Bu protokol, orta büyüklükte bir enfarktüse ve mükemmel bir hayatta kalma oranına sahip benzersiz bir fare vuruşu modeli gösterir. Bu model, klinik öncesi inme araştırmacılarının iskemi süresini uzatmasına, yaşlı fareleri kullanmasına ve uzun vadeli fonksiyonel sonuçları değerlendirmesine olanak tanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yaşlı Farelerde İnme Sonuçlarını İncelemek için Modifiye Transkraniyal Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Deneysel inme araştırmalarında, farelerde iskemik inmeyi modellemek için intraluminal filamentli orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) yaygın olarak kullanılmaktadır. Filament MCAO modeli tipik olarak, C57Bl / 6 farelerinde, bazen posterior serebral arter tarafından sağlanan bölgede beyin dokusunu içeren büyük bir serebral enfarktüs sergiler, bu da büyük ölçüde posterior komünikan arter atrezisinin yüksek insidansına bağlıdır. Bu fenomenin, filament MCAO'dan sonra uzun süreli inme iyileşmesi sırasında C57Bl / 6 farelerinde gözlenen yüksek ölüm oranına önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, birçok kronik inme çalışması distal MCAO modellerinden yararlanmaktadır. Bununla birlikte, bu modeller genellikle sadece korteks bölgesinde enfarktüs üretir ve sonuç olarak, inme sonrası nörolojik defisitlerin değerlendirilmesi zor olabilir. Bu çalışma, gövdedeki MCA'nın küçük bir kraniyal pencere yoluyla kalıcı veya geçici olarak kısmen tıkandığı modifiye edilmiş bir transkraniyal MCAO modeli oluşturmuştur. Oklüzyon yeri MCA'nın orijinine nispeten yakın olduğundan, bu model hem kortekste hem de striatumda beyin hasarı oluşturur. Bu modelin kapsamlı karakterizasyonu, yaşlı farelerde bile mükemmel bir uzun süreli sağkalım oranının yanı sıra kolayca tespit edilebilen nörolojik defisitler göstermiştir. Bu nedenle, burada açıklanan MCAO fare modeli, deneysel inme araştırması için değerli bir araçtır.
Giriş
ABD'de her yıl yaklaşık 800.000 kişi felç geçirmektedir ve bu felçlerin çoğu doğası gereği iskemiktir1. Doku plazminojen aktivatörü (tPA) ve/veya trombektomi ile serebral kan akışının zamanında restorasyonu şu anda inme hastaları için en etkili tedavidir; Bununla birlikte, uzun dönemde nörolojik fonksiyonların tam olarak iyileşmesi nadirdir 2,3. Bu nedenle, fonksiyonel iyileşmeyi hedefleyen yeni inme tedavisinin araştırılması, klinik olarak ilgili hayvan inme modellerini gerektiren yoğun bir araştırma alanıdır.
Kemirgenlerde en sık görülen iskemik inme modeli, inmeyi indüklemek için intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) kullanır. İlk olarak 1989 yılında Zea Longa tarafından geliştirilen bu modelde, orta serebral artere (MCA) kan akışını engellemek için internal karotis artere (ICA) bir naylon filament sokulur4. Ancak, bu modelin sınırlamaları vardır. İlk olarak, filament ICA'ya yerleştirildiğinde, posterior serebral artere (PCA) giden kan akışı, özellikle farelerde kısmen bloke edilebilir. Kritik olarak, ön ve arka serebral dolaşımı birbirine bağlayan küçük bir arter olan posterior komünikan arter (PcomA), ağırlıklı olarak deneysel inme araştırmalarında kullanılan suş olan C57Bl / 6 gibi bazı fare suşlarında sıklıkla az gelişmiştir. PcomA'nın bu açıklığının, inme5'ten sonra farelerde lezyon boyutundaki değişkenliğe katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Gerçekten de, PCA'ya kan akışı MCAO sırasında hızla düştüğünde ve PcomA yeterli kollateral kan akışı sağlayamadığında, inme enfarktüsü PCA'nın topraklarına genişleyebilir. Ayrıca, bu modelde, uzun süreli iskemi farelerde daha yüksek ölüm şansına yol açar. Sonuç olarak, farelerde tipik olarak 30-60 dakikalık kısa bir MCAO süresi kullanılır. Bununla birlikte, çoğu inme hastası reperfüzyon tedavisinden önce birkaç saat iskemi yaşar. Bu nedenle, uzun süreli iskemiye sahip bir fare vuruşu modeli yüksek klinik öneme sahiptir.
