRNA çözeltisi (veya kontrol numuneleri için Opti-MEM ortamı) ekleyin.
    NOT: Test edilen siRNA numunelerinin sayısına bağlı olarak, elektronik veya çok kanallı pipet kullanılabilir.
  4. Opti-MEM ortamında uygun miktarda RNAiMAX transfeksiyon reaktif çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her 100 μL ortam için 1 μL RNAiMAX ekleyin.
  5. 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL transfeksiyon reaktif çözeltisi ekleyin. Bunu yapmanın en uygun ve en hızlı yolu bir reaktif dağıtıcısıdır.
  6. SiRNA'yı transfeksiyon reaktifi ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

2. Transfeksiyon için hücrelerin hazırlanması

  1. Kuluçka sırasında (adım 1.6), bir emme cihazı kullanarak ortamı aspire edin (bakınız Malzeme Tablosu) ve hücreleri 3 mL PBS ile yıkayın.
  2. PBS'de 1:2 oranında seyreltilmiş 1.5 mL tripsin ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin; eğer öyleyse,% 10 FBS ile 3 mL DMEM ortamı ekleyin. Hücreleri iyice askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Süspansiyonun en az 150 μL'sini alın ve bir hücre sayma odasındaki hücreleri sayın (bkz.
  4. DMEM ortamında% 10 FBS, penisilin ve streptomisin ile uygun konsantrasyonda (HeLa hattı için 35.000 / mL) bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

3. Hücre transfeksiyonu

  1. Reaktif dağıtıcıyı kullanarak 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Bu, kuyu başına tohumlanan 700 hücre ile sonuçlanacaktır.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve ardından inkübatöre 72 saat (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.

4. BrdU kuruluşu

  1. DMEM ortamında% 10 FBS ile 90 μM'lik bir BrdU çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. SiRNA transfeksiyonundan 56 saat sonra (hücre fiksasyonundan 16 saat önce), 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL 90 μM BrdU çözeltisi ekleyin (nihai BrdU konsantrasyonu 20 μM'dir).
    NOT: Eylem mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir; Bu nedenle, bir reaktif dağıtıcı, elektronik pipet veya çok dağıtıcılı pipet kullanmak en iyisidir. BrdU eklemeden kontrol kuyuları hazırlamayı unutmayın.
  3. Hücreleri 16 saat boyunca inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2).

5. Mitokondrinin etiketlenmesi

  1. DMEM'de% 10 FBS ile 20 μM'lik bir BrdU çözeltisi hazırlayın ve buna mitokondri izleme boya çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1.1 μM'lik bir konsantrasyona ekleyin.
  2. BrdU birleşmesinin başlamasından 15 saat sonra (hücre fiksasyonundan 1 saat önce), 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL mitokondri izleme boya çözeltisi ekleyin (bkz.
    NOT: Bir reaktif dağıtıcısı, elektronik pipet veya çok dağıtıcılı pipet kullanın. BrdU ilavesi olmadan ancak mitokondri izleme boyasının eklenmesiyle kontrol kuyularını korumayı unutmayın.
  3. Hücreleri 1 saat boyunca inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2).

6. Hücre fiksasyonu

NOT: Tüm yıkama en uygun şekilde bir mikroplaka yıkayıcı kullanılarak gerçekleştirilirken, reaktiflerin eklenmesi en hızlı şekilde bir reaktif dağıtıcısı kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Mikroplaka yıkayıcıyı kullanarak ( bkz. Malzeme Tablosu), her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile iki kez durulayın. İkinci yıkamadan sonra, kuyuda 25 μL PBS bırakın.
    NOT: PBS'yi kuyuda bırakmak, bir sonraki adımda sıvı ilavesi sırasında hücre ayrılma olasılığını azaltır. Tüm yıkamalar PBS bırakılarak tamamlanır; bu nedenle, bir sonraki adımda eklenen çözelti, kalan PBS'ye eşit hacimde ekleneceği için her zaman 2x konsantrasyonda hazırlanmalıdır.
  2. PBS'de %0,4 Triton X-100 ve Hoechst 33342 ile 4 μg/mL konsantrasyonda 25 μL% 8'lik bir formaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitleyin (bireysel reaktiflerin nihai konsantrasyonları sırasıyla% 4,% 0,2 ve 2 μg / mL'dir ) (bkz.
  3. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

7. Engelleme

  1. Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 25 μL PBS bırakın.
  2. Her bir oyuğa PBS'de 25 μL% 6 BSA ekleyin (nihai BSA konsantrasyonu% 3'tür).
  3. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

8. Primer antikorların eklenmesi

  1. BSA'yı bir mikroplaka yıkayıcı kullanarak aspire edin ve kuyuda 10 μL çözelti bırakın.
  2. PBS'de% 3 BSA'da hazırlanan primer antikor çözeltisinden 10 μL ekleyin. 0.8 μg / mL'de anti-BrdU ve 0.4 μg / mL'de anti-DNA kullanın (antikorların nihai konsantrasyonları sırasıyla 0.4 μg / mL ve 0.2 μg / mL'dir) ( bkz.
  3. Plakayı karanlıkta gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.

