Çok Kapsamlı Bir Membran Proteini Olan ATG9A'nın Görüntülenmesi

ATG9A, çekirdek otofaji mekanizmasının tek transmembran proteinidir ve endozomal bölme^1'den geçerek Golgi ile sitozolik bir ATG9A vezikül bölmesi arasında kaçakçılığı yapılır. Uzun zamandır esrarengiz olan ATG9A'nın, membran çift katmanları ^2,3 boyunca lipitleri dengelediği için son zamanlarda bir lipit scramblase olarak işlev gördüğü tanımlanmıştır. ATG9A'nın otofagozom oluşumunda hiyerarşinin en üstünde yer aldığı ve bu nedenle çalışmasının otofajiyi anlamak için hayati önem taşıdığı^{açıktır 4,5}. Bu nedenle, ATG9A vezikülleri yakın zamanda otofagozom ^6,7'nin "tohumu" olarak önerilmiştir. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, ATG9A'nın olgunlaşmasının farklı aşamalarında oluşan otofagozom ile yalnızca geçici olarak etkileşime girdiğini ve otofajik membran ^6,8,9,10,11 ile bütünleşmediğini göstermiştir. Bu nedenle, ATG9A'nın otofagozom oluşumundaki rolünü ve potansiyel çoklu fonksiyonlarını tamamen çözmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, mevcut modeller ile önceki veriler arasındaki tutarsızlık, yalnızca doğrulanmış kantitatif yaklaşımlar ve hücre içi belirteçler kullanılarak ATG9A'nın kaçakçılığını ele alan hedefli deneylerle çözülebilir.

ATG9A'yı incelemek için her biri avantaj ve dezavantajlara sahip çeşitli araçlar vardır ve bu araçların kullanımı ATG9A'nın yapısı, moleküler işlevi ve hücresel trafiği^nedeniyle karmaşıktır ^2,8,12. ATG9A bir homotrimer oluşturur, glikosile edilir ve hücre boyunca Golgi, endozomlar ve plazma zarı^13,14 gibi bölmelere aktarılır. Karmaşık güzergahı göz önüne alındığında, belirli tedaviler veya uyaranlar (besin ve serum açlığı gibi) üzerine Golgi'den ATG9A dağılımı gibi okumaları yorumlamada çeşitli zorluklar vardır. ATG9A, veziküler kaçakçılık açısından son derece dinamiktir; gerçekten de, ATG9A içeren veziküller, açlığa bağlı otofaji bağlamında ATG9A bölmesi olarak tanımlanmıştır. Bu dinamik veziküller tarafından oluşturulan ATG9A bölmesi, birkaç hücre içi organel 8,15,16,17 ile geçici olarak etkileşime girer. İmmünofloresan, canlı görüntüleme ve glikozilasyon deneyleri dahil olmak üzere burada açıklanan teknikler, ATG9A biyolojisinin saptanmasına ve anlaşılmasına yardımcı olmalıdır. Özellikle, bu makalede açıklanan yaklaşımlar, belirli hücresel bölmelere lokalizasyon ve belirli protein ortakları ve/veya zar bölmeleri ile etkileşimler hakkındaki soruların ele alınmasına yardımcı olacaktır. ATG9A hidrofobik korunmuş çekirdek alanı (PFAM etki alanı PF04109) benzersiz bir topolojiye ve ATG9A'nın birkaç zar bölmesi arasında döngülerine sahip olduğundan, araştırmacılar ATG9A'yı geçici olarak aşırı eksprese ederken endoplazmik retikulum (ER) retansiyonu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere bazı tuzakların ve artefaktların farkında olmalıdır. Proteinin yanlış katlanması, normal yetiştirme koşullarında artefakt agregasyonu veya immünofloresan için suboptimal geçirgenlik protokolleri nedeniyle veziküler bölmenin yetersiz tespiti nedeniyle diğer olası sorunlar ortaya çıkabilir.

Endojen ATG9A'yı görüntülerken, sonraki kantitatif analizin kalitesini ve verilerin doğru yorumlanmasını sağlamak için numune hazırlama ve görüntü elde etme konusunda dikkatli olunmalıdır. Bu makalede açıklanan teknikleri standart biyokimyasal yaklaşımlarla (burada açıklanmayan immünopresipitasyon veya aşağı çekme deneyleri gibi) birleştirmek, ATG9A fonksiyonunu anlamamızı geliştirmelidir. Bu deneysel araç seti, yeni araştırmacıların ATG9A'nın biyolojik sistemlerindeki işlevini belirlemek için gereken bazı tahlillerde gezinmelerine yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler, talep üzerine temin edilebilen ATG9A DNA yapıları ve ev yapımı STO-215 antikoru (bkz. Burada açıklanan analiz araçları, açık kaynaklı yazılıma (FIJI/ImageJ)¹⁸ dayanmaktadır.