Bu prosedürün genel amacı, orta büyüklükte bir enfarktüse ve mükemmel bir sağkalım oranına sahip farelerde iskemik inmeyi modellemektir. Bu transkraniyal MCAO modeli, uzun süreli iskemi uygulanabildiğinden ve yaşlı fareler bu modeli iyi tolere ederek fonksiyonel iyileşmenin uzun vadeli değerlendirmesine izin verdiğinden, klinik inmenin kritik özelliklerini ele almaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada açıklanan tüm prosedürler, araştırmada hayvanların bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak yürütülür ve protokol, Duke Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için genç (8-10 haftalık) ve yaşlı (22 aylık) erkek C57Bl/6 fareler kullanıldı. Bu protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Cerrahi hazırlık
- Fareyi büyük anormallikler ve davranışsal eksiklikler açısından inceleyin.
NOT: Ameliyattan önce cerrahların cerrahi maske, bone, eldiven ve önlük dahil olmak üzere uygun KKD (koruyucu kişisel ekipman) giymeleri önemlidir. - Fareyi tartın; ventilatörü vücut ağırlığına göre programlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Fareyi anestezi indüksiyon kutusunda 4 inç x 4 inç x 7 içine yerleştirin. 30'a ayarlanmış oksijen akış ölçeri ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 70'e ayarlanmış azot oksit akış ölçeri açın. Buharlaştırıcıyı% 5 izofluran ile açın.
- Kılavuz teli 20 G intravenöz (IV) katetere yerleştirin.
- Solunum hızı dakikada 30-40 nefese düştüğünde fareyi indüksiyon kutusundan çıkarın.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi tezgahın üzerine yatırın. Farenin dilini dışarı çekin ve sol elin parmaklarıyla tutun. Ses telini görselleştirmek için hayvanın ağzına bir laringoskop (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- Sağ orta parmağınızı kullanarak fare çenesini laringoskop üzerinde sabitleyin. 20 G IV kateteri tutmak için sol elinizi serbest bırakın.
- Kılavuz teli ses telinin içine hafifçe yerleştirin ve ardından 20 G IV kateteri kateterin kanat kısmı burun ucuyla aynı seviyeye gelene kadar yavaşça trakeaya itin.
NOT: Fare hareket ediyorsa, kabloyu takmayın. Bu, soluk borusunda travmaya ve kanamaya neden olabilir. - Ventilatörü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve farede entübe edilmiş 20 G IV kateter ile bağlayın. İzofluranı% 1.5'e düşürün ve her iki akciğerin de mekanik olarak havalandırıldığından emin olun.
NOT: İzofluran konsantrasyonunu azaltmayı unutmayın. Aksi takdirde, fare aşırı dozda anestezi alacaktır. - Her iki göze göz merhemi sürün ve deri altına 5 mg/kg carprofen enjekte edin.
- Fareyi sağ şakak bölgesi yukarı bakacak şekilde yanal konumda tutun. Bir ısıtma yastığı (35 °C) ve bir sıcaklık regülatörü tarafından kontrol edilen bir ısı lambası kullanarak rektal sıcaklığı 37 ° C'de tutun (bkz.
- Sağ göz ve kulak arasındaki yüzey alanını tıraş edin ve cerrahi bölgeyi iyot ve alkollü çubuklarla en az üç kez dezenfekte edin.
2. MCAO ameliyatı
- MCAO ameliyatı için steril alet paketini açın. Steril eldiven giyin ve cerrahi makas kullanarak sağ göz ile sağ kulak arasında 1 cm'lik bir cilt kesisi yapın.
NOT: Her 15 dakikada bir cilt rengini, vücut ısısını ve ayak parmağını sıkıştırmaya verilen tepkiyi izleyin. - Temporal ve masseter kaslarını ortaya çıkarmak için alttaki fasyayı forseps ile inceleyin.
NOT: Parotis bezine zarar vermemeye dikkat edin. - Temporal kasın alt kısmına dokunmak ve elmacık kemerinin yerini tespit etmek için forseps kullanın. Fasiyal sinirin dallarını dikkatlice kenara çekin.
