Yöntem makalesi

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

DOI:

10.3791/65258

⸱

12 Ocak 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroSiM (μSiM), kan-beyin bariyerini (BBB) modellemek için membran bazlı bir kültür platformudur. Geleneksel membran tabanlı platformlardan farklı olarak μSiM , deneycilere canlı hücre görüntüleme, 'kan' ve 'beyin' odaları arasında engelsiz parakrin sinyalleme ve membranların çıkarılmasına/yeniden birleştirilmesine gerek kalmadan immünofloresanı doğrudan görüntüleme yeteneği dahil olmak üzere yeni yetenekler sağlar. Burada, ultra ince nano gözenekli silikon-nitrür membranlar kullanarak BBB'nin monokültür (endotel hücreleri) ve ko-kültür (endotel hücreleri ve perisitler) modellerini oluşturmak için platformun temel kullanımını gösteriyoruz. Hem primer hücre kültürleri hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürleri ile uyumluluk gösteriyoruz. İmmünofloresan boyama yoluyla BBB modellerinin kalitatif analizi için yöntemler sağlıyoruz ve küçük moleküllü geçirgenlik testinde bariyer fonksiyonunun kantitatif değerlendirmesi için μSiM'nin kullanımını gösteriyoruz. Sağlanan yöntemler, kullanıcıların platform üzerinde bariyer modellerini oluşturmalarını sağlamalı ve insan dokularını incelemek için doku çipi teknolojisinin kullanımını ilerletmelidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı dokular, bariyerler oluşturan ve koruyan ve hangi hücrelerin ve moleküllerin bir bölmeden diğerine taşınacağını düzenleyen özel hücreler tarafından bölümlere ayrılır. Bariyer fonksiyonlarının yanlış düzenlenmesi hem akut hastalıkların hem de kronik hastalıkların kaynağı olabilir. Kan-beyin bariyeri (BBB), insan vücudundaki en kısıtlayıcı doku bariyeridir1. BBB'nin işlev bozukluğu, Alzheimer hastalığı 2, Parkinson hastalığı3,4 ve multipl skleroz 5,6 dahil olmak üzere çok çeşitli merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının temelini oluşturur. BBB'nin yaralanması, sepsis7, COVID-198 ve postoperatif deliryum9 gibi akut bozuklukların bir sonucu olarak uzun vadeli bilişsel bozuklukla da bağlantılıdır. Beyin bozukluklarını tedavi etme potansiyeline sahip ilaçların geliştirilmesi, beyindeki hedeflere biyoaktif moleküller iletmek için BBB'yi kasıtlı olarak ihlal etme zorluğu nedeniyle sinir bozucu derecede zor olmuştur10. Bu nedenlerden dolayı, BBB fonksiyonunu in vitro olarak inceleme yöntemleri, CNS hastalıklarının anlaşılması ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır.

Bariyer fonksiyonunu in vitro ölçmek için temel yöntemler, yarı geçirgen bir membran üzerinde tek tabaka veya ko-kültürün oluşturulmasını ve hücrelerin küçük molekül difüzyonuna veya küçük elektrik akımlarına verdiği direncin ölçülmesini içerir11,12,13,14. Mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) ortaya çıkışı, BBB'yi 3D olarak modellemek için çok sayıda seçenek üretmiş olsa da,15,16, sistem geometrilerinin çeşitliliği, MPS veya yerleşik literatür değerleri arasındaki geçirgenlik ölçümlerini karşılaştırmayı zorlaştırmaktadır. Güvenilir temel değerlerin oluşturulması, beyin vasküler endotel hücreleri tarafından kapsamlı bariyer regülasyonu nedeniyle, in vitro geçirgenlik değerlerinin yüksek oranda incelendiği BBB araştırmalarında özellikle önemlidir12,17,18. Bu nedenlerden dolayı, 2D membranlar üzerine kurulan tek tabakalar arasındaki geçirgenlik ölçümleri, önümüzdeki yıllarda BBB çalışmalarında temel bir unsur olmaya devam edecektir. Bu, in vitro modelleri doğrulamak ve karşılaştırmak için temel geçirgenliğin mutlak değerlerinin kullanıldığı epitel bariyerleri de dahil olmak üzere diğer doku bariyerleri için geçerlidir 19,20,21.

