Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

4.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65254

⸱

21 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Özet

Stria vascularis tarafından üretilen endokoklear potansiyel, uygun saç hücresi mekanotransdüksiyonuna ve nihayetinde işitmeye elverişli bir ortamı korumak için gereklidir. Stria vascularisin patolojileri işitmenin azalmasına neden olabilir. Erişkin stria vaskülarisin diseksiyonu, odaklanmış tek çekirdekli yakalamaya ve ardından tek çekirdekli dizileme ve immün boyamaya izin verir. Bu teknikler stria vascularis patofizyolojisini tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılır.

Tek çekirdekli dizileme, stria vascularisin transkripsiyonel analizi ayarında kullanılabilir. Bu arada, immün boyama, spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamada yararlı olmaya devam etmektedir. Her iki yöntem de ön koşul olarak uygun stria vascularis diseksiyonu gerektirir ve bu da teknik olarak zor olabilir.

Giriş

Koklea sıvı dolu üç odadan oluşur: scala vestibuli, scala media ve scala timpani. Scala vestibuli ve scala timpaninin her biri, yüksek konsantrasyonda sodyum (138 mM) ve düşük konsantrasyonda potasyum (6,8 mM)1 içeren perilenf içerir. Scala ortamı, yüksek konsantrasyonda potasyum (154 mM) ve düşük konsantrasyonda sodyum (0,91 mM)1,2,3 içeren endolenf içerir. İyon konsantrasyonundaki bu fark endokoklear potansiyel (EP) olarak adlandırılabilir ve esas olarak potasyum iyonlarının çeşitli iyon kanalları ve stria vascularis'teki (SV) boşluk kavşakları boyunca kokleanın lateral duvarı boyunca hareketi ile üretilir 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV, kokleanın lateral duvarının medial yönünü kaplayan heterojen, yüksek vaskülarize bir dokudur ve üç ana hücre tipi içerir: marjinal, orta ve bazal hücreler12 (Şekil 1).

Marjinal hücreler, SV'nin en medial yüzeyini oluşturmak için sıkı bağlantılarla bağlanır. Apikal membran, scala media'nın endolenfine bakar ve KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 ve Na + -K + -ATPaz (NKA) 5,10,13,14 dahil olmak üzere çeşitli kanalları kullanarak endolenf içine potasyum iyonu taşınmasına katkıda bulunur. Ara hücreler, marjinal ve bazal hücreler arasında bulunan ve KCNJ10 (Kir 4.1)15,16 kullanarak SV yoluyla potasyum taşınmasını kolaylaştıran pigmentli hücrelerdir. Bazal hücreler kokleanın lateral duvarına yakın bir yerde bulunur ve perilenf12'den potasyum geri dönüşümünü teşvik etmek için spiral ligamentin fibrositleri ile yakından ilişkilidir. SV'nin patolojisi çok sayıda otolojik bozuklukla ilişkilendirilmiştir17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ve Cldn11 gibi majör SV hücre tiplerinde eksprese edilen genlerdeki mutasyonlar, EP 19,20,21,22,23 kaybı da dahil olmak üzere sağırlık ve SV disfonksiyonuna neden olabilir. Üç ana hücre tipine ek olarak, SV'de, iğ hücreleri 22, kök hücreler12,24, makrofajlar 25, perisitler 26 ve endotel hücreleri 27 gibi, iyonik homeostazı ve EP 28 oluşumunu içeren eksik tanımlanmış rollere sahip daha az çalışılmış başka hücre tipleri de vardır.

Toplu RNA dizilimine kıyasla, tek çekirdekli RNA dizilimi (sNuc-Seq), bir grup hücre29'daki mRNA'nın ortalamasından ziyade hücre heterojenliği hakkında bilgi sağlar ve heterojen SV30'u incelerken özellikle yararlı olabilir. Örneğin, sNuc-Seq, EP üretiminde, işitme kaybında ve Meniere hastalığında iğ ve kök hücrelerin rolü olabileceğini düşündüren transkripsiyonel analiz üretmiştir18. Çeşitli SV hücre tiplerinin daha ileri transkripsiyonel karakterizasyonu, SV ile ilişkili işitme dalgalanması ve işitme kaybının farklı mekanizmalarının ve alt tiplerinin altında yatan patofizyoloji hakkında bize paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Bu hassas iç kulak yapılarının toplanması, optimal doku analizi için büyük önem taşımaktadır.