1. Hücre kültürü

1. T150 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişedeki HEK293A hücreleri,% 10 FBS (fetal sığır serumu) ve 4 mM L-glutamin ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM'de% 80 -% 90 birleşmeye kadar koruyun (bkz. Hücreleri 37 °C'de% 10 CO_2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
   NOT: Bu çalışmada HEK293A hücreler kullanılmıştır, çünkü amino asit açlığı üzerine sağlam bir kanonik otofaji tepkisine sahiptirler, bu da özellikle lipidlenmiş, membranla ilişkili LC3 1,9,19'daki bir artışla tespit edilir ve görüntüleme için uygundur.
2. Serolojik bir pipet kullanarak besiyerini şişeden aspire ederek hücreleri geçirin. Hücreleri ayırmak için 2 mL Tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi eklemeden önce hücreleri bir kez 15 mL 1x PBS (fosfat tamponlu salin) veya benzer bir çözelti ile yıkayın. Ayrılmış hücreleri 8 mL DMEM ile toplayın ve burada açıklanan deneyler için 2 gün sonra% 80 -% 90 birleşmeye ulaşılacak şekilde bir dizi hücreyi geri tohumlayın.

2. ATG9A'nın endojen boyanması

1. Tohum HEK293A hücreleri (veya tercih edilen hücreleri) steril No. 1.5 cam lameller üzerine yerleştirin ve ertesi gün ~% 80 birleşik olacak şekilde 24 oyuklu bir plakaya yerleştirilir. Bu tipik olarak 500 μL DMEM'de 7 x 10⁴ hücre/kuyu verir.
   NOT: HEK293A hücreleri veya diğer gevşek yapışan hücre hatları için, lamellerin deiyonize suda 0.1 mg / mL'de poli-D-Lizin ile kaplanması gerekir. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca kuyucuklara yerleştirilen lamellerin üstüne 500 μL poli-D-lizin ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından deiyonize su ile üç yıkama ve DMEM'de son bir yıkama. Kaplamadan sonra hücreleri tohumlamaya devam edin ve kültür kabına eşit şekilde dağılmalarına dikkat edin.
2. Hücreleri spesifik deneysel koşullara göre tedavi edin (yani, EBSS'de [Earle's Balanced Salt Solution] 2 saat açlık).
   NOT: EBSS bileşimi 1 g/L D-glikoz, 6.8 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, 0.151 g/L CaCl 2.2H2O, 0.2 g/L mM MgSO 4.7H 2 O,_0.124g/L NaH 2 HPO _4.2H 2 O ve_2.2 g / LNaHCO_3'tür (Malzeme Tablosuna bakınız) damıtılmış suda çözülür.
3. Ortamı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için RT'de 20 dakika boyunca 0.1 mM CaCl 2 ve 0.1 mM MgCl₂ ile desteklenmiş PBS'de 500 μL% 4 formaldehit çözeltisi ile dikkatlice değiştirin.
4. Her kuyucuktan% 4 formaldehit çözeltisini aspire edin ve 500 μL PBS ile değiştirin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Lamellerin kurumasına veya sıvısız kalmasına izin vermeyin.
5. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 500 μL 50 mM_NH4Cl çözeltisi kullanarak serbest aldehit gruplarını söndürün.
6. PBS'yi aspire edin ve hücrelere nüfuz etmek için RT'de 5 dakika boyunca PBS'de 500 μL 50 μg / mL digitonin çözeltisi (deiyonize suda stok çözeltisi 1 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ile değiştirin.
7. Digitonin çözeltisini her kuyucuktan aspire edin ve 500 μL PBS ile değiştirin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
8. PBS'yi her bir oyuktan aspire edin ve RT'de 30 dakika boyunca 500 μL bloke edici solüsyon (PBS'de seyreltilmiş% 5 BSA [sığır serum albümini]) ile değiştirin.
9. Engelleme solüsyonunu aspire edin ve 500 μL PBS ile değiştirin.