BBB araştırma topluluğu için değerli yeni bir araç oluşturmak amacıyla, son 5 yılda bariyer doku modellemesinde kullanılmak üzere silicon membran (μSiM) platformuna sahip mikro cihazı22 vegelişmiş 23,24,25,26'yı tanıttık. Platformun etkinleştirici özelliği, yüz milyonlarca nano gözenek27,28 veya nano gözenek ve mikro gözeneklerin 29 bir karışımı olan ultra ince (<100 nm kalınlığında) bir zardır. Serbest duran membran çipleri, ultra ince yapıları 30 stabilize eden ve cihaz montajı için cımbızla tutulmalarına izin veren300 μm'lik bir silikon 'çip' üzerinde üretilir. Ultra ince yapıları nedeniyle, membranlar, ticari membran kültürü cihazlarında kullanılan geleneksel rayla oyulmuş membranlardan iki kat daha yüksek bir geçirgenliğe sahiptir31,32. Pratikte bu, zarın nanogözeneklerden (<60 nm) daha küçük moleküllerin difüzyonuna engelinin ihmal edilebilir olduğu anlamına gelir33. Bu nedenle, hücresel bariyerler için, sadece hücreler ve biriktirdikleri matrisler, zar34 tarafından ayrılan apikalden bazal bölmelere küçük molekül taşıma hızını belirleyecektir. Cihaz tasarımı ve membranların ultra ince yapısı da optik mikroskopi için birçok avantaj sağlar. Bunlar arasında 1) faz kontrastı veya parlak alan görüntüleme kullanarak canlı kültürleri takip etme yeteneği, 2) membranı çıkarmaya ve bir kapak camına aktarmaya gerek kalmadan floresan olarak boyama ve yerinde görüntüleme yeteneği ve 3) membranların konfokal 'dilimlerden' daha ince olması, böylece doğrudan ko-kültürlerin hücre tipleri arasında 6-10 μm kalınlığında iz kazınmış membranlarla elde edilebilenden daha doğal bir boşluğa sahip olması.

Son zamanlarda, hızlı montajı 34 ve özelleştirmeyi 35,36 kolaylaştırmak için platformu modüler bir formata yükselttik. Cihaz bileşenlerini biyomühendislik ve işbirliği yapan beyin bariyeri laboratuvarlarımız arasında dağıtmak için modüler formattan yararlandık. Daha sonra cihaz montajı, monokültür ve ko-kültür, immünofloresan boyama ve küçük molekül geçirgenliği için ortaklaşa protokoller geliştirdik ve bu yöntemlerin laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir olduğunu gösterdik. Bu protokolleri kullanarak, modüler platformun, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) beyin mikrovasküler benzeri endotel hücreleri (BMEC) oluşturmak için genişletilmiş endotel kültürü yöntemi (EECM) kullanılarak geliştirilen doğrulanmış bir BBB'yi desteklediğini de gösterdik37. Mevcut raporun amacı, bu yöntemleri daha ayrıntılı olarak gözden geçirmek ve beraberindeki videonun yardımıyla, platformun BBB topluluğunda daha geniş çapta benimsenmesini kolaylaştırmaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. μSiM cihaz montajı

NOT: Bu yöntem, aygıtların montajını açıklar. Membran çipi, hendek yukarı veya hendek aşağı monte edilebilen bir hendek kenarına ve düz tarafa sahiptir. Hendek açma cihazları en yaygın olarak hücre kültürü için kullanılır.

  1. Steril bir ortamda (yani bir biyogüvenlik başlığı), montaj armatürleri, bileşenler, membran yongaları ve cımbız dahil olmak üzere tüm malzemeleri montaj için hazırlayın.
  2. Membran çipini, çip cımbızı kullanarak A1 fikstürünün ortasına yerleştirin. Çipin düz yüzeyi aşağı bakar ve hendek açma alanı hendek açma cihazları için yukarı bakar ve kanal açma cihazları için bunun tersi de geçerlidir.
    NOT: Aşağıdaki montaj adımları, örnek olarak, üst bölmede düz bir büyüme alanına izin veren hendek açma cihazı kullanılarak gösterilmiştir.
  3. Bileşen 1'i çipe yapıştırın. İlk olarak, düz cımbız kullanarak bileşen 1'in her iki tarafındaki mavi koruyucu katmanları soyun ve üst bölme aşağı gelecek şekilde A1 fikstürüne yerleştirin. Basınca duyarlı yapıştırıcı (PSA) çipe temas edene kadar bileşen 1'i hafifçe aşağı doğru bastırın.
  4. A2 fikstürünü A1 fikstürüne yerleştirin ve talaş ve bileşenin sıkıca oturmasını sağlamak için farklı köşelere sıkı bir basınç uygulayın.
    NOT: PSA katmanını çıkarmadığınızdan emin olun. Mavi koruyucu katmanlara göre daha şeffaf ve sert bir katmandır.
  5. Bileşen 2'yi çip ile bileşen 1'e bağlayın. İlk olarak, bileşen 2'nin bir köşesini düz cımbızla tutup tabakadan sıyırarak bileşen 2'yi hazırlayın. Ardından, bileşen 2'nin PSA olmayan "üçgen" bölgesini tutun ve birlikte PSA yüzeyini açığa çıkaran kalın, şeffaf koruyucu tabakayı ve bileşen 2'nin mavi tabakasını çıkarın. Bileşen 2'yi PSA tarafı yukarı bakacak şekilde B1 fikstürüne yerleştirin.
  6. Bileşen 1'i, membran çipi üst bölme yukarı bakacak şekilde B1 fikstürüne yerleştirin.
  7. B2 fikstürünü bileşen 1'e yerleştirin ve fikstür B2'nin farklı köşelerine sıkı bir basınç uygulayın.
  8. Monte edilmiş cihazı armatürden çıkarın ve cihazın alt tarafındaki hava kabarcıklarını bastırmak için düz cımbız kullanın ve membran bölgesi ile temastan kaçınarak kanalın kenarlarını kapatın. Hücre kültürü için kullanmadan önce, yeni monte edilen cihazları 20 dakika boyunca ultraviyole (UV) ile sterilize edin.