Bu çalışmada, sNuc-Seq veya immün boyama için stria vaskülaris'e erişen ve izole eden yetişkin fare kokleasından izole etmek için mikrodiseksiyon yaklaşımı tanımlanmıştır. Yetişkin fare SV'nin diseksiyonu, çeşitli SV hücre tiplerini anlamak ve işitmedeki rollerini daha da karakterize etmek için gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmıştır. Tüm yöntemler, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin ilgili kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan ötenazisi

  1. 15-20 g ağırlığında C57BL / 6J veya Kcnj10-ZsGreen transgenik fareler, doğum sonrası gün 30+ (P30+) kullanın.
  2. Onaylanmış bir protokol kullanarak yetişkin bir fareyi (P30 yaş ve üstü) ötenazi yapın (burada CO2 boğulması). İkincil bir adım olarak kafa kesmeyi gerçekleştirin.
    NOT: İmmün boyama varsa, SV'nin kılcal damarlarındaki kana spesifik olmayan bağlanma nedeniyle bazı antikorlar arka plan sinyaline sahip olabilir. Fiksatif ile kardiyak perfüzyon, SV'nin kılcal damarlarından kan alarak bu sorunu çözebilir. Bununla birlikte, çoğu antikor bu yöntem olmadan iyi sonuçlar elde edebilir ve bu protokolde ele alınmayacaktır.

2. Kemikli labirentin açığa çıkarılması

  1. Fareyi% 70 etanol püskürterek ve bir kağıt havluyla silerek temizleyin. Kontaminasyon riskini azaltmak için kafa bölgesine özellikle dikkat edin. Cildi buruna doğru çekerek cildi kafatasından çıkarın.
  2. Keskin makas kullanarak, sol ve sağ kısımları ayırmak için kafatasını orta sagital düzlem boyunca bölün.
  3. Kemikli labirenti ortaya çıkarmak için beyni kafatasından çıkarın.

3. İç kulak çekimi

  1. Temporal kemik içindeki iç kulağı tanımlayın (Şekil 2A) ve #55 forseps kullanarak kraniyal sinirleri kazıyın.
    NOT: Kullanıcı, ikinci bir #55 forseps seti kullanarak numuneyi baskın olmayan elleriyle stabilize etmelidir. Numunenin kritik alanlarından kaçınılırsa, diseksiyon boyunca stabilize edici forseps ile numunenin farklı alanları tutulabilir (örneğin, kokleayı ezmeyin).
  2. # 55 forseps kullanarak, bulla ve kapsülü parçalara ayırın, onları çevreleyen kemikten ayırın. Kalan yumuşak dokuları iç kulak yüzeyinden çıkarın.
  3. Numuneyi 1x soğuk PBS (fosfat tamponlu salin), pH 7.4 içeren berrak bir doku kültürü kabına aktarın ve bir diseksiyon kapsamı altına yerleştirin (Şekil 2B).

4. SV diseksiyonu

NOT: Uygulamada, SV'yi bir kurdeleye benzeyen uzun bir parça olarak incelemek mümkündür. SV kırılgandır, bu nedenle parçalara ayrılırsa, bunlar birlikte saklanabilir. Alternatif olarak, bunlar sıralarına göre ayrı ayrı etiketlenmiş kuyucuklarda saklanabilir (örneğin, bazal, orta, apikal).

