Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Özet

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Özet

Merkezi metabolizmadan nörodejenerasyona karşı bağışıklık tepkisine kadar çoğu fizyolojik ve hastalık süreci mitokondri içerir. Mitokondriyal proteom 1.000'den fazla proteinden oluşur ve her birinin bolluğu dış uyaranlara yanıt olarak veya hastalığın ilerlemesi sırasında dinamik olarak değişebilir. Burada, yüksek kaliteli mitokondrileri birincil hücrelerden ve dokulardan izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. İki aşamalı prosedür, (1) ham mitokondrileri izole etmek için mekanik homojenizasyon ve diferansiyel santrifüjleme ve (2) saf organelleri izole etmek ve kirleticileri ortadan kaldırmak için mitokondrinin etiketsiz bağışıklık yakalamasını içerir. Her saflaştırma aşamasındaki mitokondriyal proteinler kantitatif kütle spektrometrisi ile analiz edilir ve zenginleştirme verimleri hesaplanır, böylece yeni mitokondriyal proteinlerin çıkarılabilir proteomiklerle keşfedilmesine izin verilir. Protokolümüz, hücre hatlarındaki, birincil hücrelerdeki ve dokulardaki mitokondriyal içeriği incelemek için hassas ve kapsamlı bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Mitokondri, hücrenin metabolik ihtiyaçlarını algılayabilen ve adapte edebilen karmaşık ve dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmanın karmaşıklığının merkezinde yer alan mitokondri, karbonhidrat, protein, lipit, nükleik asit ve ko-faktör metabolizması reaksiyonlarının birleştiği metabolik merkezler olarak işlev görür¹. Ayrıca, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin yolları için ve iyonlardaki ve reaktif oksijen türlerindeki değişikliklere yanıt olarak sinyal organelleri olarak da hizmet ederler ^2,3. Bugüne kadar, yaklaşık 1.100 protein mitokondri ^4,5,6 ile eşleştirilmiştir^, ancak özellikle sadece belirli hücre tiplerinde veya belirli çevresel koşullar altında geçici olarak ifade edilenler olmak üzere daha fazlasının keşfedilmeyi beklediğini varsayabiliriz. İlgilenilen metabolik durumlarda mitokondriyal kompozisyondaki değişiklikleri ölçmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek, bu organeller hakkındaki bilgimizi artıracak ve mitokondriyal disfonksiyon ile karakterize bozukluklar için yeni terapötik yolları vurgulayacaktır⁷.

Şu anda, farklı verim ve saflık seviyelerine sahip farklı mitokondri izolasyon protokolleri mevcuttur⁸. Santrifüj tabanlı yaklaşımlar, basitlikleri ve düşük maliyetleri nedeniyle en popüler olanlardır. Çoğu uygulama için uygun olmasına rağmen, diferansiyel santrifüjleme, daha düşük mitokondriyal saflık elde etme ve daha karmaşık yoğunluk gradyanı bazlı uygulamalar kullanıldığında büyük miktarlarda başlangıç malzemesi gerektirme dezavantajına sahiptir. Son yıllarda, mitokondri izolasyonu için etiket tabanlı bağışıklık yakalama ("MITO-IP")⁹ ve floresan ile aktive organel sıralama¹⁰ gibi yeni yöntemler ortaya çıkmıştır. Her iki prosedür de yüksek saflıkta örnekler üretebilse de, birincisi, afinite saflaştırması için mitokondrileri etiketlemek için genetik mühendisliği gerektirir, bu da protokolleri değiştirilmemiş organizmalardan veya insan donörlerinden gelen birincil materyalle uyumsuz hale getirir. Bu arada, ikincisi akış sitometrisine ve sıralama cihazlarına erişime bağlıdır. Farklı izolasyon yöntemlerini birleştirmek, daha sağlam protokoller ve daha fazla saflık üretme sözü verir.

Burada, mevcut iki yöntemin kombinasyonuna dayanan mitokondri izolasyonu için yeni bir protokol sunuyoruz: (1) ham bir mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için diferansiyel santrifüjleme ve (2) her yerde bulunan bir mitokondriyal dış membran proteini olan dış mitokondriyal membranın translokazına karşı antikorlara kovalent olarak bağlanmış süperparamanyetik boncuklarla mitokondrinin etiketsiz bağışıklık yakalaması 22 (Tomm22)¹¹ (Şekil 1). Tanımladığımız prosedür kantitatif protein kütle spektrometrisi ile uyumludur ve etiketsiz olduğu ve genetik manipülasyon gerektirmediği için, hücre hatlarından vücut sıvılarına ve tüm hayvan dokularına kadar çok çeşitli araştırma modellerine uygulanabilir. Ayrıca, protokolde iki adımın kullanılması, yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi ve ekspresyonlarının incelenmesi için çıkarma proteomikleri ^6,12'nin kullanılmasını sağlar.