10. Cımbız kullanarak, lamelleri kuyudan toplayın, ince mendil veya selüloz filtre kağıdı kullanarak fazla PBS solüsyonunu dikkatlice çıkarın ve her bir lamel hücre tarafı aşağı bakacak şekilde 50 μL'lik bir primer antikor solüsyonu damlası üzerine nazikçe yatırın (örneğin, Ermeni Hamster 14F2 %1 BSA/PBS solüsyonunda 0,9 μg/mL'ye seyreltilmiş , bkz. RT'de 1 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
    NOT: Kolay kullanım için, antikor çözeltisi damlaları, doğrudan katı bir yüzey yerine başka bir kap içinde kendinden sızdırmaz bir termoplastik film tabakasına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirilebilir.
11. Lamelleri cımbız kullanarak toplayın ve ince doku mendilleri kullanarak fazla primer antikor solüsyonunu nazikçe boşalttıktan sonra, lamelleri (hücre tarafı yukarı) 24 oyuklu plakaya yerleştirin ve PBS ile üç kez yıkayın.
12. Adım 2.10'u tekrarlayın. Cımbız kullanarak, her bir oyuktan lamelleri toplayın, ince doku mendilleri kullanarak fazla PBS'yi dikkatlice boşaltın ve her bir lameli (hücre tarafı aşağı) 1:1,000 oranında seyreltilmiş 50 μL'lik bir ikincil antikor çözeltisi damlası üzerine nazikçe yatırın %1 BSA/PBS çözeltisi (örneğin, sığır, insan ile minimum çapraz reaktiviteye sahip olan Cy3 Keçi Anti-Ermeni Hamster IgG, fare, tavşan ve sıçan serum proteinleri, Malzeme Tablosuna bakınız). RT'de 1 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
    NOT: İsteğe bağlı: Sonraki görüntü analizi için ikincil antikora ek olarak bir hücre iskeleti işaretleyicisi kullanılabilir (yani, 1:1.000 seyreltilmiş Alexa Fluor 647 Phalloidin , bkz. Kolay kullanım için, antikor çözeltisi damlaları, doğrudan katı bir yüzey yerine başka bir kap içindeki bir sızdırmazlık filmi tabakasına yerleştirilebilir.
13. Lamelleri cımbız kullanarak toplayın ve fazla ikincil antikor solüsyonunu boşalttıktan sonra, lamelleri 24 oyuklu plakaya (hücre tarafı yukarı) yerleştirin ve 500 μL PBS ile üç kez yıkayın.
14. Cımbız kullanarak, lamelleri toplayın, ince mendil mendilleri kullanarak fazla PBS'yi dikkatlice boşaltın ve her bir lamel (hücre tarafı aşağı bakacak şekilde) PBS'de 50 μL'lik 1:4,000 Hoechst çözeltisi (Hoechst 33342) damlasına nazikçe yatırın. RT'de 5 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin.
    NOT: Kolay kullanım için, antikor çözeltisi damlaları, doğrudan katı bir yüzey yerine başka bir kap içindeki bir sızdırmazlık filmi tabakasına yerleştirilebilir.
15. Lamelleri cımbız kullanarak toplayın ve ince mendil mendilleri kullanarak fazla Hoechst solüsyonunu nazikçe boşalttıktan sonra, 24 oyuklu plakadaki lamelleri değiştirin ve üç kez PBS ile ve bir kez deiyonize su ile yıkayın (yıkama başına 500 μL).
16. İnce mendil mendilleri kullanarak fazla deiyonize suyu dikkatlice boşaltın ve her bir lamel (hücre tarafı aşağı bakacak şekilde) immünofloresan için bir mikroskop lamı üzerinde lekelenmiş 10-20 μL'lik bir montaj çözeltisi damlası üzerine nazikçe yerleştirin ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin.
    NOT: Burada kullanılan montaj ortamı, daldırma yağı ile aynı kırılma indisine sahiptir ve RT'de birkaç saat sonra veya gece boyunca 4 °C'de sertleşir. Sertleşmeyen montaj solüsyonları kullanılabilir, ancak lamel oje ile kapatılmasına özen gösterilmelidir.
17. Fazla montaj solüsyonunu aspirasyonla çıkarın ve numuneleri gece boyunca karanlıkta, bir sürgü tutucuda veya alüminyum folyo ile kaplanmış olarak RT'de düz yatarken kurumasını bekleyin.