2. Hücre kültürü

NOT: Bu yöntem, platformdaki birincil ve hiPSC'den türetilen kültürler için protokolleri açıklar. Yöntemler, cihazın üst bölmesinde endotel hücre monokültürünü ve alt odacıkta perisitler ve hendek aşağı monte edilmiş cihazların üst odasında endotel hücreleri ile perisit ve endotel hücre ko-kültürünü tanımlar. Hazne boyutları ve hacimleri için Tablo 1'e bakınız. Bunlar en yaygın biçimlerdir; Bununla birlikte, kullanıcı ihtiyaçlarına bağlı olarak diğer hücre kültürü düzenleri kullanılabilir.

  1. Hücre kültürü odası hazırlığı
    1. Cihazları bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre monte edin.
    2. Cihazları steril hortum kelepçelerine yerleştirin. Hücre kültüründen önce, kelepçeleri ≥20 dakika etanolde bekleterek sterilize edin. Her deneyden sonra yeniden kullanım için yeniden sterilize edin.
    3. Cihazları büyük bir steril Petri kabında kültürleyin. Ekstra nem için, steril suyla doldurulmuş küçük bir Petri kabı veya 50 mL konik tüp kapağı ekleyin.
    4. Cihazların üst haznesini iki kez 100 μL steril su ile yıkayın. Alt hazne hücre kültürü için, alt hazneyi 20 μL steril su ile yıkayın.
  2. hCMEC/D3 hücre hattı (BBB) monokültürü
    1. Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
    2. Üst bölmeleri 25 μg / cm2 kollajen I ve 5 μg /cm2 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karıştırılmış insan fibronektini ile kaplayın. 37 °C'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 °C'de bekletin.
    3. Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 100 μL önceden ısıtılmış büyüme faktörü tükenmiş endotel ortamı (Test ortamı) ve alt hazneye 20 μL ekleyin. Test ortamını hazırlamak için 100 mL endotelyal bazal ortam + 400 μL insan fibroblastik büyüme faktörü + 40 μL hidrokortizon + 100 μL gentamisin sülfat + 2 mL fetal sığır serumu karıştırın.
    4. Üreticinin protokolüne göre hCMEC / D3 hücrelerinin geçişi; hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca tripsinize edin ve ardından önceden ısıtılmış endotelyal ortam ilavesiyle tripsinizasyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini tahlil ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri üst bölmelerde 40.000-60.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için cihazları 37 °C'de %5 karbondioksit (CO 2) ile2-4 saat inkübe edin. Örneğin, 0.37 cm2 çip üzerinde 40.000 hücre/cm2 elde etmek için, üst hazneye 150.000 hücre/mL konsantrasyonda 100 μL hücre çözeltisi ekleyin.
      NOT: Hudecz ve ark.38'e göre, hücre bakımı için endotelyal büyüme ortamı-2'nin (EGM-2) modifiye edilmiş bir formülasyonunu ve tahliller için alt kültürden sonra büyüme faktörü azaltılmış bir "tahlil ortamı" kullanarak hCMEC/D3'ü kültürledik ve pasajladık. Diğer medya formülasyonları cihazlarla uyumlu olmalıdır, ancak kullanıcılar hCMEC/D3 sağkalımı ile ilgili sorunlar yaşarsa Hudecz ve ark.38'in medya formülasyonlarını öneririz.
    5. Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze tahlil ortamı ile değiştirin.
    6. Cihazları %5 CO2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her 2-3 günde bir her iki odadaki tahlil ortamını değiştirin. Tahliller tipik olarak 2 haftalık kültürden sonra gerçekleştirilir.
  3. hiPSC'den türetilen EECM-BMEC benzeri hücre monokültürü
    1. Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
    2. 1 mg / mL'lik bir çözelti oluşturmak için 5 mg kollajen IV'e 5 mL 0.5 mg / mL asetik asit ekleyerek insan plasenta çözeltisinden kollajen IV hazırlayın. Çözeltinin tamamen sulanması için 4 ° C'de ≥4 saat bekletin. Çözelti 4 °C'de 2 hafta stabildir.
    3. Üst bölmeleri 100 μL 4:1:5 oranında kollajen IV, sığır fibronektini ve steril su ile kaplayın. 37 °C'de 2-4 saat kaplayın.
    4. Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 100 μL oda sıcaklığında hECSR ve alt hazneye 20 μL ekleyin.
