Yöntem makalesi

Headspace Gaz Kromatografisi-Tandem Dört Kutuplu Kütle Spektrometrisi ile Hayvan Kaynaklı Tıpta Trimetilamin Tayini için Geliştirilmiş Bir Teknik

DOI:

10.3791/65291

⸱

10 Mart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd, 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Shimadzu (China) Co., Ltd

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hayvansal kaynaklı ilaçlarda trimetilamin (TMA) tayini için uygun bir headspace gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, numune ön işlemini, üst boşluk tedavisini, analiz koşullarını, metodolojik doğrulamayı ve hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA'nın belirlenmesini içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvansal kaynaklı ilaçların ayırt edici özellikleri ve önemli iyileştirici etkileri vardır, ancak çoğunun belirgin bir balık kokusu vardır ve bu da klinik hastaların zayıf uyumuna neden olur. Trimetilamin (TMA), hayvansal kaynaklı tıptaki en önemli balık kokusu bileşenlerinden biridir. Kostik ilavesinden sonra hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu üst boşluk şişesindeki artan basınç nedeniyle mevcut tespit yöntemini kullanarak TMA'yı doğru bir şekilde tanımlamak zordur, bu da TMA'nın üst boşluk şişesinden kaçmasına neden olur ve hayvansal kaynaklı ilaçların balık kokusunun araştırma ilerlemesini durdurur. Bu çalışmada, asit ve kostik arasında bir izolasyon tabakası olarak bir parafin tabakası ekleyen kontrollü bir tespit yöntemi önerdik. TMA üretim hızı, parafin tabakasının termostatik fırın ısıtması yoluyla yavaşça sıvılaştırılmasıyla etkin bir şekilde kontrol edilebilir. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyet ile tatmin edici doğrusallık, hassas deneyler ve geri kazanımlar gösterdi. Hayvansal kaynaklı ilaçların koku giderme konusunda teknik destek sağladı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan parçalarından ve/veya bunların yan ürünlerinden (burada hayvansal kaynaklı ilaçlar olarak anılacaktır) elde edilen ürünleri kullanarak insan hastalıklarının tedavisi giderek daha fazla ilgi görmektedir. Kanser, kardiyovasküler hastalık, karaciğer sirozu, mastitis ve diğer hastalıkların tedavisinde güçlü bir etki, küçük dozaj ve önemli ve spesifik klinik etkinlik avantajları ile önemli bir rol oynarlar. Bununla birlikte, hayvansal kaynaklı ilaçlar genellikle belirgin bir balık kokusuna sahiptir, bu da hastaların uyumunu büyük ölçüde etkiler ve özellikle çocuklar için elverişsizdir 1,2. Balık kokusu esas olarak, yağ asidi oksidasyonu, amino asit bozunması ve balık kokusu 2,3,4 ile çeşitli maddeler üretmenin diğer yolları yoluyla ayrışan ilaçta bulunan proteinlerden, amino asitlerden, yağlardan ve diğer maddelerden gelir. Bunlar arasında trimetilamin (TMA), çürüyen veya çürümüş hayvansal kaynaklı gıdalarda yaygın olarak bulunan balık kokusuna sahip uçucu bir gazdır5.

Şimdiye kadar, gaz kromatografisi (GC), sıvı kromatografisi (LC), iyon kromatografisi, spektrofotometri, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ve sensör yöntemleri, ortamda, yiyeceklerde ve idrarda TMA'yı tespit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır 6,7,8,9. GC kolonu ve enjeksiyon sisteminin düşük kontaminasyonunun yanı sıra yüksek hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve düşük tespit limiti (0.1-1 mg/kg) göz önüne alındığında, gıda ve biyolojik analizler için tepe boşluğu gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (HS-GC-MS) yöntemi tercih edilmiştir8. Şu anda, yalnızca Çin gıdada TMA için ulusal bir standart oluşturmuştur ve HS-GC-MS, GB5009.179-2016 standardı10'daki ilk yöntemdir. Bu nedenle, hayvansal kaynaklı tıpta TMA'yı tespit etmek için yukarıdaki HS-GC-MS yöntemi seçilmiştir. Erken aşamada, araştırma grubumuz, gıdalardaki TMA için HS-GC-MS tespit standardının çeşitli hayvan kaynaklı ilaçlardaki balık kokusunu tespit edebildiğini buldu. Çalışmaların sonuçları11,12 ile birleştiğinde, TMA'nın hayvansal kaynaklı ilaçlarda balık kokusunun ortak anahtar maddesi olduğu kanıtlanabilir. Bununla birlikte, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğinin zayıf olduğu ve metodoloji ile doğrulanamayan TMA kaçışı ve zayıf stabilite gibi problemlerin olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni, kostiğin üst boşluk şişesine enjekte edilmesi ve hızlı asit-baz reaksiyonunun şişede artan basınca yol açması olabilir, böylece TMA enjeksiyon gözeneğinden kaçarak TMA'nın kararlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu çalışma, bu sorunları ele almak için geliştirilmiş bir üst boşluk gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) algılama yöntemi önermiştir.