3. Görüntü edinme

1. Konfokal mikroskobu açın. Görüntü alma kurulumunu başlatmak için görüntüleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. İşlev sekmesinde, analiz için görüntüleri yakalamak üzere Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 objektif lensini seçin.
3. Edinme İşlevi sekmesinde, Kontrol Panelinin Lazer bölgesinde uygun lazerleri açın (Argon, Diyot-405-30, DPSS 561-10 ve HeNe633).
4. Kontrol Panelinin Görüntüleme Kurulumu alanında, sıralı alım gerçekleştirmek için her biri bir kanala karşılık gelen dört kanal oluşturun.
5. Çekim Modu penceresinde görüntülerin uygun çözünürlüğünü ayarlayın. Çözünürlüğü 1.024 x 1.024 (Çerçeve boyutu) olarak ayarlayın ve 16 bitlik bir Bit derinliği seçin.
6. Her kanal için, görüntü yoğunluğu analizini engelleyecek doygun pikseller olmadan iyi bir sinyal elde etmek için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. Canlı düğmesini kullanarak Lazer çıkış seviyesini ve Kazancı (Master) ayarlayın.
   NOT: Doygun piksel algılaması için aralık göstergesi seçeneğinin kullanılması önerilir. Arka plan gürültüsünü önlemek için lazer gücünü %1 ile %10 arasında ve Kazancı (Master) 850'nin altında tutun.
7. Kontrol Panelinin Kanallar bölgesinde, en yüksek dalga boyuna sahip kanal için 1 Havadar Birimi (AU) göz önünde bulundurarak her kanal için aynı iğne deliği açıklığını ayarlayın.
8. Benzer miktarda hücre içeren 10 rastgele alan alın (alan başına 20-30 hücre). Koşul başına 100-200 hücrenin alınması, daha sonraki görüntü analizi için iyi bir güç sağlayacaktır.

4. ATG9A dağılımının görüntü analizi

1. FIJI yazılımını internetten indirin (Malzeme Tablosuna bakın). Eklentiler > Bio-Formats > BioFormats Importer'a tıklayarak görüntüyü FIJI ile açın.
2. Ölçümleri analiz et > ayarla'ya tıklayın ve yoğunluk analizi için ölçümler penceresinde Ortalama gri değerini seçin.
3. Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar'a tıklayın ve kanalları üç görüntüye ayırın (Golgi işaretleyici, hücre iskeleti, ATG9A sinyali).
4. Görüntü > > Eşiği Ayarla'ya gidin ve kanalda Golgi işaretçisine karşılık gelen bir eşik tanımlayın.
5. Edit > Selection > Create Selection'a tıklayın ve ikili görüntüden bir seçim oluşturun.
6. > Seçimini Düzenle > Yöneticiye Ekle > Yeniden Adlandır'a (Golgi) gidin, seçimi ROI yöneticisine kaydedin ve Golgi olarak yeniden adlandırın.
7. Eşiği Ayarla > Görüntü > tıklayın ve hücre konturunu tanımlamak için hücre iskeleti işaretleyicisine karşılık gelen kanalda bir eşik tanımlayın.
8. > Seçimi Düzenle > Seçim Oluştur'a gidin ve ikili görüntüden bir seçim oluşturun.
9. > Seçimi Düzenle > Yeniden Adlandır > Yöneticiye Ekle (Toplam) seçeneğine tıklayın, seçimi ROI yöneticisine kaydedin ve Toplam olarak yeniden adlandırın.
10. ATG9A boyamaya karşılık gelen görüntüyü seçin.
11. Analiz > Ölçü'de, üzerine tıklayarak ROI Golgi'yi uygulayın ve Golgi bölgesinin yoğunluğunu ölçün.
12. Analiz Et > Ölç'e tıklayın, üzerine tıklayarak ROI Toplamını uygulayın ve Toplam bölgesinin yoğunluğunu ölçün.
13. Prosedürü tüm görüntülerde tekrarlayın, sonuçları .csv dosyaları olarak kaydedin ve aşağıdaki formülü kullanarak verileri işleyin:
    ATG9A dağılım hızı = Golgi yoğunluğu/Toplam yoğunluk