Protokol

Eldivenler her zaman giyilmeli ve hücre kültürü adımları laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Hücreler,% 5 CO₂ içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde tutulur. Bu protokolde sunulan araştırma, Lozan Üniversitesi ve İsviçre'nin hayvanların kullanımına ilişkin kılavuzlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.

1. RAW264.7 makrofaj hücre hattının kültürü

1. Dulbecco'nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) farelerin makrofaj RAW264.7 hücrelerini,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HI-FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin (P / S) ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin ile büyütün.
   NOT: Mitokondrileri izole etmek için, tek bir 15 cm'lik bir konfluent plaka (yaklaşık 70 x 10 7 RAW264.7 hücre) yeterlidir.
2. RAW264.7 hücrelerini doku kültürü plakalarında tutun. 1 x 10⁵ hücre/mL'lik bir başlangıç tohumlama yoğunluğu, 3 gün içinde bir birleşik plakaya yol açar. 15 cm'lik bir plaka için ortamda 25 mL hücre süspansiyonu kullanın. RAW264.7 hücreleri yüksek hücre bölünme oranına sahiptir ve çoğu hücre hattından daha sık bölünmesi gerekir.
3. RAW264.7 hücrelerini ayırma
   1. Ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
   2. 15 cm'lik bir plaka için, 8 mL sıcak RAW ayrışma tamponu (270 mM potasyum klorür,_H2O'da30 mM sodyum sitrat dihidrat, steril filtrelenmiş) ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Plakalara eşdeğer miktarda ortam ekleyin (ayrışma tamponunun 1:1 seyreltilmesi) ve hücreleri ayırmak ve homojenize etmek için pipet.
   4. Hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
   5. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için peleti uygun bir ortam hacminde (adım 1.1'de açıklanmıştır) yeniden askıya alın.
      NOT: RAW264.7 hücrelerini ayırmak için tripsin veya hücre kazıyıcı gibi başka yöntemler de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler üzerinde daha serttir ve ayrılmayı takip eden günlerde M1 benzeri makrofajlara polarizasyonlarına yol açabilir.

2. Kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMDM'ler) izolasyonu ve kültürü

NOT: Burada açıklanan protokol tek bir fare içindir ve birden fazla fare için ölçeklendirilebilir. BMDM izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller başka bir yerde tanımlanmıştır^13,14.