    5. Nishihara ve ark.37'ye göre geçiş EECM-BMEC benzeri hücreler; hücrelere bir hücre ayırma enzim karışımı ekleyin ve 5-8 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre aktarın. Hücre çözeltisini tekilleştirmek için pipetleyin ve bir santrifüj tüpündeki endotel ortamının hacminin 4 katına ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin; hECSR'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve üst odacıklarda 40.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için cihazları 37 °C'de %5CO2 ile 2-4 saat inkübe edin. Örneğin, 40.000 hücre/cm2 elde etmek için, 150.000 hücre/mL'de 100 μL'lik bir hücre çözeltisi ekleyin.
    6. Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze hECSR ile değiştirin.
    7. Cihazları %5 CO 2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her1-2 günde bir her iki bölmede hECSR değiştirin. Tahliller tipik olarak kültürün 6. gününde yapılır.
  4. hCMEC/D3 ve primer insan beyni vasküler perisit (HBVP) ko-kültürü
    1. Cihaz montajından önce, membran yongalarını PBS'de karıştırılmış 2 μg/cm2 poli-L-lizin (PLL) ile kaplayın. 50-80 μL PLL'yi bir damlacık halinde yalnızca son cihaz düzeneğinde aşağı bakacak tarafa uygulayın. Kaplama işlemini 37 °C'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 °C'de tamamlayın.
    2. Kaplama çözeltisini çıkarın. Membran talaşlarını steril ultra saf suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin.
    3. Cihazları, PLL kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde yukarıdaki bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre monte edin ve hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
    4. Üst bölmeleri bölüm 2.2.2'ye göre kaplayın.
    5. Üst bölmelere 50 μL önceden ısıtılmış perisit ortamı ekleyin ve alt kanallara 20 μL ekleyin.
    6. Geçiş HBVP'leri üreticinin protokolüne göre; Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca tripnize edin, ardından önceden ısıtılmış perisit ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini perisit ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri alt odacıklarda 14.000-25.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Cihazları ters çevirin, ancak gaz değişimini kolaylaştırmak için üst odacıklarla bir hava arayüzü sağlayın.
      NOT: Ters çevirme sırasında gerekli olan hava arayüzü, cihazları hortum kelepçelerinin içine yerleştirdikten sonra çevirerek ve çevirmeden önce tüm köşeleri aşağı doğru iterek veya cihazları, üst bölmeleri engelsiz tutmak için yeterince aralıklı paralel akrilik veya silikon şeritler üzerine baş aşağı yerleştirerek elde edilebilir. Tohumlama yoğunluğunun her kullanıcı için optimize edilmesi gerekebilir. 14.000 hücre/cm2 elde etmek için, ~590.000 hücre/mL'de 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Kabarcıkları önlemek için alt hazneye 20 μL pipetlendiğini, ancak yoğunluğun 10 μL'lik alt hazne hacmi kullanılarak hesaplandığını unutmayın.
    7. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için hücreleri 37 ° C'de% 5 CO 2 ile ters pozisyonda2-4 saat inkübe edin.
    8. Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, cihazları dik olarak çevirin ve ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze perisit ortamı ile değiştirin.
    9. Perisit tohumlamadan sonra, 2.2.4-2.2.5 adımlarını izleyerek üst bölmede hCMEC/D3'leri tohumlayın. Her iki odayı da tahlil ortamına geçirin.
    10. Cihazları %5CO2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her 1-2 günde bir her iki odada da test ortamı değiştirin. Birincil hücre ko-kültürü genellikle tahlillerden 6-8 gün önce korunur.
      NOT: HBVP monokültürleri hCMEC/D3 monokültürleri veya hCMEC/D3 ve HBVP ko-kültürleri ile karşılaştırılacaksa, HBVP'lerin tohumlanmasından 2-3 gün sonra perisit ortamını test ortamı ile değiştirin.
  5. hiPSC'den türetilen EECM-BMEC benzeri hücre ve beyin perisit benzeri hücre (BPLC) ko-kültürü
    1. Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın ve üst bölmeleri 2.3.2-2.3.3 adımlarına göre kaplayın.
    2. Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 50 μL oda sıcaklığında Essential 6 Medium + Fetal Sığır Serumu (E6 + FBS) ekleyin.
    3. BPLC'leri Gastfriend ve ark.39'a