9. İkincil antikorların eklenmesi

  1. Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 10 μL PBS bırakın.
  2. PBS'de% 6 BSA'da hazırlanan 4 μg / mL ikincil antikor çözeltisinden 10 μL ekleyin (nihai konsantrasyon 2 μg / mL'dir). Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 555 gibi florokromlara konjuge edilmiş izotipe özgü antikorlar (anti-fare IgG1 ve anti-fare IgM) kullanın (bkz.
  3. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 50 μL PBS bırakın.
  5. Plakayı yapışkan bir sızdırmazlık filmi ile kapatın (bakınız Malzeme Tablosu) ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Görüntüleme 2 hafta içinde yapılmalıdır.

10. Görüntüleme

NOT: Görüntüleme otomatik geniş alan mikroskobu ile yapılmalıdır; Mikroskop, plakanın tek tek alanlarını otomatik olarak görüntülemek için kontrollerle donatılmış bir motor aşaması ile donatılmalıdır.

  1. Plakanın köşe alanlarındaki (A1, A24, P24, P1 kuyuları) ve ortadaki otomatik netleme ayarlarını kontrol edin.
    NOT: Görüntüleme için, mümkün olan en yüksek sayısal açıklığa sahip 20x kısa çalışma mesafesi hedefi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılması önerilir.
  2. Canlı görüntü modunda görüntüleme yazılımı tarafından oluşturulan yoğunluk histogramlarına bağlı olarak, elde edilen görüntünün aşırı doygun olmaması için her bir floresan kanalı için yeterince uzun bir pozlama süresi seçin.
  3. Z ekseninde görüntüleme için uygun düzlem sayısını ayarlayın.
    NOT: 20x büyütmedeki görüş alanı, tüm hücrelerin aynı odak düzleminde olmayacağı kadar büyüktür, bu nedenle tüm hücreleri doğru odak düzleminde görüntülemek için z kesiti yapılmalıdır. Genellikle beş uçak yeterlidir. Disk alanının kullanılabilirliğine bağlı olarak, tek tek z yığınları veya yalnızca maksimum yoğunluk projeksiyonları kaydedilebilir. Temsili sonuçlar bölümünde gösterilen görüntü analizi, maksimum yoğunluk projeksiyonlarına dayanmaktadır.
  4. Kuyu başına görüntülenecek uygun sayıda görüş alanı seçin.
    NOT: Birleşime bağlı olarak, bir görüş alanında yaklaşık 60-300 hücre görüntülenebilir. Tipik olarak,% 60 -% 90'lık bir birleşime sahip HeLa hücreleri için, beş görüş alanını görüntülemek, birinin 500 hücreden 1.000'den fazla hücreye analiz etmesine izin verecektir.
  5. Görüntülenecek kuyucukları seçin ve görüntülemeye başlayın.

11. Kantitatif görüntü analizi

NOT: Elde edilen görüntülerin nicel analizi, Cell Profiler15 gibi açık kaynaklı bir yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışma için analiz ScanR 3.0.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz.