- Temporal kas üzerinde 5 mm'lik enine bir kesi kesmek için yüksek sıcaklıktaki bir koter halkasının ucunu kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Altta yatan elmacık kemerini incelemek ve maksilla ile elmacık kemikleri arasındaki eklemi ortaya çıkarmak için iki forseps kullanın.
- Elmacık kemerinin 3 mm'lik bir kısmını kesmek için makas kullanın ve çıkarın. Masseter kasını kafa tabanından ayırın.
NOT: Retroorbital sinüs ve yüzeyel temporal veni kırmamaya dikkat edin. - Trigeminal sinir dalları bir ekartör tarafından yanal olarak çekilecek şekilde, kraniyal kafatası tabanını ortaya çıkarmak için farklı yönlerde konumlandırılmış dört küçük ekartör uygulayın.
NOT: Kraniyal tabanın dış yüzeyindeki bir sulkus, frontal ve temporal loblar arasındaki lateral fissürün yerini gösterir. MCA burada yatar (Şekil 2A) ve gövdesi ve dalları ince, şeffaf kafatasından görülebilir (Şekil 2B). Bu arterin diğer majör serebral arterlerle ilişkisi Şekil 2A'da gösterilmektedir. - MCA gövdesinin üzerindeki kafatasına ve rinal korteksin dalına proksimalde% 0.9 normal salin damlası uygulayın. Küçük bir kırık görünene kadar kafatasını inceltmek için elektrikli bir öğütücü kullanın.
NOT: Kafatasına nüfuz edebileceğinden ve alttaki artere zarar verebileceğinden öğütücüyü kafatasına doğru itmeyin. - İnceltilmiş kafatasını kaldırmak ve çıkarmak için forsepsin ucunu kullanın. Sahte fareler için burada durun ve arteri bağlamayın.
NOT: MCA gövdesi boyunca küçük bir dikdörtgen pencere oluşturulmuştur. - MCA'nın üzerine tek iplikli siyah örgülü ipek bir halka yerleştirin (Şekil 2C). 8-0 ekleyin MCA gövdesini kaldırmak için mikrocerrahi iğne ve iğnenin her iki ucunu ipek iplik ilmek düğümünün üstünde bırakarak dikişi (bkz. Malzeme Tablosu) iğnenin altına bağlayın (Şekil 2D).
- Geçici MCAO için, MCAO başlangıcını temsil eden arteriyel kan akışını engellemek için ipek iplik düğümünü iğnenin altında hafifçe sıkın (Şekil 2E).
- Sütürü tutmak için forseps kullanın ve iskeminin sonunda iğneyi yavaşça çıkarın (ör., 60 dakika veya daha uzun).
NOT: İğne çıkarıldığında, ipek iplik düğümü MCA'dan kaydırılır ve beyin yeniden perfüze edilir (Şekil 2F). - Kalıcı MCAO için, atardamarın etrafındaki ipek iplik halkasını sıkıca sıkın ve iğneyi çıkarın. Fazla dikiş malzemelerini kesin ve çıkarın.
- Cilt kesisine %0.25'lik bir damla bupivakain uygulayın ve aralıklı olarak 6-0 naylon sütür kullanarak kas ve cildi ayrı ayrı dikin (bkz. Cilt kesisinin yüzeyine antibiyotik merhem sürün.
NOT: Cilt kesisi steril zımba veya yapıştırıcı ile de kapatılabilir.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Fareyi uyandırmak için izofluranı kapatın. Spontan solunum geri geldiğinde ventilatörün bağlantısını kesin.
- Fareyi kontrollü bir sıcaklığa sahip bir kurtarma odasına ( Malzeme Tablosuna bakın) aktarın.
- Fareyi doğrultma refleksi geri geldiğinde veya hareket etmeye başladığında ekstübe edin.
- Fareyi sıcaklık ve nem kontrollü bir odada yakından izleyin. Tam bilinç kazandıktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun (iyileşme süresi ~ 2 saat). 3 gün boyunca günde 5 mg / kg Carprofen'i deri altından uygulayın.
4. Lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI)
- MCAO'dan altı ve 24 saat sonra, anestezi uygulanmış fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin. Başın üstünü tıraş edin ve üç alternatif iyot ve alkol çubuğuyla temizleyin.