1. Yüksek dozda CO₂ ile 8-12 haftalık bir C57BL/6 fareyi kurban edin.
   NOT: Erkek veya dişi fareler kullanılabilir.
2. Sterilize etmek için fareye% 75 etanol püskürtün.
3. Kalçaları, femurları ve tibiaları fareden disseke edin ve toplayın¹⁵.
4. Kemik iliğini femurlardan ve tibiaslardan toplamak için, her iki kemiğin diz eklemi ucunu çıkarın¹⁵. Asetabulumu çıkararak kemik iliğini kalçalardan kurtarın.
5. Kemikleri, buz üzerinde tutulan 4 mL BMDM ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın (% 5 HI-FBS, P / S ve 10 mM HEPS ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin içeren DMEM).
   NOT: Diseksiyon sırasında kemik iliğinin kurumasını önlemek için kemiklerin ortamda tutulması önemlidir.
6. 6 delikli bir plakanın iki farklı kuyucuğuna 4 mL PBS ve 4 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin.
7. Kemikleri ve ortamı 50 mL konik tüpten 6 delikli plakanın boş bir kuyucuğuna aktarın.
8. Bir çift forseps kullanarak, kemikleri yıkamak için PBS'ye iyice aktarın.
9. Kemikleri sıcak BMDM ortamı içeren kuyuya aktarın.
10. Forseps ile iki adet 0,5 mL tüpün dibinde 1-2 mm çapında bir delik açın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    NOT: Bu hızlı adım için tüpe medya eklemek gerekli değildir.
11. Her 0.5 mL'lik tüpte, maruz kalan kemiklerin kemik iliği tüplerin dibine bakacak şekilde bir femur, tibia ve kalça yerleştirin.
12. Kemik iliğini ve artık ortamı 0,5 mL tüpün deliğinden ve 1,5 mL tüpün içine toplamak için tüpleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj edin. 0.5 mL tüpleri kemiklerle birlikte atın.
13. BMDM ortamındaki kemik iliği peletlerini yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
14. 10 mL'ye kadar BMDM ortamı ekleyin.
15. 50 mL'lik bir konik tüpe 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve kemik iliği süspansiyonunu içinden filtreleyin.
16. Bozulmamış hücreleri geri kazanmak ve hücre süspansiyonundaki küçük kalıntıları temizlemek için filtrelenmiş süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
17. 50 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmiş 70 mL BMDM ortamı hazırlayın.
18. Peletin 10 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamında yeniden askıya alınması.
19. Yedi adet 10 cm'lik Petri kabının her birine 9 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamı ekleyin.
20. Yedi adet 10 cm'lik Petri kabının her birinde 1 mL hücre (yaklaşık 1 x 10⁷ hücre) plakası.
21. Plaka üzerinde dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme yaparak her plakadaki hücre süspansiyonunu homojenize edin ve plakaları inkübatöre aktarın.
22. 3 gün sonra, her plakaya 50 ng / mL M-CSF ile desteklenmiş 5 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin.
23. 3 gün sonra (6. gün, kemik iliği izolasyonundan sonra), BMDM'nin yapışmasını ve farklılaşmasını mikroskopi ile doğrulayın.
    NOT: Bu noktada, doğrudan mitokondri izolasyonuna geçmek mümkündür (adım 3). Alternatif olarak, sitokinler ve küçük moleküllerle tedavi edilmelerine izin veren BMDM'yi yeniden plakalayabiliriz.
24. BMDM'lerin ayrılması
    1. Ortamı her plakadan aspire edin ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş 7 mL soğuk PBS ekleyin.
    2. Hücreleri 4 ° C'de 7-8 dakika boyunca inkübe edin.
    3. BMDM'leri 10 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın.
    4. Yedi plakanın hepsinden askıya alınmış BMDM'leri tek bir 50 mL konik tüpte bir araya getirin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    5. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücreleri 40 mL sıcak BMDM ortamında yeniden askıya alın.
       NOT: Fare başına 7-9 x 10^{7 BMDM} arasında elde edilir. Proteomikler için mitokondri izolasyonu için en az 6 x 10⁷ BMDM önerilir.
    6. İstenirse, BMDM'leri deneysel hedefe göre plakalayın ve tedavi edin. Değilse, doğrudan adım 3.3'e geçin.

3. Diferansiyel santrifüjleme ile ham mitokondriyal fraksiyonun hazırlanması

NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin. Biri en az 300 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip konik tüpler için bir salınım rotoru ve adaptörleri, diğeri 1,5 mL borular için uygun en az 21.000 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip iki santrifüj gereklidir. Yapışkan hücreleri kullanırken, bir hücre kazıyıcı kullanın.

