Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Telomerler, kromozomal uçlarda bulunan tekrarlayan dizilerdir; Kısalmaları, insan somatik hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir. Kısalma, son replikasyon ile ilgili bir sorun ve telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu olan telomeraz enziminin yokluğu nedeniyle oluşur. İlginç bir şekilde, telomerler, kirleticiler, enfeksiyöz ajanlar, besinler veya radyasyon gibi hücre dışı ajanlar nedeniyle etkilenebilecek oksidatif stres ve inflamasyon gibi çeşitli iç fizyolojik süreçlere yanıt olarak da kısalır. Bu nedenle, telomer uzunluğu yaşlanmanın ve çeşitli fizyolojik sağlık parametrelerinin mükemmel bir biyobelirteci olarak hizmet eder. TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti, telomer kısıtlama fragmanı (TRF) testini kullanarak ortalama telomer uzunluklarını ölçmek için kullanılır ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bununla birlikte, pahalı bir yöntemdir ve bu nedenle, büyük örneklem sayıları için rutin olarak kullanılmaz. Burada, Güney lekeleri veya TRF analizi ve radyoaktif olmayan kemilüminesans bazlı algılama kullanılarak telomer uzunluğunun optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Giriş
Telomerler, kromozomların sonunda bulunan tekrarlayan DNA dizileridir. TTAGGG'nin tandem tekrarlarına sahiptirler ve kromozomu hem yıpranmadan hem de son replikasyon probleminden koruyarak genom bütünlüğünü korurlar, bu da 3' çıkıntısının bir kısmının DNA polimeraz 1,2 tarafından kopyalanamayacağı anlamına gelir. Kısa telomerler, hücrelerde kromozomal anormalliklere yol açar, çünkü hücreler replikatif yaşlanma3 adı verilen bir aşamada kalıcı olarak tutuklanır. Kısa telomerler ayrıca mitokondri disfonksiyonu 4,5 ve hücre disfonks....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tablo 1 , laboratuvar yapımı reaktifleri optimize edilmiş hacimlerle birlikte listeler ve Tablo 2 , ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarını gösterir.
1. Hücre kültürü
- Telomer uzunluğu ölçülecek hücreleri (burada bir yumurtalık adenokarsinom hücre hattı olan A2780 hücreleri vardı), Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) tam ortamında, 6 cm'lik bir Petri kabında% 10 fetal sığır serumu (FBS), streptomisin, penisilin ve amfoterisi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırılan ekstrakte edilmiş genomik DNA (gDNA), Şekil 1B'de gösterildiği gibi, numunenin TRF'lerin daha aşağı akış işlenmesi için kullanılabileceğini gösteren iyi bir bütünlük göstermiştir. TRF testi daha sonra her adımda gerekli olan çözelti hacimlerinin değiştirilmesiyle gerçekleştirilmiştir (bakınız Tablo 1 ve Tablo 2). TRF sinyali açıkça görülebiliyordu (Şekil 3). Böylece, çözelti hacimler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Güney lekelemesi kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için radyoaktif olmayan, kemilüminesans bazlı bir yöntem için ayrıntılı bir prosedür tarif ediyoruz. Protokol, sonuçların kalitesinden ödün vermeden birkaç reaktifin akıllıca kullanılmasına izin verecek şekilde test edilmiştir. Prehibridizasyon ve hibridizasyon tamponu beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. Enzim konsantrasyonu, sonuçları etkilemeden 1.5-2 μg genomik DNA başına 10-20 U arasında değişebilir. DIG etiketli moleküler ağırlık belirteci ve hibridizasyon prob.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bayan Prachi Shah'a başlangıçta protokol optimizasyonunda bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Dr. Manoj Garg'a A2780 yumurtalık kanseri hücre hattını sağladığı için teşekkür ederiz. EK, Biyoteknoloji Bölümü'nden (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Bilim ve Teknoloji Bölümü (ECR/2018/002117) ve NMIMS Tohum Hibesi (IO 401405) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cell Line< / strong> | |||
| A2780 (Yumurtalık adenokarsinomu hücre hattı) | Hediye | ||
| Ekipman< / strong> | |||
| ChemiDoc XRS+ (görüntüleme ve UV çapraz bağlama için) | Biorad | Universal başlık II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Sürüm 1.3 | ||
| Materials | |||
| Asetik Asit | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amfoterisin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, ABD | ||
| DMEM | HyClone, Cytiva, ABD | SH30243.01 | |
| Etilendiamin tetraasetik asit | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, ABD | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Naylon membran | Sigma | 11209299001 | |
| Penisilin | Gibco, ThermoFisher Scientific, ABD | 15240062 | |
| Sodyum dodesil sülfat | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomisin | Gibco, ThermoFisher Scientific, ABD | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman kağıdı | GE sağlık yaşam bilimleri | 1001-917 | |
| Reaktifler< / güçlü> | |||
| 1 kb merdiven | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Canlandırıcı | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Engelleme çözümü 10x | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Cutsmart Tampon | NEB | B6004 | |
| Algılama tamponu 10x | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Kaz kolay hyb | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Hinf 1 (kite alternatif) | NEB | R0155T | |
| Yükleme Boyası | BIOLABS | N3231S | |
| Maleik asit tamponu 10x | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Moleküler işaretleyici | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Probu | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Rsa 1 (kite alternatif) | NEB | R0167L | |
| Yüzey | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 | |
| Yıkama tamponu | Telo TAGGG Telomer Uzunluk Testi kiti | 12209136001 |
Kaynaklar
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