    2. figure-protocol-1


    3. figure-protocol-2

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hendek açma cihazının montajı Şekil 1'de gösterilmektedir. Fikstürler, bileşenlerin ve membran çipinin montajına rehberlik eder. Bileşen 1, çipe yapıştırmak için bir PSA yüzeyi ve alt bölmeye bir açıklık ve alt bölmeye pipet erişimi için bağlantı noktaları ile esas olarak akriliktir. Bileşen 2, kanal katmanıdır ve kavrama için sağ üstte yapışkan olmayan, PSA içermeyen bir "üçgen" içerir. Hendek açma cihazları, üst bölmede düz bir hücre kültürü büyüme alanı sağlarken, açma cihazları, alt bölmede hücre kültürü için düz bir yüzeye sahiptir.

Nikon Eclipse Ts2 faz kontrast mikroskobu ve 10x objektif kullanarak hCMEC/D3 ve HBVP'lerin ve hiPSC IMR90-4'ten türetilen EECM-BMEC benzeri hücrelerin ve BPLC'lerin endotelyal monokültürleri ve ko-kültürleri gerçekleştirdik ve faz görüntüleri elde ettik (Şekil 2). Birincil hücre kültürü için en uygun tohumlama yoğunlukları (tohumlamadan 1 gün sonra alınan görüntüler) ve ayrıca tohumlanmış HBVP'ler gösterilmiştir (Şekil 2A). Nihai kokültür ve monokültür faz görüntülerinin (6 günlük endotel hücre kültürü) ayırt edilmesi zor olabilir (Şekil 2C) ve başarılı primer hücre ko-kültürünün doğrulanması immünofloresan boyama gerektirebilir (bkz. protokol bölüm 3). Düşük, yüksek ve optimal hiPSC'den türetilen BPLC tohumlama yoğunlukları da gösterilmektedir (Şekil 2B). hiPSC'den türetilen ko-kültür, primer ko-kültürlere kıyasla faz kontrast görüntülemede ayırt etmek için daha açıktır (Şekil 2D

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran yongaları stabilite için tasarlanmış olsa da, montaj sırasında yanlış kullanılırsa çatlayabilir veya kırılabilir. Bu nedenle, çipi çip cımbız çentiklerinde kavramak ve yavaşça fikstüre yerleştirmek çok önemlidir. Cihazları genel olarak tutarken, cihazlara çarpmamak veya düşürmemek için ekstra önlem alınmalıdır. Membran çipinin A1 fikstürüne bağlanması sırasında, bileşen 1'e bağlanma sırasında membran çatlamasını önlemek için çip düz bir şekilde yerleştirilmeli ve fikstür A1'in direğine ortalanmalıdır. Ayrıca, koruyucu maskeler çıkarıldıktan sonra açıkta kalan PSA katmanlarıyla herhangi bir temastan kaçınılmalıdır. Koruyucu maskelerin çıkarılmasının ardından bileşen 2'yi tutarken, bileşenin kenarı boyunca tutmanız ve PSA içermeyen üçgen köşeyi tutmak için cımbız kullanmanız önerilir.

Olası BBB modelleri için hücre kültürü protokolleri tanımlanmış olsa da, burada açıklanan BBB'nin BMEC/perisit ko-kültür modeli, fizyolojik bağlama ve ilgilenilen sorulara bağlı olarak yeterli veya yetersiz olabilir. Örneğin, bağışıklık hücresi kaçakçılığı büyük ölçüde beynin postkapiller venüllerinde meydana gelir41,42. Bu bölgelerde, bir perivasküler boşluk, BMEC / perisit bariyerini astrositler tarafından oluşturulan glial limitanslardan ayırır. Bu nedenle, postkapiller venüllerde, nörovasküler ünite (NVU) seri olarak fiziksel olarak ayrılmış iki bariyer içerir ve astrositik uç ayaklar, mevcut model tarafından iyi temsil edilen BMEC / perisit kan bariyerine doğrudan temas etmez. Amaç, astrosit tarafından salgılanan faktörlerin kan bariyeri üzerindeki etkisini açıklayan bir NVU modeli ise, cihaza perivasküler boşluktan çözünür faktör değişimine izin veren bir astrosit bölmesi eklenebilir. Bu örnek daha önce 34 gösterilmişti ve bir3D 'beyin' bölmesindeki mikroglia ve nöronlar gibi diğer hücreleri içerecek şekilde genişletilebilir. Platformun modüler mimarisi, bu yeniden yapılandırmaları gerçekleştirmek için basit montaj stratejilerinin kullanılmasını sağlar, böylece platform eldeki hipotezleri ele almak için gerektiği kadar basit veya karmaşık olur. Her hücre kültürü kurulumu; ancak, yeni hücre hatları ve çoklu kültürler için optimize edilmelidir. Örneğin, silikon-nitrür membranların özellikleri nedeniyle, doku kültürü plakalarına kıyasla kaplama çözeltilerinin ayarlanması gerekebilir. Fibronektinin dahil edilmesi tipik olarak hücre bağlanmasına ve hayatta kalmasına yardımcı olur. Ayrıca, kullanıcılar endotel hücrelerini ve perisitleri zıt yönlerde kültürleyebilirler. Bu durumda, örneğin geçirgenlik ölçümlerinin yapılma ve yorumlanma şeklini değiştirmek gerekebilir. Bununla birlikte, bu tür bir kültür için adımlar sağlamak bu makalenin kapsamı dışındadır.