  1. Diseksiyon kapsamı ışık kaynakları hareket ettirilebiliyorsa, bir ışığı çanağın üzerine ve ikinci ışık kaynağını diseksiyon yüzeyine paralel olarak yandan yerleştirin. Bu, koklear kemiğin altındaki dokunun daha iyi bir kontrastını sağlar.
  2. #55 forseps kullanarak, numuneyi koklea yukarı bakacak şekilde vestibüler kısımdan tutun.
  3. #55 forseps kullanarak, tepedeki koklear kemiği delin.
    NOT: # 5 forseps, # 55'ten daha kalındır ve kemiği kırmak için kullanılabilir, ancak boyut / güçteki artış, forsepslerin inceliğini ve küçük dokuları manipüle etme yeteneğini feda eder. Daha hassas forsepslerde oluşabilecek hasarı önlemek için inox veya dumostar gibi bir malzemeden yapılmış forseps kullanmayı düşünün. SV'ye zarar vermemek için forsepsleri kemiğin altına çok derin itmekten kaçının.
  4. # 55 forseps kullanarak, apikal dönüş boyunca kazıyın (Şekil 2C), dış kemik tabakasının küçük parçalarını ayırmak için hafif bir kuvvet uygulayın. Kemiği yavaşça kaldırın ve yanal duvardan ayırın.
    NOT: Bu diseksiyonu "SV'yi kokleanın dışına çıkarmak" yerine "SV'den her şeyi çıkarmak" olarak düşünmek yararlı olabilir.
  5. Koklear kemik parçalarını apikal ve orta dönüşlerden çıkarmak için #55 forseps kullanmaya devam edin (Şekil 2D, E). Yanal duvarı yavaşça aşağı iterek, apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını ortaya çıkarmak için kemik duvar parçalarını orta dönüşe doğru gözetin ve çıkarın.
  6. # 55 forseps kullanmaya devam ederek, spiral ganglionu ortaya çıkarmak için apikal dönüş yanal duvarını yavaşça bir kenara itin. Apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını, dış kıl hücresi tabakası boyunca spiral gangliondan ayırın. Spiral ganglion parçalarını kokleanın içinden çıkarın.
    NOT: # 55 forseps daha küçüktür ve küçük ve hassas dokuları manipüle ederken avantaj sağlar. Bükülmelerini veya zarar görmelerini önlemek için ekstra özen gösterilmelidir.
  7. Bazal dönüşün lateral duvarına daha iyi erişebilmek için, kokleayı #55 forseps kullanarak temporal kemiğin vestibüler kısmından ayırın. #55 forsepsleri yuvarlak ve oval pencereye koyun ve girişe doğru aşağı doğru itin. Koklea ayrılacaktır. İç kulağın vestibüler kısmını çıkarın.
  8. #55 forseps kullanmaya devam ederek, şimdi orta dönüş bölgesinden başlayarak bazal koklear kemik parçalarını çıkarın. Yanal duvar tabakasını ayırmak için kemiğin altına yavaşça itin.
  9. Yanal duvarın en uzak bazal kısmını, dokuyu meraklandırarak ve hafifçe çekerek çıkarın. Bu bölgedeki kemik, aşağıdaki yumuşak dokuya zarar vermeden çıkarılamayacak kadar kalın olabilir.
  10. Şimdi, lateral duvarın bazal kısmı ayrılmışken, lateral duvarın mümkün olduğunca çoğunu kokleadan ayırın. Bu, yanal duvar boyunca # 55 forsepsleri izleyerek yapılabilir. Forsepsleri kemik ile kalan lateral duvar arasında yavaşça fırçalayın. Bu, kullanıcı deneyimliyse tek parça halinde tepeye kadar yapılabilir. Yanal duvarı taze PBS'ye taşıyın.
    NOT: SV'nin daha büyük parçalarının görüntülenmesi daha kolay olsa da, dokuların hassas doğası göz önüne alındığında, daha küçük parçalar alınabilir (Şekil 2F, G) ve boyuta bağlı olarak görüntüleme için de kullanılabilir.
  11. Yanal duvarı düz bir şekilde döşemek için # 55 forseps kullanın. SV, yanal duvarın iç tarafında daha koyu bir doku tabakası olarak görülebilmelidir.
    NOT: Kullanıcılar, özellikle apikal uca daha yakın bir yerde, SV dokusunun bir kısmının diseksiyon boyunca tesadüfen lateral duvardan ayrıldığını görebilirler.
  12. SV tabakasını bazal ucundaki yanal duvardan ayırmak için yavaşça kaldırın (Şekil 2H). Ayrılmış SV'yi yavaşça bir kenara itin ve forsepsleri lateral duvarın apikal ucuna doğru hareket ettirin, mümkünse SV'yi uzun bir şerit olarak ayırın (Şekil 2I). SV'yi çekmek için forseps ile sıkmayın. Doku yakalanamayacak kadar kırılgansa, alternatif olarak şalazyon küreti gibi bir doku kepçesi kullanılarak toplanabilir.
    NOT: SV'nin taşınması, kaybolmamasını sağlamak için her zaman ışık mikroskobu altında yapılmalıdır. Hasar riski nedeniyle forseps kullanarak yakalarken her zaman dikkatli olun. Kullanıcılar, şalazyon küreti kullanmanın SV dokusuna zarar verme riskini azalttığını görebilirler. Tek çekirdekli dizileme için, bölüm 5'e geçin. SV immün boyama için bölüm 7'ye geçin.