  1. Tüm floresan kanallarından gelen tüm görüntüler için arka plan düzeltmesi yaparak analize başlayın. Analiz edilen nesnelerin boyutuna bağlı olarak, uygun filtre boyutunu seçin: hücre çekirdekleri için 80 piksel ve BrdU ve mtDNA lekeleri için 4 piksel.
  2. Floresan sinyalinin yoğunluğunun hücre çekirdeğine karşılık gelen kanalın arka planına oranına bağlı olarak ana nesnenin bir maskesini oluşturarak görüntüyü bölümlere ayırmaya başlayın.
  3. Verilen yapılara uygun floresan kanallarını kullanarak sırasıyla BrdU ve mtDNA lekelerini temsil eden alt nesneler için maskeler oluşturun.
    NOT: Her alt nesne en yakın ana nesneye (hücre çekirdeği) atanır.
  4. Analiz sırasında ölçülecek parametreleri ayarlayın ve tüm floresan kanalları için her maskedeki ayrı piksellerin yoğunluğunu ölçün.
    NOT: Belirli bir hücre çekirdeğine atanan alt nesnelerin sayısını ve her bir alt nesnenin alanını hesaplamak da gereklidir.
  5. Elde edilen verilere dayanarak hesaplanacak türetilmiş parametreleri tanımlayın. BrdU veya mtDNA kanalı için toplam floresan yoğunluklarını elde etmek için, belirli bir hücre çekirdeğine atanan tüm alt nesnelerin yoğunluklarını toplayın. Ortalama floresan yoğunluğunu elde etmek için, toplam floresan yoğunluğunu, belirli bir hücre çekirdeğine atanan alt nesnelerin alanının toplamına bölün.
    NOT: Oluşturulan alt nesnenin (BrdU veya mtDNA noktası) aslında mitokondride bulunduğundan emin olmak için, mitokondri izleme boyasından gelen floresan yoğunluğuna göre bunları geçmek gerekir.
  6. Aşağıdaki paketlerle birlikte R 4.2.2 istatistik Yazılımı16'yı kullanarak ScanR yazılımı ile elde edilen verilerin daha fazla analizini yapın: dplyr 17, data.table 18, ggplot2 19 ve ggpubr20. Bu adım isteğe bağlıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mtDNA sentezi ve dağılımının dinamiklerinin yüksek verimli çalışması için prosedürün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Çok kuyucuklu plaka formatının kullanılması, bir siRNA kütüphanesi kullanılarak farklı genlerin susturulması gibi birçok farklı deneysel koşulun eşzamanlı analizini sağlar. Yeni sentezlenen DNA moleküllerinin BrdU ile etiketlenmesi için kullanılan koşullar, HeLa hücrelerinin mitokondrilerinde BrdU etiketli DNA'nın tespit edilmesine izin verir (Şekil ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarihsel olarak, BrdU birleştirme ve antikor tespiti ile DNA etiketleme, nükleer DNA replikasyonu ve hücre döngüsü araştırmalarında kullanılmıştır 14,27,28. Şimdiye kadar, BrdU etiketli DNA'yı tespit etmek için tüm protokoller, epitop maruziyetini sağlamak ve antikor penetrasyonunu kolaylaştırmak için bir DNA denatürasyon adımı (asidik veya termal) veya enzim sindirimi (DNaz veya proteinaz) içermektedir. Bu protokoller sıkıca pa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklenmiştir (Hibe/Ödül Numarası: 2018/31/D/NZ2/03901).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2&asal;,3′-Dideoksisitidin (ddC)Sigma-AldrichD5782
384  Kuyu Hücre Kültürü Mikroplakaları, siyahGreiner Bio-One# 781946
5-Bromo-2 & prime; -deoksiüridin (BrdU)Sigma-AldrichB5002-1GBrdU tozunu suda 20 mM stok çözeltisine ve alikotta çözün. 20 ve mikro kullanın; Etiketleme için M BrdU çözümü.
Yapışkan sızdırmazlık filmiNerbe Plus04-095-0060
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG1 ikincil antikoruThermo Fisher ScientificA-21121
Alexa Fluor 555 keçi anti-fare IgM ikincil antikoruThermo Fisher ScientificA-21426
BioTek 405 LS mikroplaka yıkayıcıAgilent
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA4503
Hücre sayma odası ThomaHeinz HerenzREF:1080339
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)CytivaSH30243.01
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965-062
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific10270-106
Formaldehit çözeltisiSigma-AldrichF1635Formaldehit toksiktir; Lütfen güvenlik bilgi formunu dikkatlice okuyunuz.
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IgG1 fare monoklonal anti-BrdU (IIB5) birincil antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-32323
IgM fare monoklonal anti-DNA (AC-30-10) birincil antikoruProgen# 61014
LightCycler 480 SistemiRoche
Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon ReaktifiTermo Fisher Scientific# 13778150
MitoTracker Koyu Kırmızı FMThermo Fisher ScientificM22426Mitokondri izleme boyası 
Multidrop Kombi Reaktif DispenseriThermo Fisher Scientific
Opti-MEMThermo Fisher Scientific51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD KameraHamamatsu
Penisilin-Streptomisin Sigma-AldrichP0781-100ML
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-AldrichP4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
qPCR astar Fw B2M (referans)CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (referans gen)GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1 TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR astar Fw POLGTGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR astar Fw TFAMGATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR astar Fw TWNKGCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR astar Rev B2M (referans)GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (referans gen)AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1 ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR astar Rev POLGGGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR astar Rev TFAMGGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR astar Rev TWNKAACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR mikroskobuOlympus
siRNA CtrlDharmaconD-001810-10-5
siRNA POLGCanlandırıcıPOLGHSS108223
siRNA TFAMInvitrogenTFAMHSS144252
siRNA TWNKInvitrogenC10orf2HSS125597
Aspirasyon cihazıNeoLab2-9335Hücre kültürü için aspirasyon cihazı
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500ML
TripsinBiowestL0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objektifOlimpos

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
  2. Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284(2019).
  3. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102(2020).
  6. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  7. Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
  8. Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579(2020).
  9. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  10. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  11. Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
  12. Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
  13. Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
  14. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  15. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
  17. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
  18. Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
  19. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
  20. Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
  21. Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
  22. Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
  23. Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
  24. Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
  25. Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
  26. Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
  27. Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
  28. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
  29. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  30. Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNADNA SynthesisHigh Throughput ImagingImage QuantificationImmunofluorescence DetectionBrdU IncorporationMitochondrial DistributionAutomated MicroscopysiRNA TransfectionFluorescence Microscopy

Related Articles