Hücre kültürü sırasında karşılaşılabilecek bir diğer zorluk, ortamın hızlı buharlaşmasıdır, çünkü cihazlar standart doku kültürü plakalarına ve şişelerine kıyasla ortamdaki değişikliklere karşı daha hassas olabilir. Aşırı buharlaşma görülürse veya hücre büyümesi yavaşlarsa, doğru ayarları sağlamak için tüm kritik inkübatör parametreleri ölçülmelidir. Hücre kültürü odasının içine yerleştirilen doku kapağına veya küçük Petri kabına daha fazla su eklenebilir veya ortam daha sık değiştirilmelidir. Ayrıca, kabarcıklar alt kanala girebilir ve hendek açma cihazları için hendekte sıkışabilir. Çıkarılabilseler de, ilk etapta baloncuk eklemekten kaçınmak en kolay yoldur. Bunu yapmak için, medyayı alt hazneye pipetlemeden önce pipet ucunda kabarcık veya pipet ucunun ucunda hava olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Ayrıca, kanaldaki ortam buharlaşması, ortam yüzeyi ile bağlantı noktası üst kısmı arasında bir boşluğa yol açabilir. Ortam karşı bağlantı noktasının yüzeyine ulaşana kadar küçük bir hacimde ortam bir bağlantı noktasına pipetlenebilir, ardından ortam bu karşı bağlantı noktasında değiştirilebilir. hECSR ve E6 + %10 FBS ortamı su banyosunda ısıtılmamalıdır, ancak kabarcık oluşumunu azaltmak için diğer ortamlar önceden ısıtılabilir. Alt hazneye bir kabarcık girerse, kanaldan 100 μL'yi hızlı bir şekilde pipetleyerek çıkarılabilir. Ancak bu yöntem, cihazın yüzeyine dökülen odalar veya ortamlar arasında kontaminasyona yol açabilir. Ayrıca hücre katmanlarını da bozabilir. Alternatif olarak, ortam önce kanaldan çıkarılabilir ve ardından 50 μL'lik bir hacimle yeniden verilebilir. Bununla birlikte, önce medyayı çıkarmak, kanalda daha fazla kabarcık oluşumuna neden olabilir. Bir kabarcık doğrudan zar alanının altında değilse, hücre kültürü üzerinde hiçbir etkisi olmadan kanalda bırakılabilir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi perisit bağlanması ve büyümesi zor olabilir. Optimize edilmiş bir tohumlama yoğunluğunun kullanılması, fizyolojik olarak ilgili perisit-endotel hücre oranına sahip bir tabakanın oluşumu için gereklidir. Ayrıca, perisitler kaymaya duyarlı olduğundan, hücreleri korumak için kanaldaki tüm medya alışverişleri çok yavaş yapılmalıdır. BPLC kültürü için, alt hazne 800 μg/mL kollajen tip IV veya 100 μg/mL fibronektin ile kaplanarak daha iyi bağlantı sağlanabilir.

Burada açıklanan cihazlardaki immünositokimya, hücre sağlığı ve fonksiyonunun kalitatif analizini sağlar. Doku kültürü plakalarında veya diğer platformlarda boyama yöntemleri doğrudan platforma çevrilebilir olmalıdır. Sadece üst odadaki hücre kültürü için, fiksasyonu takiben, PBS alt bölmeye eklenebilir ve kalan adımlar için bırakılabilir, blokaj ve boyama sadece üst bölmede yapılır. Bu, membranların kırılması veya alt hazneye kabarcık girmesi risklerini en aza indirir. Ko-kültür boyama için, her iki odayı da tüm adımlarda kullanmanızı öneririz. Fiksatif ve PBS'nin viskozitesinin ortamınkinden farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, alt hazneye kabarcık eklemek daha kolay olabilir ve alt hazneye pipetlemeden önce pipet uçlarında ucun ucunda hava olup olmadığını kontrol etmek için ekstra özen gösterilmelidir.

