Method Article

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

DOI:

10.3791/65290

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sadece bilinmeyen bilgiler açısından zengin değil, aynı zamanda üç boyutlu (3D) bir bakış açısıyla da sofistike olan hücre organeli üst yapısının dinamik özelliklerinin anlaşılması, mekanik çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Elektron mikroskobu (EM) iyi bir görüntüleme derinliği sunar ve nanometre ölçeğinde bile hücresel organellerin ultrastrüktürel morfolojisini araştırmak için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının yeniden yapılandırılmasına izin verir; bu nedenle, 3D rekonstrüksiyon, eşsiz avantajları nedeniyle önem kazanmaktadır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), aynı ilgi bölgesinden büyük yapıların ardışık dilimler halinde 3D olarak yeniden yapılandırılmasına olanak tanıyan yüksek verimli bir görüntü elde etme teknolojisi sağlar. Bu nedenle, organellerin gerçek 3D ultrayapısını eski haline getirmek için büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonda SEM uygulaması giderek daha yaygın hale geliyor. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal kristaları incelemek için seri ultra ince kesit ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerinin bir kombinasyonunu öneriyoruz. Bu tekniklerin nasıl uygulandığının ayrıntıları, osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, seri ultra ince kesit görüntüleme ve görselleştirme ekranı dahil olmak üzere bu protokolde adım adım açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücredeki en önemli organellerden biridir. Hücresel biyoenerjetik ve metabolizmanın merkezi olarak hizmet ederler 1,2 ve kanserde kritik bir rol oynarlar3. Pankreas kanseri (PK), hızlı yayılımı ve yüksek ölüm oranı nedeniyle tedavisi en zor kanserlerdenbiridir. Esas olarak mitokondriyal morfolojideki 3,5,6,7 değişikliklerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon, PC8'in altında yatan hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendiri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Malzeme hazırlığı

  1. 12 mL DMEM ortamında (%10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 2 x 106 Panc02 hücresini kültürleyin ve 48 saat boyunca %5 karbondioksit ve %95 hava atmosferinde 37 °C ve %95 nemde muhafaza edin.
  2. Panc02 hücrelerini toplayın, 28 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Numunenin uygun boyutta (1 x 107 hücre) olduğundan emin olun, aksi takdirde aşağıdaki fiksasyon ve dehidrasyon adımları iyi çalışmayacaktır.
  3. Taze Panc02 hücrelerini 1.5 mL mikro santrifüj tüplerine gece boyunca 4 °C'de sabitlemek için fiksatif olarak 1 mL %2.5 glutaralde....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre kültürü sırasında (Şekil 1A), önce pankreas kanseri hücrelerini tam kültür ortamı ile kültürlenmiş bir kontrol grubuna, bir (1S, 3R)-RSL348 (RSL3, bir ferroptoz aktivatörü, 100 nM) grubuna ve bir RSL3 (100 nM) artı ferrostatin-149 (Fer-1, bir ferroptoz inhibitörü, 100 nM) grubuna ayırdık. Yukarıdaki deneysel adımlar sayesinde, taramalı elektron mikroskobu kontrol grubu, RSL3 grubu ve inhibitör grubu (RSL3 + Fer-1 grubu) için sırasıyla 38 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, seri ultra ince kesitlerden oluşturulan 2D tomografik görüntülerin istiflenmesine ve segmentasyonuna elektron mikroskobu ve görüntü işleme teknolojisinin uygulanmasını içeren 3D rekonstrüksiyon tekniğini uygulamak için adım adım yararlı bir kılavuzdur. Bu protokol, yapıların yüksek çözünürlük düzeyinde güçlü tekrarlanabilirliği ve daha yüksek doğrulukta avantajlarına sahip olan organel üst yapısının 3D görselleştirilmesi ile ele alınabilecek 2D görüntülerin bir sınırlamasını vurgulamaktadır. Daha d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (Z23H290001, LY19H280001) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82274364, 81673607 ve 81774011); Huzhou Bilim ve Teknoloji Hibesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi'nin yanı sıra (2021GY49, 2018GZ24). Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tıbbi Araştırma Merkezi Kamu Platformu'ndan gelen büyük yardım, teknik destek ve deneysel destek için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AsetonSIGMA179124
AmiraVisage Görüntüleme2020.2
Aspartik asitMCEHY-42068
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal'ı s ortaGibco11995115
EtanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal sığır serumuGibco10437010
Alan emisyon taramalı elektron mikroskobuHITACHISU8010
GlutaraldehitAlfa AesarA10500.22
Kurşun nitratSANTA CRUZsc-211724
Osmiyum TetroksitSANTA CRUZsc-206008B
Panc02Avrupa Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu 
Penisilin-streptomisinBiosharpBL505A
Fosfat Tamponlu Tuzlu SuBiosharpBL302A
Pon 812 Epoksi reçineSPI CHEMGS02660
Potasyum ferrosiyanürMacklinP816416
TiyokarbohidrazidMerck223220
UltramikrotomLEICAEMUC7
Uranil AsetatRHAWNR032929
98102213

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial UltrastructurePancreatic Cancer CellsThree Dimensional ReconstructionScanning Electron MicroscopySerial Ultrathin SectionMitochondrial CristaeElectron MicroscopyOrganelle MorphologyOTO MethodMitochondrial Dysfunction

Related Articles