5. SV tek çekirdekli süspansiyon

NOT: Bu protokol, SV dokusu için özellikle yayınlanmış bir üreticinin tek çekirdekli süspansiyon protokolünden uyarlanmıştır. Farklı üreticilerin platformları kullanılabilir31. Platforma özgü varyasyon göz önüne alındığında, ekipmanla birlikte sağlanan üreticiye özgü protokolün gözden geçirilmesi önerilir. sNuc-Seq için en uygun sonuçları elde etmek ve RNA yıkımını en aza indirmek için, doku diseksiyonu ne kadar hızlı olursa o kadar iyidir (ötenaziden 15-20 dakika içinde önerilir). Bir seferde bir hayvanı ötenazi yapmak ve sadece disseke etmeye hazır olduğunda yararlı olabilir. Diseksiyonlar üzerinde aynı anda birden fazla kişinin çalışması da bozulma süresini ortadan kaldırabilir (örneğin, bir laboratuvar personeli sol kulakta çalışırken, diğeri sağ kulakta çalışır).

  1. SV dokusu sNuc-Seq için kullanılacaksa, dokuyu soğutulmuş lizis tamponuna yerleştirin (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, nükleaz içermeyen suda% 0.005 nonidet P40).
    NOT: Diseksiyondan hemen sonra sekanslama yapılacaksa, protokole devam edin. Protokolün duraklatılması istenirse, SV'nin RNAlater'a yerleştirilmesiyle SV koruması mümkündür. Gece boyunca 4 ° C'de saklayın, ardından sıvı azotta dondurun ve kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez çözün ve yıkayın, ardından homojenizasyona devam edin (adım 5.2).
  2. Buz üzerinde 10-20 vuruşla 2 mL'lik bir sıçrama homojenizatöründe dokuyu homojenize edin.
    NOT: Cam silindir, SV'yi parçalayarak cam tüpün tabanına manuel olarak temas edecektir. SV hassastır, bu nedenle 20 strok genellikle başarılı homojenizasyon sağlar.
  3. Dokuyu 25 dakika boyunca buz üzerinde lize edin.
    NOT: Lizis süresi doku tipine göre değişir. SV dokusunda 25 dakikalık bir lizis, düşük bir hücre canlılığı (% 4'ten az) elde edebilir, ancak hücre canlılığı çok yüksekse zaman adapte edilebilir (adım 5.8).
  4. 30 μm'lik bir filtreden süzün ve filtreyi 500 x g'de 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
  5. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL çekirdek yıkama ve resüspansiyon tamponunda (1x PBS,% 1 sığır serum albümini [BSA], 0.2U / μL RNaz inhibitörü) yeniden askıya alın.
  6. Hücreleri 10 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı çıkarın ve 50 μL çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponunda yeniden askıya alın.
  8. Bir hücre sayacı ve tripan mavisi boyama kullanarak çekirdekleri sayın. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 5 μL'sini 50 μL 1x PBS'ye seyreltin; Bu noktada canlılık minimum düzeyde (%3-%4) olmalıdır. Canlılığın daha yüksek olduğu tespit edilirse, protokolü adım 5.3 (lizis) için uyarlayın ve hücrelerin yeterli parçalanmasını sağlamak için lizis süresini standartlaştırın.
    NOT: Tek bir çekirdek preparatında yüksek hücre canlılığı, istenenden daha fazla sağlam hücre olduğu ve ek sindirim gerekebileceği anlamına gelir.
  9. İstenilen nükleer yoğunluktaki numuneyi üreticinin cihazına/çipine yükleyin (üretici kılavuzuna bakın). Tek çekirdekli yakalamalar artık hazır.
    NOT: Bir yetişkin fare SV'den, genellikle 150.000 çekirdek/mL konsantrasyonda süspansiyonun 50 μL'si elde edilir.