1. Yapışkan hücreler için, ortamı aspire edin ve 15 cm'lik plaka başına 10 mL PBS ekleyin.
   NOT: PBS'deki kazıma hücreleri, birinin aynı anda yıkanmasını sağlar. Hücreler zaten askıya alma aşamasındaysa, doğrudan adım 3.3'e geçin.
2. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve bunları tek bir 50 mL konik tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
   NOT: Hücreler bir hücre kazıyıcı kullanılarak ayrılabilir, çünkü bu daha hızlıdır ve kısa bir süre sonra lize edilirler.
3. Her deneysel durum için, hücre süspansiyon hacminin% 5'ini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
   NOT: Süspansiyon hücrelerini kullanırken, FBS gibi ortamlardan olası kirleticileri temizlemek için hücreleri daha önce PBS ile bir kez yıkadığınızdan emin olun.
4. Supernatant'ı atın ve peleti buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu, proteomikler için "toplam hücre" fraksiyonunu temsil edecektir.
5. Adım 3.1 veya 3.2'deki numunelerin geri kalanını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
6. Aşağıdaki tüm adımları buz üzerinde ve buz gibi soğuk tamponlar kullanarak gerçekleştirin.
7. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 5 mL buz gibi soğuk mitokondri tamponunda (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sakaroz, 10 mM HEPS / NaOH [pH 7.4] ve 1 mM EDTA) yeniden askıya alın.
8. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme ile hücreleri geri kazanın.
9. Hücre peletini 0,5 mL soğuk MB'de tekrar askıya alın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Bu prosedür yaklaşık 1,5 x 10 8 BMDM hücre/mL veya 3 x 10⁸ RAW264,7 hücre/mL hücre konsantrasyonu sağlar.
10. 25 G iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, hücre süspansiyonunu iğneden 30 pasajla homojenize edin (Şekil 1A).
11. Tüpe 1 mL soğuk MB ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Homojenize hücre süspansiyonunu 2.000 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
12. Süpernatantın 1 mL'sini, hücre peletini rahatsız etmeden buz üzerinde taze bir 1.5 mL tüpe aktarın. Hücre peletini yeniden askıya alın ve adım 3.7'de olduğu gibi tekrar homojenize edin.
13. Homojenize hücre peletini ve önceki iki adımdaki süpernatantı tek bir 1,5 mL tüpte toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj edin.
    NOT: Bu noktada, pelet çoğunlukla çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir ve atılır. Süpernatant, hücresel enkaz, sitosol ve mitokondri de dahil olmak üzere organeller içerir (Şekil 1B).
14. Süpernatantı dört adet 1,5 mL tüp arasında bölün.
    NOT: Bu aşamada süpernatantın birden fazla tüp arasında bölünmesi, aşağıdaki adımlarda kirleticilerin uzaklaştırılmasını iyileştirir.
15. Dört tüpün her birinde 1 mL'lik son bir hacim elde etmek için MB ekleyin. İnversiyon ile karıştırın ve tüpleri 13.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
    NOT: Bu adımdan sonra, iki katmanlı bir pelet görülebilir. Alt, sert, kahverengi pelet mitokondri içerir ve daha fazla saflaştırma için tutulur (Şekil 1C). Üst, gevşek, beyaz pelet diğer hücresel yapıları içerir ve atılabilir.
16. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Süpernatantı mümkün olduğunca beyaz üst pelet ile çıkarın. Üzerine hafifçe pipetleme yaparak, beyaz peleti yeniden askıya almak ve daha sonra kahverengi mitokondriyal peleti bozulmadan bırakarak atmak mümkündür.
17. Dört tüpten birini mitokondriyal pelet ile buz üzerinde tutun. Bu, proteomikler için "ham mitokondri" fraksiyonunu temsil eder.
18. Diğer üç peleti 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL'lik bir MB'lık son hacimde bir araya getirin.

4. Mitokondrinin süperparamanyetik antikor bazlı saflaştırılması

NOT: Soğuk bir odada 4 °C'de aşağıdaki adımların tümünü uygulayın.

1. Ham mitokondriyal preparatın 1 mL'sini adım 3.18'den 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 150 mM NaCl (MB + NaCl) ile desteklenmiş 7 mL MB ekleyin.
   NOT: NaCl ilavesi antikor bağlanmasını iyileştirir ve kirleticilerin boncuklara ve mitokondriye spesifik olmayan bağlanmasını azaltır.
2. 8 mL ham mitokondri süspansiyonuna 50 μL Tomm22 boncuk ekleyin (Şekil 1D) ve tüpü düşük hızda dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Tomm22 boncukları, süperparamanyetik boncuklara bağlanmış, farede yetiştirilen Tomm22 monoklonal antikorlarına kovalent olarak bağlanır.
3. Bu arada, mıknatısın üzerine bir sütun yerleştirin.
4. Sütunu 8 mL MB + NaCl ile dengeleyin ve akışı atın.
5. Tomm22 boncukları ile numunenin 4 °C'sinde 15 dakikalık inkübasyonun ardından, numuneyi kolona aktarın. Akışı atın.
   NOT: Mitokondri, sütundaki manyetik boncuklara bağlı kalacaktır (Şekil 1E).
6. Kolonu 8 mL MB + NaCl ile üç kez yıkayın.
7. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
8. Kolona 1.5 mL MB + NaCl ekleyerek mitokondrileri temizleyin ve saflaştırılmış mitokondrileri tüpe sokmak için hemen bir piston uygulayın.
9. Salınan mitokondrileri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüj edin.
   NOT: Kahverengi bir pelet oluşacaktır. Bu, izole edilmiş mitokondrileri ve antikorla eşleşmiş boncukların bazılarını içerir (Şekil 1F).
10. Süpernatantı peletten dikkatlice çıkarın. Pelet, proteomikler için "saf mitokondri" fraksiyonunu temsil eder. Bu pelet, 3.4 ve 3.17. basamaklardaki peletlerle birlikte -20 °C'de saklanabilir ve çıkış yönündeki uygulamalar için hazırdır.

