Burada, farelerde serbest el yaklaşımı kullanarak (yani stereotaksik bir cihaz olmadan) intraserebroventriküler enjeksiyonlar yapmak için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar
Bu makalede
Özet
Özet
Nöroendokrin sistemlerin araştırılması genellikle ilaçların, virüslerin veya diğer deneysel ajanların doğrudan farelerin beyinlerine verilmesini gerektirir. İntraserebroventriküler (ICV) enjeksiyon, deneysel ajanın beyin boyunca (özellikle ventriküllerin yakınındaki yapılarda) yaygın olarak verilmesine izin verir. Burada, yetişkin farelerde serbest el ICV enjeksiyonları yapma yöntemleri açıklanmaktadır. Farelerin kafalarındaki görsel ve dokunsal işaretler kullanılarak, lateral ventriküllere enjeksiyonlar hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Enjeksiyonlar, deneycinin elinde tutulan bir cam şırınga ile yapılır ve yer işaretlerinden yaklaşık mesafelere yerleştirilir. Bu nedenle, bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmez. Ayrıca, bu teknik, uyanık, serbestçe davranan farelerde fare davranışının ve / veya fizyolojisinin daha sonra değerlendirilmesine izin veren sadece kısa izofluran anestezisi gerektirir. Serbest el ICV enjeksiyonu, deneysel ajanların canlı farelerin beyinlerine verimli bir şekilde verilmesi için güçlü bir araçtır ve nöroendokrin süreçleri araştırmak için sık kan örneklemesi, nöral devre manipülasyonu veya in vivo kayıt gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir.
Giriş
İlaç1, virüs2 veya hücre3 gibi deneysel ajanların beyne verilmesi genellikle nöroendokrin araştırmalar için gereklidir. Ajan kan-beyin bariyerini kolayca geçmiyorsa veya deneysel amaç, ajanın merkezi etkilerini spesifik olarak test etmekse, beyne enjeksiyon yapmak için güvenilir bir yönteme sahip olmak önemlidir. Ayrıca intraserebroventriküler (ICV) boşluğa enjeksiyon, ajanın beyinde geniş bir alana yayılmasına olanak sağlar ve geniş bir hedef alan sağlar, böylece başarılı enjeksiyon olasılığını artırır2.
ICV enjeksiyonları yapmak için yaygın bir yöntem, kalıcı bir kalıcı kanülün yerleştirilmesini içerir. Bu yaklaşımda, kanül yerine yapıştırıldığı veya yapıştırıldığı için ticari olarak temin edilebilen veya ısmarlama kanülü konumlandırmak için stereotaksik bir çerçeve gereklidir. Genellikle, iyileşmeden sonra, kanül yoluyla suprafizyolojik bir anjiyotensin II dozu uygulanır ve içme davranışı hemen gözlenirse, kanülün doğru yerleştirildiği kabul edilir4. Bu yaklaşımın, uzun süreli infüzyon gerçekleştirme yeteneği ve aynı hayvanı birden çok kez enjekte etme yeteneği dahil olmak üzere birçok avantajı vardır; Ek olarak, anjiyotensin II kullanılırsa, deneysel bileşiklerin uygulanmasından önce doğru yerleştirme doğrulanabilir. Bununla birlikte, pahalı ekipman gereksinimi (stereotaksik çerçeve), yerleştirmeden sonra kanülün hasar görme olasılığı (örneğin, fareler bir kafes arkadaşının kanülünü çiğneyebilir) ve kalıcı kanül çevresinde enfeksiyon olasılığı dahil olmak üzere kalıcı bir kanül yerleştirmenin bazı sınırlamaları vardır. Tek ICV enjeksiyonları, etkili olmasına rağmen, anesteziye önemli ölçüde maruz kalmayı gerektiren ve bu nedenle tedavinin bazı akut fizyolojik ve davranışsal etkilerini gizleyebilen bir stereotaksik çerçeve3 kullanılarak yapılabilir. Ek olarak, farelerin stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilmesi, sabit bir yerleştirme elde etmek ve kulak kanallarının yırtılmasını önlemek için önemli bir eğitim gerektirir.