6. SV tek çekirdekli dizileme

  1. Örnekleri sıralama için çekirdek tesise gönderin.
    NOT: Protokolün bu kısmı, (1) jel boncuk içinde emülsiyon (GEM) üretimi ve barkodlama, (2) GEM-RT sonrası temizleme ve cDNA amplifikasyonu ve (3) 3' gen ekspresyon kütüphanesi yapımının genel adımlarını izlemektedir. sNuc-Seq protokolünün geri kalanı nispeten uzundur ve okuyucuların üreticiye özgü protokollerini kullanmaları önerilir. Üretici kılavuzu büyük olasılıkla belirli ayrıntıları ve beraberindeki görüntüleri içeren adımları açıklayacaktır. Üreticinin web sitesinde 'nasıl yapılır' videoları da olabilir. Oluşturulan veri kümeleri, tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu gibi boyutsal olarak azaltılmış bir şekilde temsil edilebilir (UMAP; Şekil 3). Birçok laboratuvar, kullanıcılar için bu protokolü gerçekleştirebilecek bir sıralama çekirdeği kullanır.

7. SV immün boyama ve doku montajı

  1. Doku immün boyama için kullanılacaksa, 24 delikli bir plakaya aktarın, 1x PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Tüm sıvı giderme, yıkama ve immün boyama işlemlerini mikroskop altında yapmak yararlıdır. Pipetleme sırasında dokuyu görselleştirmek, sıvının çıkarılması sırasında yanlışlıkla kaybolmamasını sağlayacaktır. Antikorların ve yıkamaların hacimleri, hacim SV dokusunu çözelti içine batıracak kadar büyük olduğu sürece ayarlanabilir.
  2. Sabitleme adımından sonra, düşük (30-50) RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (yaklaşık 500 μL) iki kısa yıkama yaparak PFA'yı çıkarın. Saklanıyorsa, doku 4 ° C'de 1x PBS'de saklanabilir.
  3. PBS'yi çıkarın ve yaklaşık 300 μL PBS-T çözeltisinde (% 10 fetal sığır serumu ile 1x PBS'de 0.05 Tween20) oda sıcaklığında en az 1 saat geçirgenleştirin ve bloke edin.
    NOT: Birincil ve ikincil antikorlar bu bloke edici çözelti içinde seyreltilmelidir.
  4. Dokuyu, kullanılan belirli antikorun özelliklerine göre, genellikle gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile lekeleyin. Kalan PBS'yi çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin.
    NOT: Seyreltme, üretici önerilerine, yayınlanan verilere, önceki deneyimlere vb. Göre seçilmelidir. Genellikle, test edilecek ilk konsantrasyon 1:100-200 seyreltmedir. Bu makalede sunulan örnekte, GS-IB4 ve DAPI antikorlarının her biri 1:200'de seyreltilmiştir. Birden fazla protein için boyama yapılırsa, ikincil antikorların çapraz reaktivitesini önlemek için her birincil antikorun farklı bir konakçısı olduğu sürece, birden fazla birincil antikor aynı çözeltide birleştirilebilir.
  5. Birincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca iki kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın.
    NOT: SV dokusunun çözeltiye batırıldığından ve kuyunun yan tarafına sıkışmadığından emin olmaya devam edin.