Sonuçlar

Mevcut protokolde artan derecelerde mitokondriyal saflığa sahip üç örnek üretilmiştir: toplam hücreler, ham mitokondri ("mito-crude") ve saf mitokondri ("mito-saf") (Şekil 1). Mitokondrinin RAW264.7 makrofaj hücre hattından saflaştırılmasını, her fraksiyonun eşit protein miktarlarını bir jel üzerine yükleyerek ve immünoblotlama yaparak doğruladık ve mitokondriyal sitrat sentazın (Cs) her saflaştırma adımında zenginleştirildiğini bulduk; Bu arada, sitosol (GAPDH), plazma zarı (Na / K ATPaz), çekirdek (Lamin B), lizozomlar (Lamp1) ve endoplazmik retikulum (ER) (Pdi) proteinleri giderek kayboldu (Şekil 2A). BMDM'ler kullanılarak da benzer sonuçlar elde edildi. İzole mitokondrinin saflığının ve bütünlüğünün daha fazla doğrulanması için, saf mitokondriyal fraksiyon üzerinde elektron mikroskobu yapıldı. Klasik oval şekilli mitokondri ve antikor kaplı boncuklara karşılık gelen elektron yoğun parçacıklarla çevrili sağlam kristaller gözlemledik (Şekil 2B). Bu nedenle, protokolümüzün mitokondrileri zenginleştirdiği, diğer hücresel bileşenleri tükettiği ve mitokondriyal yapısal bütünlüğü koruduğu sonucuna varılabilir.

Daha sonra, kütle spektrometrisine (LC / MS) bağlı sıvı kromatografisi kullanılarak her fraksiyonun proteom analizi yapıldı. Toplam hücrelerden elde edilen ekstraktta, 907'si daha önce MitoCarta3.0 envanter^5'te mitokondriyal olarak ek açıklamalı olan toplam 6.248 protein tanımlanmıştır. En az iki benzersiz peptit eşiğine sahip proteinleri filtreledikten sonra, her numunedeki her protein için toplam hücrelere kıyasla yoğunluklarına göre bir zenginleştirme puanı hesapladık. Daha sonra proteinleri yedi ana hücre altı bölmeye ayırdık: mitokondri, ER, lizozomlar, Golgi aparatı, hücre iskeleti, çekirdek ve sitosol, Gen Ontolojisi (GO) ^16,17 ve MitoCarta3.0^5'i referans olarak kullanarak. Önemli olarak, ham ve saf mitokondri fraksiyonlarında sırasıyla 10 kattan fazla ve 20 kattan fazla mitokondriyal proteinler için ortalama bir zenginleşme gözlenmiştir (Şekil 2C). Buna karşılık, analiz edilen diğer altı hücresel bölmenin bileşenleri saflaştırma prosedürü sırasında tükenmiştir. Özellikle, ham mitokondri fraksiyonunda, ER ve lizozomal proteinler için geçici bir zenginleştirme gözlemledik, diferansiyel santrifüjleme protokollerini takiben sıklıkla mevcut olan iki kirletici protein sınıfı¹⁸. Bu muhtemelen organel-organel etkileşimlerinden ve benzer sedimantasyon katsayılarından, özellikle makrofajlarda oldukça bol miktarda bulunan lizozomlar için^19'dan kaynaklanıyordu. Her ikisi de bağışıklık yakalamadan sonra çoğunlukla tükenmiş olsa da, mito-saf fraksiyondaki ER-mitokondri temas bölgelerinden proteinler için küçük bir sinyal tespit ettik.

Daha sonra toplam hücrelerden ve mito-saf örneklerden protein bolluğunu doğrudan karşılaştırdık ve mitokondriyal ve mitokondriyal olmayan proteinlere karşılık gelen iki ayrı popülasyon gözlemledik (Şekil 2D). MitoCarta proteinlerinin büyük çoğunluğu birlikte kümelenirken, MitoCarta olmayan proteinlerle kümelenmiş birkaç tane (% <5) bulduk. Bu proteinler (1) sitozolik mitokondri ile etkileşime giren proteinleri (MitoCarta'nın 3.0 sürümünde ek açıklamalı yeni bir kategori), (2) çift lokalize proteinleri veya (3) yanlış açıklamalı proteinleri temsil edebilir. Tersine, mitokondriyal proteinlerle kümelenen MitoCarta olmayan proteinlerin birkaç örneğini bulduk. Bu tür proteinler izolasyon prosedürünün kirleticilerini temsil edebilirken, daha önce mitokondride mevcut olarak sınıflandırılmamış proteinleri de temsil edebilirler.