Küçük molekül geçirgenlik deneyi için açıklanan protokol, μSiM cihazında kültürlenen endotel hücrelerinin bariyer fonksiyonunun fonksiyonel ve kantitatif değerlendirmesine izin verir. Bu test sırasında karşılaşılabilecek bir sorun, protokol adımı 4.1.7.4'teki alt kanaldan numune toplama sırasında pipete hava kabarcıkları çekilmesidir. Bu sorunu önlemek için, numune toplamaya başlamadan önce ucun porta kapatıldığından emin olmak önemlidir ve numune çok hızlı çekilmemelidir. Bu sorunu çözmezse, kullanılan uçların boyutu bağlantı noktalarına sığamayacak kadar küçük veya çok büyük olabilir; Malzeme Tablosunda listelenen ipuçlarını kullanın. Sağlıklı görünen birleşik bir tek tabakaya rağmen beklenmedik şekilde yüksek geçirgenlik değerleri ölçülürse, numune toplama sırasında tek tabakanın bütünlüğünde bozulma olup olmadığı kontrol edilmelidir. Numune alındıktan hemen sonra tek tabakayı her zaman mikroskop altında kontrol etmenizi öneririz. Tek tabaka hala sağlam ve sağlıklı görünüyorsa, numune sabitlenebilir ve bariyer fonksiyonunun biyolojik belirteçleri, örneğin bağlantı proteinlerinin immün boyanması yoluyla değerlendirilebilir. Tersine, beklenmedik şekilde düşük geçirgenlik değerleri ölçülürse, alt kanaldan herhangi bir hava kabarcığı olmadan 50 μL ortam numunesi alındığından emin olmak önemlidir. Rezervuar ucu yerleştirilir yerleştirilmez ortam numune alma portundan çıkarsa, floresan küçük molekülün çoğu alt kanaldan örneklenen ilk 10 μL hacimde bulunacağından, pipeti numune alma portuna takmadan önce bu ortam toplanmalıdır. Hidrofobik bir kalem kullanarak bağlantı noktalarının etrafına daireler çizmek veya bağlantı noktasının etrafına delikli bir hidrofobik bant yerleştirmek, pasif olarak pompalanan ortamların yayılmasını önler. Numune alma sırasında kabarcıklar geri çekilirse veya 50 μL'lik numunenin tamamı çıkarılmazsa, numune kullanılmamalıdır. Alternatif olarak, tam hacim belirlenebilir ve geçirgenlik hesaplamasında kullanılabilir; ancak bu, yalnızca çıkarılan hacim ~%98-99 boya geri kazanımına karşılık gelen ≥40 μL ise yapılmalıdır34.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L.M., SiMPore'un kurucu ortağıdır ve şirkette hisse senedi sahibidir. SiMPore, bu çalışmada kullanılan membranlar da dahil olmak üzere ultra ince silikon bazlı teknolojileri ticarileştiriyor.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. ve L.W., NIH hibesi R33 HL154249 tarafından finanse edildi. J.L.M. R44 GM137651 tarafından finanse edildi. M.M., Rochester Üniversitesi, Schmidt Program Ödülü Del Monte Sinirbilim Enstitüsü tarafından finanse edildi. M.T., RF1 AG079138 tarafından finanse edildi. K.C., Uluslararası Etik Araştırmalar Vakfı tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikorlar< / güçlü >
CD31 Poliklonal antikorThermo Fisher ScientificPA5-32321
Claudin-5 fare IgG antikoru, 4C3C2Thermo Fisher Scientific35-2500
Keçi α-Fare IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
Keçi α-Tavşan IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11011
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH3570
NG2, fare IgG2a, 9.2.27Millipore 
Oklüdin fare IgG antikoru, OC-3F10Thermo Fisher Scientific33-1500
PDGFR ve beta;, tavşan IgG antikoru, 28E1Hücre Sinyal Teknolojisi3169
VE-cadherin fare IgG2B Klonu # 123413R & D SystemsMAB9381
ZO-1 tavşan IgG antikoru, poliklonalThermo Fisher Scientific40-2200
Kimyasallar, peptitler ve rekombinant proteinler
100% MetanolVWR101443-718Benzer ürünlerle ikame edilebilir
%16 ParaformaldehitThermo Fisher Scientific28908Benzer ürünlerle ikame edilebilir
AccutaseThermo Fisher ScientificA1110501
Asetik asitSigma-Aldrich695092
B27 takviyesiThermo Fischer Scientific17504044
bFGFR& D Systems233-FB-025
İnsan plasentasından Kollajen IVSigma-AldrichC5533