  6. Kullanılan belirli bir antikorun özelliklerine göre ikincil bir antikor ile leke, genellikle düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat boyunca. 24 delikli plakayı örtün, böylece floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikor ışıktan korunur.
    NOT: Birden fazla ikincil antikora ihtiyaç duyulursa, ikincil antikorları aynı çözeltide birleştirin. Çapraz etiketlemeden kaçındığınızdan emin olun.
  7. İkincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca dört kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın. 24 delikli plakayı ışıktan korumak için kapalı tutun.
  8. 25 mm eksen boyunca, 18 mm x 18 mm daha küçük cam kapak kaymasından sadece daha küçük olan iki küçük yapıştırıcı çizgisi yerleştirerek daha büyük mikro slaytı (75 mm x 25 mm) hazırlayın. Tutkal çizgilerinin arasına bir damla montaj reaktifi (yaklaşık 50 μL) yerleştirin.
    NOT: Tutkal az miktarda dikey alan oluşturur, böylece ikinci kapak kayması üste yerleştirildiğinde, SV doku örneği güvenli bir şekilde var olabilir, ancak yerinde kalmaya devam edebilir. Stria kalınlığı 30-40 mikron iken, morfolojiyi korumak için cam yüzeyler arasındaki dokunun sıkılmasından kaçınılmalıdır. Alternatif olarak, şeffaf bant da kullanılabilir.
  9. #55 forseps kullanarak, SV'nin bir ucunda mümkün olduğunca az doku tutun ve PBS'den daha büyük mikroslayttaki (75 mm x 25 mm) montaj reaktifinin damlasına aktarın. Daha küçük bir cam kapak kapağının (18 mm x 18 mm) bir ucunu, bir yapıştırıcı çizgisinin yerleştirildiği slayta yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşturmamak için yavaşça serbest bırakın. Kapak kayması diğer tutkal çizgisine düşecek ve SV dokusunu kaplayacaktır.
  10. Montajın her köşesine bir damla şeffaf oje sürerek montajı kapatın. Numuneyi, görselleştirme alanından uzaktaki cam kapak üzerinde uygun şekilde etiketleyin. Artık konfokal mikroskopi için hazırdır (Şekil 4).
  11. SV dokusunu, herhangi bir hava kabarcığının yakınında değil, düz bir şekilde uzandığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görselleştirin. SV dokusu doğru yönlendirilmemişse, kullanıcı hava kabarcıklarını dışarı itmeyi deneyebilir veya daha küçük cam kapak kaymasını dikkatlice çıkarabilir ve SV'yi yeniden konumlandırabilir. Bu, cam kapakların kırılmasını önlemek için nazikçe yapılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, SV'yi sNuc-Seq veya immün boyama için kullanılacak şekilde izole etmek için bir yöntem sunuyoruz. Kokleanın SV'ye göre ilgili anatomisi (Şekil 1), kullanıcıların SV'nin organizasyonunu ve diseksiyon protokolünün adımlarını daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir.

SV'nin bir P30 fareden bu mikrodiseksiyonunun her adımı ilişkili videoda detaylandırılmıştır ve SV'nin bu diseksiyonu ve izolasyonunun temel adımlarının anlık görüntüleri