Bu yeni potansiyel mitokondriyal protein sınıfını araştırmak için, mitokondri ^6,12 de dahil olmak üzere organellar proteomların keşfi için yararlı olduğu kanıtlanmış bir yaklaşım olan çıkarmalı proteomikler kullanılmıştır. Subtraktif proteomikler, saflaştırma adımları sırasında mitokondrinin zenginleştirilmesi gerektiğini ve kirleticilerin tükenmesi gerektiğini varsayar⁶. Örneğin, kirleticiler diferansiyel santrifüjleme sırasında (örneğin, benzer çökeltme özellikleri nedeniyle) veya immün yakalama sırasında (örneğin, spesifik olmayan antikor bağlanması nedeniyle) birikebilirken, yalnızca iyi niyetli mitokondriyal proteinler her ikisinde de önemli ölçüde birikmelidir. Böylece, saf mitokondri fraksiyonunda bulunan ancak tutarsız zenginleştirme kalıpları gösteren proteinleri filtrelemek mümkündür. RAW264.7 hücreleri ile mevcut örnekte, mito-ham ve mito-saf numuneler için ≥1'lik benzersiz peptitler için bir eşik belirleyerek ve katı zenginleştirme eşikleri kullanarak, diferansiyel santrifüjlemeden sonra başlangıçta ham mitokondriyal fraksiyonda bulunan 1.127 proteinden geri kazanılmış mitokondriyal proteomların listesini, Tomm22 immünoseleksiyonunu kullanarak ikinci saflaştırma turunu takiben 481 proteine kadar rafine edebildik. Mito-saf fraksiyondaki MitoCarta açıklamalı proteinlerin sayısının azalması, seçim için uygulanan yüksek sıkılığı yansıtır. İlginçtir ki, mito-saf fraksiyonda bulunan proteinlerin 70'i MitoCarta3.0 envanterinde mevcut değildi (Şekil 3A, B). Bu son proteinler, yalnızca RAW264.7 makrofaj hücre hattında ve ilgili hücrelerde eksprese edilebilen ve daha fazla araştırmayı hak eden potansiyel yeni mitokondriyal aday proteinleri temsil edebilir.

Şekil 1: İki adımlı, etiketsiz mitokondri izolasyon protokolünün çizimi . (A) Bir hücre süspansiyonu 25 G'lik bir iğne ile bozulur. (B) Çekirdekler ve bütün hücreler 2.000 x g'da santrifüjleme ile ayrılır ve süpernatant kurtarılır. (C) Ham mitokondri, süpernatantın 13.000 x g'de (mito-crude) diferansiyel santrifüjlenmesi ile izole edilir. (D) Ham mitokondri daha sonra süperparamanyetik boncuklara kovalent olarak bağlı Tomm22 antikorları (Ab) ile inkübe edilir. (E) Mitokondri-Tomm22 antikor-boncuk kompleksleri, manyetik sütunlar kullanılarak kirleticilerden ayrılır ve yayılır. (F) Saf mitokondriler santrifüjleme (mito-saf) ile toplanır ve konsantre edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. İki makrofaj kaynağından mitokondri izolasyonunun temsili sonuçları. (A) Mitokondriyal sitrat sentaz (Cs - mitokondri), gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (Gapdh - sitosol), sodyum-potasyum pompası (Na / K ATPaz - plazma zarı), Lamin B (Lamin B - çekirdek), lizozomal ilişkili membran proteini 1 (Lamp1 - lizozom) ve protein disülfür-izomeraz (Pdi - ER) antikorları kullanılarak RAW264.7 (üstte) ve BMDM hücrelerinin (altta) protein immünoblot analizi. (B) RAW264.7 hücrelerinden saflaştırılmış mitokondrinin elektron mikroskopisi. Mitokondrileri çevreleyen yüksek yoğunluklu parçacıklar, sütunlardan elüsyondan sonra mito-saf numunelerle taşınan Tomm22 boncuklarına karşılık gelir. Ölçek çubukları: 80 nm. (C) RAW264.7 hücrelerindeki yedi hücresel bölmeden toplam hücreler, mito-ham ve mito-saf arasında zenginleştirme skorları. Protein ek açıklaması için MitoCarta3.0 ve GO kullanıldı ve ortalama puanlar temsil edildi. Kısaltma: ER = endoplazmik retikulum. (D) Toplam hücrelerdeki proteinler için protein bolluk değerleri (riBAQ) ve RAW264.7 hücrelerinden mito-saf örnekler. MitoCarta3.0 proteinleri turuncu renkte gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Subtraktif proteomik kullanarak yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi. (A) Yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi için çıkarma proteomik stratejisi. Yanlış pozitiflerin seçimini en aza indirmek için yüksek seçim eşikleri (4x ve 2x) uygulanır. (B) MitoCarta3.0 envanterinde daha önce açıklanmayan yeni mitokondriyal aday proteinlerin zenginleştirme verimleri (toplam hücrelerin katı). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mitokondri izolasyonu için geliştirilmiş bir saflık elde etmek için diferansiyel santrifüjleme ve immünoyakalamayı birleştirdik. Prosedürümüz, yeni mitokondriyal proteinlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için birincil materyale erişim sağlar. Protokol basit ve sağlamdır ve genetik modifikasyona gerek kalmadan hücre hatlarına, birincil hücrelere ve dokulara uygulanabilir. Saflaştırma prosedürü boyunca farklı aşamalarda alınan numuneler üzerinde immünoblotlama ve proteomik analizler yaparak protokolümüzü doğruladık.