Burada, farelerde serbest el enjeksiyonları yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem önceki raporlaradayanmaktadır 5,6. Bu tekniğin avantajları, basit, hızlı olması ve stereotaksik çerçeve gibi özel ekipman gerektirmemesidir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu prosedür, hızlı bir şekilde yapılabilen ve bu nedenle deney gününde sadece birkaç dakikalık gaz anestezisi gerektiren enjeksiyonları yapmak için fare kafasındaki yer işaretlerine göre bir cam şırınganın manipüle edilmesini içerir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler, temsili verilerin toplandığı Colorado Eyalet Üniversitesi (# 3960) ve California Üniversitesi San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylandı (S13235, PI Kellie Breen Kilisesi). Beş yetişkin dişi ve iki yetişkin erkek C57/BL6 faresinden (9-16 haftalık) elde edilen veriler temsili veriler bölümünde gösterilmektedir. Dişi fareler, daha önce tarif edildiği gibi ICV enjeksiyonu ve kan alımından 3-4 hafta önce yumurtalıkta kaldı7. Deneyden önce, bu fareler 12 saat ışık / 12 saat karanlık ışık döngüsü ile barındırıldı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak yem ve suya serbest erişime sahipti.
1. Kraniyotomi yapmak
NOT: Kraniyotomi, gerçek enjeksiyondan bir veya daha fazla gün önce yapılabilir, bu da enjeksiyon işlemini deney gününde daha hızlı hale getirir.
- Kraniyotomi için malzemeleri aşağıda tarif edildiği gibi hazırlayın.
- Çalışma yüzeyine temiz bir tezgah pedi veya örtü malzemesi yerleştirin. Bir izofluran buharlaştırıcının burun konisini çalışma yüzeyine bantlayın (deneyciye yakın, ancak uzağa bakacak şekilde; bkz. Şekil 1A).
- Silastik boruyu steril keskin 18 G'lik bir iğnenin ucuna, iğne ucunun ~1 mm'si dışarı çıkacak şekilde yerleştirin. Steril künt bir iğnenin ucuna silastik boruyu yerleştirin, böylece iğne ucunun ~1 mm'si çıkıntı yapar.
NOT: Her fare için ayrı ve steril önceden paketlenmiş iğneler (keskin ve künt) kullanılmalıdır. - Enjeksiyon bölgesini hazırlamak için elektrikli tıraş makinesi, iyot fırçalama, steril gazlı bez ve alkollü pedler toplayın.
- Aşağıda açıklandığı gibi bir iğneyi 2 mm yanal ve 1 mm kaudal hareket ettirme alıştırması yapın.
- Bir kağıdı başlangıç noktası (bu bregma olacaktır), sola veya sağa 2 mm ve sonuncusunun 1 mm üzerinde başka bir işaretle işaretlemek için bir cetvel ve kalem kullanın (bu enjeksiyon bölgesi olacaktır; bkz. Şekil 1B).
- Hareketin kılavuzlar olmadan tekrarlanabilir olduğundan emin olana kadar iğneyi başlangıç noktasından işaret noktası 1'den işaret noktası 2'ye (bregma'dan enjeksiyon bölgesine) hareket ettirme alıştırması yapın.
NOT: Burada açıklanan koordinatlar yetişkin C57/BL6 farelerinde etkilidir, ancak diğer suşlar veya yaş gruplarının ayarlanması gerekebilir.
- Fareyi aşağıda açıklandığı gibi kraniyotomi için hazırlayın.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi tıbbi sınıf oksijende% 3 -% 4 izofluran ile uyuşturun. Prosedüre uygulama ve aşinalık ile, kraniotomi prosedürü için toplam izofluran maruziyet süresini 10 dakikadan daha aza indirin.
DİKKAT: İzofluran maruziyeti insan sağlığı için tehlikelidir; Atık gazları temizlemek için iyi havalandırılan bir alanda onaylanmış ve denetlenmiş bir izofluran buharlaştırıcı kullanın. - Ayak refleksi olmadığında, hayvanın kafasını tıraş edin. Göz kayganlaştırıcı uygulayın.
- Anesteziyi korumak için fareyi kafa burun konisinde olacak şekilde çalışma yüzeyine yerleştirin.
- Tedarikçi tarafından belirtildiği gibi buprenorfin (0.6-0.8 mg / kg fare vücut ağırlığı, deri altında) gibi bir analjezik ajan uygulayın.
- Kafayı iyot çözeltisine batırılmış steril gazlı bezle silerek enjeksiyon bölgesini temizleyin (üç fırçalama yapın) ve ardından alkollü ovma pedi ile silin (üç kez gerçekleştirin).
NOT: Kürkü çıkarın ve enjeksiyon bölgesinin etrafındaki cildi temizleyin ve enfeksiyonları önlemek için Amerikan Veteriner Hekimler Birliği tarafından önerildiği gibi steril aletler ve iğneler kullanın.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi tıbbi sınıf oksijende% 3 -% 4 izofluran ile uyuşturun. Prosedüre uygulama ve aşinalık ile, kraniotomi prosedürü için toplam izofluran maruziyet süresini 10 dakikadan daha aza indirin.