NOT: Anestezi, adım 1.3'te belirtildiği gibi gerçekleştirildi. LSCI, MCAO'dan önce de yapılır. - 3 cm'lik bir orta hat cilt kesisi yapın ve cildi kafatasından diseke edin. Kafatasının üst kısmını ortaya çıkarmak için dört küçük iğne ekartörü uygulayın.
- Lazer benekli kamerayı ( Malzeme Tablosuna bakın) başın üzerine getirin ve kameranın odağını ayarlayın. Serebral kan akışını görüntüleyin.
5. 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama
- Deneyin sonunda, tipik olarak inmeden sonraki 1, 3 veya 28. günlerde% 5 izofluran ile fareyi derinlemesine uyuşturun. Ağrı tepkisi olmadığından emin olmak için kuyruğu sıkıştırın.
- Cerrahi bir makas kullanarak farenin kafasını kesin ve beyni toplayın. Beyni buz gibi tuzlu suda 20 dakika inkübe edin.
- Beyni buz üzerinde bir beyin dilimleyici matrisine koyun ve beynin üzerine soğuk salin damlatın. İnce jilet kullanarak beyni 1 mm'lik dilimler halinde kesin.
- Beyin dilimlerini aynı yönde% 2 TTC çözeltisi içeren bir tabağa daldırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Çanağı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
NOT: Normal beyin dokusu kırmızılaşır ve iskemik doku beyaz kalır. - Beyin dilimlerini 24 saatlik fiksasyon için% 10 formaline aktarın. Beyin dilimlerini görüntüleyin ve enfarktüs alanını ölçün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Cerrahi mikroskop altında doğrudan bir görünümle, iskemi sırasında MCA kan akışının engellendiği görsel olarak doğrulanabilir. Önceki çalışmamız, bir lazer Doppler monitörü6 kullanarak iskemik alanda% >80 kan akışında azalma olduğunu gösterdi. MCAO sonrası kan akımı değişikliklerini belirlemek için, iskemik hakaret ve reperfüzyonu daha fazla doğrulamak için LSCI kullanılabilir (Şekil 1). Nitekim, Şekil 3A'da, sağ MCA bölgesinde kan akı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İlk transkraniyal MCA oklüzyon modeli 1981'desıçanlarda kuruldu 11,12 ve 1989'da yerini kraniektomisiz MCAO modelialdı 4. İlk transkraniyal MCA oklüzyonu, tüm elmacık arkının çıkarıldığı ve kasların lateral olarak çekildiği geniş bir cerrahi alana sahipti. Ameliyattan sonra lokal dokular şişti, bu da strese neden oldu ve hayvanlar için gıda alımını azalttı. Modifiye transkraniyal MCAO modelimizde, insizyon daha az invazivdir ve zigomatik a...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, editoryal desteği için Kathy Gage'e teşekkür eder. Şema figürleri BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Anesteziyoloji Anabilim Dalı (Duke Üniversitesi Tıp Merkezi) ve NIH hibeleri (NS099590, HL157354, NS117973 ve NS127163) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 bupivakain | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9 sodyum klorür | YBÜ Tıbbi | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Trifeniltetrazolyum Klorür (TTC) | Sigma veya mevcut herhangi bir satıcı | ||
| 20 G IV kateter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G iğne | BD | 305106 | |
| 4-0 ipek sütür | Look | SP116 | Siyah örgülü ipek |
| 8-0 iğneli sütür | Ethilon | 2822G | |
| Alkollü bezler | BD | 326895 | |
| Anestezi indüksiyon kutusu | Herhangi bir uygun satıcı | Pexiglass markası | |
| Elektrikli öğütücü | JSDA | JD 700 | |
| Yüksek sıcaklık koter döngü ucu | Bovie | AA03 | |
| İzofluran | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Lazer doppler perfüzyon monitörü | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Yağlayıcı göz merhemi | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Fare rektal probu | Physitemp | RET-3 | |
| Azot Oksit | Hava Gazı | UN1070 | |
| Otoskop | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Spekulum Otoskop, farelerde ses tellerini görselleştirmek için bir laringoskop görevi gördü |
| Oksijen | Hava Gazı | UN1072 | |
| Povidon-iyot | CVS | 955338 | |
| Kurtarma kutusu | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Enjekte edilebilir 50 mg / mL |
| Kemirgen ventilatörü | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Sıcaklık kontrolörü | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Üçlü antibiyorik ve ağrı kesici | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Buharlaştırıcı | RWD | R583S |
Kaynaklar
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