Tek izolasyon yöntemlerine kıyasla, farklı doğalardaki zenginleştirme adımlarının kombinasyonu - burada, santrifüjleme ve bağışıklık etiketleme - mitokondrileri izole etmek için daha sağlam bir protokol oluşturur. Bunun nedeni, mitokondriyal proteinlerin her iki saflaştırmada da zenginleşmesine rağmen, kirleticilerin her iki zenginleştirme adımından sonra da zenginleştirilmesi olası değildir. Yüksek mitokondriyal saflık, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile de elde edilebilse de, bu yaklaşım büyük miktarda başlangıç malzemesi ve bir ultrasantrifüje erişim gerektirir. Son olarak, etiket tabanlı mitokondriyal izolasyon^20'ye dayanan son yöntemlerin aksine, yaklaşımımız numunenin genetik modifikasyonunu gerektirmez, bu da onu herhangi bir kaynaktan birincil materyal için uygun hale getirir.

Protokolümüzü uygularken deney tasarımında bazı teknik ve biyolojik hususların dikkate alınması gerekir. (1) Yeterli malzemenin elde edilebilmesi için başlangıç malzemesi miktarı kritik öneme sahiptir. Kaçınılmaz olarak, homojenizasyon sırasında (adım 3.10) az sayıda mitokondri kaybolacaktır, çünkü tüm hücreler lize edilmez veya üç kolon yıkama sırasında (adım 4.6). Protokolümüz verim üzerindeki saflığa odaklanırken, mitokondri izolasyonunun etkinliği ve dolayısıyla verimleri ölçülmemiş veya optimize edilmemiştir. Daha fazla Tomm22 boncuğu ve daha fazla sütun kullanılmasının mitokondri geri kazanımının verimini arttırması beklenmektedir. Aynı zamanda, homojenizasyon adımının kapsamlı bir optimizasyonu da mitokondriyal verimin artmasına yol açabilir. Bu protokol ve burada RAW264.7 hücreleri ve BMDM'ler için bildirdiğimiz başlangıç hücre sayıları proteomik için yeterlidir ve diğer uygulamalar için ayarlanabilir. Birincil BMDM'ler söz konusu olduğunda, tek bir farenin bir çoğaltma için yeterli olduğunu bulduk. Gerektiğinde, prosedür BMDM'leri birden fazla hayvandan izole etmek için ölçeklendirilebilir, bu da daha sonra yeterli malzeme elde etmek için havuzlanabilir. Hücre sayısı, hücre tipine, boyutuna ve mitokondriyal içeriğine bağlı olarak optimize edilebilir. (2) Tomm22, tüm hücre tiplerinden ve dokularından mitokondri üzerinde eksprese edilir²¹, ancak ifade düzeyi değişebilir. Bu nedenle, farklı koşulları karşılaştırmak için bir deney tasarlarken, Tomm22'nin ifade düzeylerinin karşılaştırılabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Ayrıca, Tomm22'nin her yerde bulunan ekspresyonu nedeniyle, karmaşık dokulardaki hücre tipine özgü mitokondriyal proteinleri incelemek mümkün değildir. (3) Saf mitokondri üretmek için gereken süre (yaklaşık 2.5 saat), metabolik profillerdeki değişiklikler gibi geçici olayların incelenmesiyle uyumlu değildir. Bu durumda, doğrudan etiket tabanlı bağışıklık yakalamayı öneririz⁹, aynı zamanda hücre tipine özgü mitokondrilerin incelenmesine de izin verir in vivo²⁰. (4) Tek başına Tomm22 antikoru etiketli boncuklar kullanılarak elde edilen izole mitokondri üzerine yapılan çalışmalar fonksiyonel tahlillerde aktivite göstermiş olsa da;¹¹, protokolümüzle üretilen mitokondrinin aşağı akış aktivitesine dayalı analizlerle uyumlu olup olmadığı belirlenmeye devam etmektedir. MitoTracker veya tetrametilrhodamine metil ester perklorat (TMRM) boyama veya respirometri ölçümleri, izole mitokondrinin işlevselliğini ölçmek için potansiyel yaklaşımlardır²². (5) "Mito-saf" numuneyi kolondan çıkardıktan sonra, saf mitokondri fraksiyonunda (Şekil 2B). Tripsin sindirimi ve protein kütle spektrometrisi ile herhangi bir girişim gözlemlememize rağmen, bu boncukların ve immünoglobulinlerin varlığı diğer aşağı akış uygulamalarında dikkate alınmalıdır. Tomm22 antikoru, farelerde üretilen monoklonal bir antikordur²³ve bu nedenle, immünoblotlamada farelere karşı ikincil antikorlar kullanıldığında, immünoglobulin zincirlerinin boyutunda spesifik olmayan bantlar üreteceğini akılda tutmak önemlidir. (6) Hücre süspansiyonunun tam homojenizasyonu, mitokondrinin başarılı bir şekilde izole edilmesinin anahtarıdır. Burada, hem RAW264.7 hücrelerini hem de BMDM'leri lize etmek için 25 G iğneli bir şırınga kullanıyoruz. Bununla birlikte, hücre tipine ve boyutuna bağlı olarak, bir Dounce homojenizatörünün kullanımı gibi diğer mekanik homojenizasyon yöntemleri veya hücre homojenizatör cihazları gibi daha kontrollü yaklaşımlar daha uygun olabilir. Nazik sonikasyon gibi mekanik olmayan homojenizasyon yöntemleri de düşünülebilir. Doku homojenizasyon yaklaşımları diğer çalışmalarda daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır^24,25. (7) İmmünoblotlama ile doğrulama en basit ve ucuz yöntem olmasına rağmen, sonuçları her zaman tüm organel seviyesindeki değişikliklerle ilişkili olmayabilir. Bu nedenle, sırasıyla mitokondri ve diğer organellerin zenginleşmesini veya tükenmesini tam olarak doğrulamak için proteomik kullanmanızı öneririz.