Protokol, iyi bir katı-sıvı faz değişim malzemesi olan katı parafin yardımıyla ön işlemdeki asit-baz reaktanları ayırarak numune ön işlemini iyileştirir. Parafin, termostatik fırının sıcaklık artışıyla yavaşça sıvılaştırıldıkça, şiddetli ve hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu basınç artışını önleyerek ve kararlı ve doğru TMA tespiti sağlayarak, kapalı üst boşluk şişesinde TMA da yavaşça salındı. Ayrıca, GC-MS/MS'de çoklu reaksiyon izleme (MRM) modlarıyla birleştirilmiş üst boşluk enjeksiyonu, matris kimyasal girişimini etkili bir şekilde bastırdı ve sonuçların güvenilirliğini sağladı. Metodolojik doğrulamanın sonuçları, geliştirilmiş algılama yönteminin doğrusallığının, hassasiyet testinin ve geri kazanım hızının, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyetle gereksinimleri karşılayabileceğini kanıtladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo'nun tıbbi malzemeleri hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız. Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nden Prof. Xu Runchun tarafından Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. ve Whitmania pigra Whitman'ın kurutulmuş bedenleri olarak tanımlandılar.

1. Numune ekstraksiyonu

  1. Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo'yu bitkisel bir öğütücü ile ezin (Malzeme Tablosuna bakınız), tıbbi tozu No. 2 (elek açıklığı: 0.8 mm) ve No. 4 (elek açıklığı: 0.25 mm) standart ilaç eleklerinden eleyin ve gerekli numune tozunu elde etmek için tozu iki elek arasında toplayın.
    NOT: Pheretima ezildikten sonra kabarıktır, bu nedenle tozunun elenmesine gerek yoktur.
  2. 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne 1 g toz (0,001 g'a kadar hassas) alın, 20 mL %5 trikloroasetik asit (TCA) çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve yüksek hızlı dispersiyon homojenizatörü ile 1.000 rmin-1'de 1 dakika homojenize edin.
  3. Homojenizasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.717 x g'da santrifüjleyin, cam huniye biraz emici pamuk ekleyin ve süpernatanı 50 mL'lik hacimsel bir şişeye süzün.
  4. Yukarıdaki ekstraksiyon işlemini 15 mL ve 10 mL% 5 TCA çözeltisi ile iki kez tekrarlayın. Süzüntüyü birleştirin ve% 5 TCA çözeltisi ile 50 mL'ye seyreltin.

2. Reaktif hazırlama

  1. % 20 sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın: 20 g sodyum hidroksit tartın ve hacmi 100 mL'lik bir hacimsel şişeye sabitlemek için deiyonize su kullanın.
  2. % 5 TCA çözeltisi hazırlayın: 25 g TCA tartın ve hacmi 500 mL hacimsel bir şişeye sabitlemek için deiyonize su kullanın.

3. TMA standart stok çözeltisi hazırlama

  1. TMA standart stok çözeltisini hazırlayın: 0.0162 g TMA hidroklorür standart numunesini tartın, %5 TCA çözeltisi içinde çözün ve hacmi 100 μg/mL TMA standart stok çözeltisinin konsantrasyonuna eşit olan 100 mL'ye sabitleyin. 4 °C'de saklayın.
  2. TMA standart kullanım solüsyonu hazırlayın: belirli bir hacimde TMA standart stok solüsyonu alın ve 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL ve 10 μg/mL TMA standart solüsyonu konsantrasyonlarına kadar %5 TCA solüsyonu ile adım adım seyreltin.

4. Örnek headspace işleme

  1. 20 mL'lik bir üst boşluk şişesinde 2 mL sodyum hidroksit çözeltisi ve 0,5 g katı parafini (erime noktası: 58-60 °C) doğru bir şekilde tartın (bkz.
  2. Headspace şişesini yaklaşık 30 dakika boyunca 70 °C'de bir fırına koyun. Katı parafin tamamen erir.
  3. Çıkarın ve parafinin katılaşması için oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Katılaşmış parafin, sodyum hidroksiti kapatacaktır.
  4. Her numune ekstraksiyon çözeltisinden 2 mL alın ve parafin tabakasının üzerine koyun, kapağa bastırın ve kapatın.
  5. Ölçüm için kapalı üst boşluk şişesini makineye koyun ( Malzeme Tablosuna bakın).

5. HS-GC-MS/MS analiz koşullarının ayarlanması

  1. Üst boşluk koşulları ve GC-MS koşulları için Tablo 2'ye bakın.
  2. İyon bilgisi için Tablo 3'e bakın.

6. Standart eğri çizimi

  1. Sodalı su ve parafin sızdırmazlık tabakası içeren üst boşluk şişesini hazırlamak için 4.1-4.3 adımlarındaki üst boşluk işlemesine bakın.
  2. 2 mL 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL ve 10 μg/mL TMA standart çözeltisini 20 mL'lik bir üst boşluklu şişeye aspire edin, kapağı kapatın ve makinede ölçün.