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tek hücreli dizilemenin ortaya çıkmasından önce, birçok araştırmacı toplu doku analizi kullandı, bu da sadece hücreler arasında ortalama transkriptomları analiz etmeyi mümkün kıldı. Özellikle, tek hücreli ve sNuc-Seq, sırasıyla tek bir hücrenin veya tek çekirdeğin transkriptomunu izole etmeyi mümkün kılmıştır32. Bu örnekte, marjinal, ara ve bazal hücrelerin yanı sıra iğ hücreleri30 için tek çekirdekli transkriptomlar tanımlanabilir. Bu, SV hücre tipleri arasında transkripsi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen NIH'nin Intramural Araştırma Programı, NIDCD to M.H. (DC000088) tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10-&mikro; m filtre (Polietilenentereftalat)PluriSelect#43-50010-01sNuc-Seq sırasında filtre dokusu
18 x 18 mm kapak camıFisher Scientific12-541Amontajına kapak kayması
; m filtresi (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50030-03sNuc-Seq sırasında filtre dokusu
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978ZFarelere monte etmek için Microslide
Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664SV'nin ara hücrelerinde daha kolay görülen pigmente sahip genel amaçlı fare türü.
Hücre SayacıLogoları BiosystemsL20001Hücre sayımı için kullanılır
Chalizon küret 5 '', boyut 3 2,5 mmBiyomedikal Araştırma Aletleri15-1020SV
Chromium Next GEM tek Hücreli 3' GEM Kiti v3.1KromPN-1000141Tek hücreli 3' gen ekspresyon kitaplıkları oluşturur
Şeffaf ojeFisher ScientificNC1849418SV montajlı
Corning Falcon Standart Doku Kültürü KaplarınıCorning08-772BDiseksiyon sırasında numuneyi tutmak için kullanılan kültür kabı
DAPIInvitrogenD1306, RRID: AB_2629482Çekirdek etiketleme için kullanılan
Dounce homojenizatörSigma-AldrichD8938sNuc-seq
Dumont #5 Forsepsiçin dokuyu homojenize etmek için kullanılırGüzel Bilim Araçları11252-30Diseksiyon için genel forseps
Dumont #55 ForsepsGüzel Bilim Araçları11255-20SV manipülasyonunu kolaylaştıran ince uçlu forseps
Fetal Sığır SerumuThermoFisher16000044sNuc-Seq adımları için kullanılır
Tutkal çubuğuFisher ScientificNC0691392SV
GS-IB4 Antikor ProblarI21411, RRID: AB-2314662Kılcal etiketleme için kullanılan antikor
KCNJ10-ZsGreen Farelern/an/aKCNJ10-ZsGreen'i eksprese eden transgenik fare, kısmen SV'nin ara hücrelerinde.
MgCl2ThermoFisherAM9530GsNuc-Seq
Montaj reaktifiThermoFisher#S36940için montaj reaktifi
353047NaClThermoFisher AAJ216183 immün boyama için kullanılan
ThermoFishersNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9sNuc-Seq adımları için kullanılır
Nükleaz içermeyen suThermoFisher4387936sNuc-Seq
Orbital çalkalayıcıSessiz ShakeSYC-2102Aimmün boyama adımları için kullanılır
. APİmmün boyama ve diseksiyon RNA aşamaları için kullanılır
Daha sonraInvitrogenAM7021sNuc-Seq Scizzors için SV'nin korunması için kullanılır
Güzel Bilim Araçları14058-09Fare kafatasını bölmek için kullanılır
Tris-HClSigma-Aldrich15506017sNuc-Seq
Trypan mavi lekesiGibco15250061Hücre sayımı için kullanılır
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP sNuc-Seq adımları için kullanılır
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomikroskopDiseksiyonlar için kullanılanZeissn/a
SV 30-µ SV'yi C57BL/6J sızdırmaz hale getirmek için kullanılır, 24 kuyulu leke Moleküler montajı için kullanılır SV Multiwell 24 kuyulu plaka plaka adımları için kullanılır adımları için kullanılır PBS ThermoFisher J61196'nın adımları için kullanılır Mikroskop

Kaynaklar

  1. Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
  2. Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
  3. Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
  4. Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
  5. Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
  6. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
  7. Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).
  8. Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
  9. Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
  10. Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
  11. Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
  12. Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682(2023).
  13. Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).
  14. Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
  15. Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
  16. Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
  17. Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
  18. Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).
  19. Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
  20. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  21. Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
  22. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30(2004).
  23. Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
  24. Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
  25. Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. Tissue-resident macrophages in the stria vascularis. Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).
  26. Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).
  27. Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
  28. Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).
  29. Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
  30. Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).
  31. Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
  32. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  33. Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).
  34. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  35. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  36. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
  37. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  38. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare KulaStria Vascularis DiseksiyonuKokleasal Lateral Duvarekirdek zolasyonuKonfokal G r nt lemeEndokokleer PotansiyelT y H cresi Mekanotransd ksiyonu
Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.