- Baskın olmayan elinizle farenin başını sıkıca tutun. Kafayı çalışma yüzeyine mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirin.
- Enjeksiyon bölgesini bulun.
- Önce bregmayı tanımlamak için hazırlanmış keskin 18 G iğneyi kullanın; Bunun için, iğneyi rostral-kaudal düzlemde hareket ettirerek orta hat boyunca başın derisi boyunca sürükleyin. İki köşenin gözler ve üçüncü köşenin bregmanın yaklaşık konumu olduğu bir eşkenar üçgen hayal edin (bkz. Şekil 1C).
- Bregma'dan iğneyi 2 mm lateral ve 1 mm kaudal enjeksiyon bölgesine hareket ettirin.
- İğneyi dikey olarak tutarken, boru cilt ile aynı hizaya gelene kadar iğneyi cilt ve kemikten sıkıca itin.
- İğneyi geri çekin, iğneyi döndürün ve tekrar deri ve kemiğe bastırın. Kemikte küçük bir delik oluşana kadar işlemi tekrarlayın.
- Kemikte yeterli delik oluşup oluşmadığını kontrol etmek için künt iğneyi kullanın. Kemikte künt iğnenin geçebileceği kadar büyük bir açıklık açmayı hedefleyin.
- Fareyi burun konisinden çıkarın, enjeksiyon bölgesindeki kanı steril gazlı bezle temizleyin ve fareyi uyanana kadar bir kafes ısıtıcısı üzerindeki bir kafese yerleştirin. Kraniyotomi ile yapılan açıklık küçük olduğu için (18 G iğne) bölgenin dikiş veya yara klipsi ile kapatılmasına gerek yoktur.
NOT: Burada üretilen açıklık küçüktür (18 G), bu nedenle birçok kurum bu prosedürü bir ameliyattan ziyade bir enjeksiyon olarak kabul eder. Ayrıca, deri ve kemikten beyne bir açıklık açılmasına rağmen, cildi gergin tutmak, deliklerin hizalanmamasına neden olur, bu da muhtemelen cilt florasının veya kafes yataklarının beyinle temas etmesini önlemeye yardımcı olur.
2. Enjeksiyonun yapılması
- Enjeksiyon için malzemeleri aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
- Çalışma yüzeyine temiz bir tezgah pedi veya örtü malzemesi yerleştirin. Bir izofluran buharlaştırıcının burun konisini çalışma yüzeyine bantlayın (deneyciye yakın, ancak uzağa bakacak şekilde; bkz. Şekil 1A).
- 5 μL'lik bir cam şırıngaya 45° eğimli 10 mm uzunluğunda 27 G'lik bir iğne takın. Silastik boruyu, iğne ucunun 3,5 mm'si çıkıntı yapacak şekilde iğnenin üzerine yerleştirin; boruyu şırınga gövdesine tutmak için laboratuvar bandı kullanın (bkz. Şekil 1D).
- Enjeksiyon ortamını (ilaç, virüs veya enjeksiyon için başka bir sıvı) bir tüpte hazırlayın. Bu çalışmada temsili sonuçlar için steril izotonik salin enjekte edildi.
NOT: 2 mL mikrosantrifüj tüpü gibi cam şırınga ve iğnenin erişimine izin veren bir tüp seçin. - Cam şırıngaya 3 μL enjeksiyon ortamı çekin. İlk olarak, istenen hacimden daha fazlasını çekin ve şırıngada 3 μL kalana kadar çıkarın.
- Enjeksiyon bölgesini hazırlamak için iyot fırçalama, steril gazlı bez ve alkol pedleri toplayın.
- Geri sayım modunda bir laboratuvar zamanlayıcısı başlatın ve zamanlayıcıyı, enjeksiyon yaparken deneyci tarafından görülebilecek şekilde yerleştirin.
- Bir iğneyi önceki gün yapıldığı gibi 2 mm yanal ve 1 mm kaudal hareket ettirme alıştırması yapın.
- Fareyi aşağıda açıklandığı gibi enjeksiyon için hazırlayın.
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi izofluran ile uyuşturun. Ayak refleksi olmadığında, göz kayganlaştırıcı uygulayın ve fareyi kafa burun konisinde olacak şekilde çalışma yüzeyine yerleştirin.
- Enjeksiyon bölgesini iyot ve alkolden oluşan üç mendille temizleyin. Enjeksiyon bölgesini adım 1.8'de açıklandığı gibi 18 G'lik bir iğne (veya körelmiş iğne) ile tanımlayın. Kraniyotomi sırasında oluşan delik tespit edilebilir olmalıdır.