Burada tarif edilen iki aşamalı mitokondri saflaştırma protokolü, mitokondriyal saflığı artıran sıralı örnekler üretmemize izin verdi ve bu, çıkarma proteomikleri¹² yoluyla yeni mitokondriyal protein adaylarını keşfetmemizi sağladı. Analizimiz için, önemli ölçüde zenginleştirilmiş mitokondriyal proteinleri seçmek için katı eşikler kullanıyoruz ve bu, bilinen bazı mitokondriyal proteinleri tanımlamakta başarısız olsa da (Şekil 3A), yeni mitokondriyal protein keşfi için yanlış pozitif oran azalır. Bununla birlikte, protokolümüz tarafından ortaya konan herhangi bir aday proteinin ortogonal yaklaşımlarla doğrulanması gerektiğini vurgulamak önemlidir. Mitokondri ile mikroskobik olarak veya proteaz koruma testleri ile ilişkiyi doğrulamak için karboksi-terminal GFP etiketlemesini veya endojen proteine karşı antikorların kullanılmasını öneririz.

Yöntemimizin değiştirilmemiş hücreler ve dokular durumunda doğrudan uygulanması, mitokondrilerin sağlıklı ve hastalık koşullarında çevrelerine nasıl değiştiğini ve uyum sağladığını araştırmak için güçlü bir araç sunar. Protokolümüzün hücre hatlarına, hayvan hastalıkları modellerine, insan sıvılarına ve hatta cerrahiden biyopsilere uygulanması, mitokondri ve bunlarla ilişkili bozukluklar hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için özellikle yararlı olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL şırınga	BD Plastipal	309628
25 G İğne	BD Microlance	300400
40 & mikro; m hücre süzgeci	Corning	352340
Anti-TOM22 Mikro boncuklar, fare	Miltenyi Biotec	130-127-693
Hücre sıyırıcı	FisherScientific	11577692
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Etilendiamintetraasetik asit	FisherScientific	BP-120-1
Fetal sığır serumu	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS kolonları ve pistonları	Miltenyi Biotec	130-042-401
Makrofaj koloni uyarıcı faktör	İmmünotools	12343115
Mannitol	Sigma	M4125
Sodyum klorür	Sigma	71380
Sükroz	Sigma	S1888
Penisilin / Streptomisin	BioConcept	4-01F00-H
Petri kapları	Corning	BH93B-102
Fosfat tamponlu salin 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
QuadroMACS Ayırıcı	Miltenyi Biotec	130-090-976
Vi-CELL BLU Hücre Canlılık Analiz Cihazı	Beckman Coulter	C19196