7. Hassasiyet testi

  1. Sodalı su ve parafin sızdırmazlık tabakası içeren üst boşluk şişesini hazırlamak için 4.1-4.3 adımlarındaki üst boşluk işlemesine bakın.
  2. 2 mL 0.1 μg/mL TMA standart solüsyonunu 20 mL'lik bir üst boşluk şişesine aspire edin ve kapağı kapatın. Üreticinin talimatlarını izleyerek makinede altı paralel test gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

8. Kurtarma oranı deneyi

  1. Bir grup Pheretima, Periplaneta Americana ve Hirudo (S02, S05, S07; Tablo 1) geri kazanım oranı deneyi için temsili ilaçlar olarak.
  2. Birkaç parti numune tozu (S02, S05, S07) alın ve bunları 50 °C'de bir fırında 72 saat boyunca TMA tespit edilmeyene kadar pişirin.
  3. Pişmiş ilaç tozundaki TMA içeriğini tespit etmek için bölüm 4-6'daki numune hazırlama yöntemine bakın.
  4. 1 g pişmiş toz alın (0.001 g'a kadar hassas), 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne koyun ve 50 μL TMA standart çözeltisi ekleyin.
    NOT: TMA standart çözeltisinin konsantrasyonu 100 μg/mL, 1000 μg/mL ve 10000 μg/mL'dir.
  5. 20 mL% 5 TCA çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca 1000 rmin-1'de homojenize edin.
  6. Homojenizasyondan sonra, 5 dakika boyunca 1717 x g'da santrifüjleyin, cam huniye biraz emici pamuk ekleyin ve süpernatanı 50 mL'lik bir hacimsel şişeye süzün.
  7. Yukarıdaki ekstraksiyon işlemini 15 mL ve 10 mL% 5 TCA çözeltisi ile iki kez tekrarlayın; filtratı birleştirin ve% 5 TCA çözeltisi ile 50 mL'ye seyreltin.

9. Tespit (LOD) ve miktar tayini (LOQ) sınırlarının belirlenmesi

  1. Sinyal-gürültü oranı (S/N) = 3 olduğunda LOD'yi karşılık gelen konsantrasyona göre belirleyin.
  2. S/N = 10 olduğunda karşılık gelen konsantrasyona göre LOQ'yu belirleyin.

10. Örnek TMA içeriğinin belirlenmesi

  1. Sırasıyla yaklaşık 1 g ince toz Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo alın, numuneyi yukarıdaki yönteme göre çıkarın ve makinede belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün ön işleme prensibinin ve çalışmasının şematik diyagramları sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir. TMA'nın pik süresi 2.3 dakika idi, keskin bir tepe şekli vardı ve diğer safsızlıklardan etkilenmedi (Şekil 3). 0.1-10 μg/mL TMA standart çözeltisinin doğrusal aralığı, apsis olarak TMA konsantrasyonu ve ordinat olarak tepe alanı ile standart bir eğri çizildi. Doğrusal regresyon denklemi y = 2522482x + 24255 olar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvansal kaynaklı ilaçlar tüm vücuttan, organ veya dokulardan, fizyolojik veya patolojik ürünlerden, dışkılardan veya salgılardan ve hayvanların işlenmiş ürünlerinden gelir. TMA, hayvansal kaynaklı ilaçlarda önemli bir balık kokusu kaynağıdır; çok düşük koku alma eşiği (0.000032 × 10-6 V/V) ve güçlü balık kokusu13 olan tipik bir kötü kokulu maddedir. Şu anda, yaygın olarak kullanılan HS-GC-MS yöntemi, hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA'yı stabil ve doğru bir şekilde tespit edememektedir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82173991) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2022YFS0442) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SantrifüjBeckman Coulter Trading (Çin) Co.SSC-2-0213
Çin bitkisel ilaç öğütücüZhejiang Yongkang Xi'an Donanım ve İlaç FabrikasıHX-200K
Konveksiyonlu fırınSanyo Electric Co., LtdMOV-112F
20 mm Alüminyum kapaklar için DecapperANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) IncV1750004
Elektronik dengeShimadzu Corporation Japonya
Gaz kromatografisi kütle spektrometresiShimadzu Corporation JaponyaTQ-8050 NX
Headspace FlakonANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Shanghai) Inc25760200
HomojenizatörŞanghay biaomo FabrikasıFJ200-SH
Önceden Monte Edilmiş KapakANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) IncL4150050
Örneği elekZhenxing Elek Fabrikası/
SH-Uçucu AminChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
Sodyum hidroksitChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Katı parafin mumuŞangay Hualing Kangfu aparatı fabrikası20221112
Trikloroasetik asitChengdu Chron Chemicals Co., Ltd
Trimetilamin hidroklorürChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
Ultra saf su sistemiSichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T
AUW220D2022102001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50(2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318(2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062(2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009. 179-2016. , 12(2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. Odor olfactory measurement. , Japan Association on Odor Environment. Tokyo. (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Etiketler

Bal k Kokusu AnaliziParafin zolasyon TabakasNumune n lemiTrikloroasetik Asit EkstraksiyonuGeri Kazan m Oran DeneyiBitkisel la Analizi

İlgili makaleler