NOT: Kraniyotomi önceden yapılmamışsa veya kafatasındaki delik tespit edilemiyorsa kraniyotomi burada yapılabilir.
- Enjeksiyonu aşağıda açıklandığı gibi bir cam şırınga ile gerçekleştirin.
- Baskın olmayan elinizle farenin başını sıkıca tutun. Kafayı çalışma yüzeyine mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirin.
- Cam şırınganın iğnesini, adım 2.1.2'de hazırlanan iğnenin üzerine yerleştirilen boru farenin derisine oturana kadar kafatasındaki delikten geçirin.
- Hem koronal hem de sagital düzlemlere dikkat ederek şırıngayı mümkün olduğunca dikey tutun. Ortamı 1 dakikalık bir süre boyunca yavaşça enjekte edin.
- Geri akışı en aza indirmek için enjeksiyonun tamamlanmasından sonra şırıngayı ve iğneyi bir dakika daha yerinde tutun. İğneyi farenin kafasından yavaşça geri çekin.
- Fareyi burun konisinden çıkarın, enjeksiyon bölgesindeki kanı steril gazlı bezle (varsa) temizleyin ve fareyi uyanana kadar bir kafes ısıtıcısı üzerindeki bir kafese yerleştirin.
3. Enjeksiyon yerinin onaylanması
- Fareyi daha önce tarif edildiği gibi fosfat tamponlu salin (PBS) içinde salin ve% 4 paraformaldehit ile derinlemesine uyuşturun ve perfüzeedin 8. Beyni, beyin batana kadar (tipik olarak 2 gün) 4 ° C'de PBS'de% 30 sükroz içinde saklayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi bir kriyostat üzerinde 20-50 μm koronal kesitler kesin9. Kesit alırken, doku bloğundaki enjeksiyon yolunu gözlemleyin. Enjeksiyon yolunun lateral ventrikül ile açıkça kesişip kesişmediğini kaydedin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğinde, bu teknik, deneysel bir ajanın ventriküler sisteme hızlı bir şekilde verilmesine izin verir. Birçok farmakolojik bileşiğin aracı olan 3 μL steril izotonik salin ICV enjeksiyonu alan yumurtalıklı bir fareden alınan luteinize edici hormon (LH) nabız profili Şekil 2A'da gösterilmektedir. Bu örnek, gaz anestezisine kısa süre maruz kalmanın ve ventriküler sisteme 3 μL sıvı enjeksiyonunun tek başına pulsatil LH sekresyonunu değiştirmediğini göstermektedi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, farelerde ICV enjeksiyonları yapmak için basit ve etkili bir araç açıklanmaktadır. Bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmediğinden, ilaçların ve deneysel ajanların merkezi olarak verilmesi için bu yaklaşım daha fazla araştırmacı tarafından erişilebilir. Ek olarak, hazırlama ve enjeksiyon prosedürü hızlı bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden bu yaklaşım nispeten yüksek verimdir.
Bu prosedür, iğnelerin ve bir cam şırınganın yaklaşık mesafeler kullanılarak elle manipüle edilmesini ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Dr. Kellie Breen Church, Bay Michael Kreisman ve Bayan Jessica Jang'a temsili sonuçlarda gösterilen verilerin toplanmasına katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R00 HD104994 (RBM) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 18 gauge künt iğneler | SAI İnfüzyonu | B18-150 | |
| 18 gauge iğneler | BD Medical | 305195 | |
| Alkol pedleri | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tezgah pedi | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine çözeltisi | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorfin | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Kontrollü madde |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Cam şırınga | Hamilton | 7634-01 | |
| Enjeksiyon iğnesi | Hamilton | 7803-01 | 27 ölçer, Küçük Hub RN iğnesi, nokta stili: 4, İğne uzunluğu: 10cm, Açı: 45 |
| Isoflurane | Patterson Veteriner Kaynağı | 07-893-8441 | |
| İzofluran buharlaştırıcı | Veteriner Ekipmanı | V-10 | |
| Laboratuvar Bandı | VWR | 89098-128 | |
| Tıbbi sınıf oksijen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehit | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Fosfat Tamponlu | Tuzlu Su Fisher Scientific | J67802. K2 | |
| PulsaR Yazılımı | Açık kaynak, Otago | Bkz. ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastik boru (0.040" ID) | DOW | 508-005 | |
| Silastik boru (0.078" ID) | DOW | 508-009 | |
| Steril tuzlu su | VWR | 101320-574 | |
| Sükroz | Balıkçı Bilimsel | S5-500 |
Kaynaklar
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