Kollajen, sıçan kuyruğundan Tip I solüsyonSigma-AldrichC3867-1VLBenzer ürünlerle ikame edilebilir
DMEM/Jambon' s F12Thermo Fisher Scientific11320033
EGM-2 Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 BulletKitLonzaCC-3162
Esansiyel 6 ortaThermo Fisher ScientificA1516401
Fetal sığır serumu (FBS)Pik SerumPS-FB1
Sığır plazmasından fibronektinSigma-AldrichF1141
Fibronektin insan proteini, plazmaThermoFisher Scientific33016015Benzer ürünlerle ikame edilebilir
hESFMThermo Fisher Scientific11111044
Lucifer Yellow CH dilityum tuzuSigma-Aldrich861502
Normal keçi serumuThermo Fisher Scientific500627Benzer ürünlerle ikame edilebilir
PBS olmadan kalsiyum, magnezyumCytivaSH30256.01Benzer ürünlerle ikame edilebilir
Perisit OrtamıScienCell1201Komple kit kullanın (takviyeler içerir)
Poli-L-Lizin, 10 mg/mLScienCell0413
Triton X-100JT BakerX198-05Benzer ürünlerle ikame edilebilir
UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış SuCanlandırıcı ve ticaret;10977015Benzer ürünlerle ikame edilebilir
Deneysel modeller: Hücre hatları
Kan-beyin bariyeri hCMEC/D3 hücre hattıSigma-AldrichSCC066
İnsan beyni vasküler perisitleriScienCell1200
iPS(IMR90)-4 insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerWiCellRRID:CVCL_C437
Züccaciye ve Plastik Eşya
150 mm TC ile işlenmiş Hücre Kültürü Tabağı, 20 mm IzgaraŞahin353025
KelepçeleriVWRMFLX06832-10
Corning doku kültürü plakaları (6 oyuklu)Corning3506
Düz 96 oyuklu bağlayıcı olmayan mikroplakalarGreiner Bio-One655900
Mikroskop Slayt Cihazı Tutucu  SiMPoreUSIM-SBBoyutları Mikroposkop kayar tutucularla uyumlu
Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fischer Scientific339651
Nunc 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fischer Scientific339653Tüp kapakları hücre kültürü için su ile doldurulabilir
P20-200 pipet uçlarıVWR76322-516Alternatif markalar, Transwell filtrelerinin
(12 kuyulu, 12 mm, 0.4 & mu; m gözenek boyutu, PC)CoStar3401
Instruments
10X Objektif (Andor için)Nikon Instruments Inc.MRD00105hava; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Hedef (Nikon için)Nikon Instruments Inc.MRP40102Hava; WD: 6,2 mm; NA 0.25
40X Objektif (LWD) (Andor için)Nikon Instruments Inc.MRD77410Suya daldırma; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor İplik Diski Konfokal mikroskopOxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Faz Kontrast MikroskobuNikon Instruments Inc.Benzer ürünlerle değiştirilebilir
TECAN Infinite M200TECANBenzer ürünlerle değiştirilebilir
Diğer
Gelişmiş PAP KalemiMillipore SigmaZ6725482 mm uç önerilir
SiMPoreUSIM-JIGSETfikstürlü montaj kitiA1, A2, B1 ve B2 fikstürü dahil
Mikroskoplar için kamera adaptörü:AmScopeCA-CAN-SLR, Canon SLR / D-SLR& Phi; 23.2 - φ 30 adaptör Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Fotoğraf MakinesiCanonEOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001uyar Benzer ürünlerle değiştirilebilir
Hücre süzgeci, 40 ve mikro; mMillipore Sigma (Corning)CLS431750
Bileşen 1SiMPoreUSIM-C1
Bileşen 2SiMPoreUSIM-C2
Membran çipleriSiMPoreNPSN100-1LDiğer çip formatları mevcuttur
SMD taşıma cımbız çift açılıTechni-Tool758TW003"Çip Cımbız"
Paslanmaz çelik hassas tip GG cımbızTechni-Tool758TW534"Düz Cımbız"
Software
FijiImageJGörüntü işleme için
FusionOxford Instruments, Andor2.3.0.44 sürümü için
talimatlar i-controlTECANSürüm 2.0 için talimatlar
ImarisOxford InstrumentsGörüntü işleme için. Sürüm 9.9.0 için talimatlar
MAB2029

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671(2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685(2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111(2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21(2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Doku ipiMicroSiM PlatformuBariyer FonksiyonuGe irgenlik Deneyimm nofloresan BoyamaEndotel H creleriKo K lt r ModelihiPSC K lt rKonfokal Mikroskopi

İlgili makaleler