5. ATG9A yapılarının canlı hücre görüntülemesi

1. Tohum HEK293A hücreleri (veya tercih edilen hücreleri) 2 mL ortamda 60 mm'lik bir doku kültürü kabına tohumlayın, böylece ertesi gün ~%65-%70 birleşmeye ulaşırlar; Bu genellikle 1 x 10 6-2 x 10⁶ hücre verir.
2. Ertesi gün, Lipofektamin hazırlayın: DNA karışımları (veya uygun bir alternatif DNA transfeksiyon reaktifi, Malzeme Tablosuna bakınız):
   1. Yapı ekspresyon verimliliğine bağlı olarak, 0.5-2 μg plazmit DNA'yı 100 μL'lik uygun bir serumsuz ortama seyreltin ve çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Karışımı RT'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Plazmit DNA yapısı deneye özgüdür. Araştırmacılar kendi başlarına klonlayabilir veya talep etmeleri halinde yazarlardan temin edebilirler.
   2. Lipofectamine 2000 transfeksiyon reaktifini 3:1 Lipofektamin:DNA oranında 100 μL'lik uygun bir serum içermeyen ortama seyreltin ve çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Bu karışımı RT'de 5 dakika inkübe edin.
   3. Her iki çözeltiyi hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek ve RT'de 20 dakika inkübe ederek karıştırın.
3. Lipofektamin: DNA karışımını 4 mL büyüme ortamı içeren her hücre kültürü plakasına ekleyin ve karışımı eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın. Hücreleri% 10 CO_2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
4. Ortamı, transfeksiyondan 4 saat sonra taze büyüme ortamı ile değiştirin ve hücreleri, gece boyunca% 10 CO_2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
5. Ertesi gün, canlı hücre mikroskobu için uygun kültür kaplarında hücreleri deneyin, sayın ve yeniden tohumlayın (1.5 No'lu cam lamel ile kültür kapları, bkz. Görüntüleme sırasında lamel üzerinde ~% 60 -% 75 birleşmeye ulaşmak için bulaşıkların üzerine 0.4 x 10 6-0.7 x^{10 6} hücre tohumlayın.
   NOT: Adım 2.1'de açıklandığı gibi poli-D-lizin ile kaplama, HEK293A hücreleri için önerilir.
6. Ertesi gün (transfeksiyondan 48 saat sonra), hücreleri görüntüleyin.

6. ATG9A'nın glikozilasyon durumunun araştırılması

1. Tohum HEK293A hücreleri (veya tercih edilen hücreleri) 10 cm'lik bir doku kültürü kabına koyun, böylece tipik olarak 10 mL'de 1.5 x 10^{6 hücre veren} endojen ATG9A'yı araştırmayı planlıyorsanız, ertesi gün ~% 80 birleşmeye ulaşırlar. Alternatif olarak, tipik olarak 10 mL'de 1 x 10 6-1.5 x 10 6 hücre veren ATG9A yapılarını transfekte ederse hücreleri ~% 65 -%⁷⁰ birleşmeye ulaşacak şekilde tohumlayın.
2. Ertesi gün hücrelere 100 μg / mL sikloheksamit (CHX, Malzeme Tablosuna bakınız) veya araç uygulayın. 24 saat (veya istenen bir zaman noktasına kadar) inkübe edin.
3. Hücreleri inkübatörden çıkarın, ortamı aspire edin ve buzun üzerine yerleştirin. 5 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile değiştirin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri tabaktan fiziksel olarak ayırın ve PBS hücre çözeltisini 15 mL'lik konik tabanlı bir tüpe pipetleyin. Hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri ~ 100 μL'de (hücre peletinin boyutuna bağlı olarak) buz gibi soğuk TNTE lizis tamponunda (% 1 Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA) proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri ile desteklenmiş (bkz. Malzeme Tablosu) ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   1. Lizatı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, çekirdekleri ve çözünmeyen kalıntıları çökeltmek için lizatı 20.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Bradford yöntemi²⁰ ve 595 nm dalga boyunda ölçüm yapabilen bir spektrofotometre kullanarak lizatın protein konsantrasyonunu ölçün.
6. Protein miktarlarını normalleştirin ve 1 μL PNGase F enzimi eklemeden önce üreticinin talimatlarına göre 16 μL lizatı (toplamda 100 μg'dan fazla protein içermeyen) 5x PNGase F (Peptit: N-glikosidaz F) tamponu ile birleştirin (bkz. PNGase F üreticisinin talimatına göre inkübe edin.
7. 1x konsantrasyon elde etmek için 3x Laemmli numune tamponu ekleyin ve proteinlerin ayrılmasını en üst düzeye çıkarmak için bir Tris-asetat jeli kullanarak elektroforez için yüklemeden önce 65 °C'de 5 dakika inkübe edin. Proteinleri jelden uygun bir zara aktarın (yani, PVDF [poliviniliden diflorür]) standart western blot protokollerini²¹ kullanarak (bkz.
   NOT: Numunelerin 95 °C'de kaynatılması ATG9A'nın toplanmasına neden olacak ve böylece ATG9A'nın tespitini azaltacaktır.
8. ATG9A için spesifik antikorlar (STO-215 antikoru, kurum^{içi 1}) kullanarak western blot'u gerçekleştirin (bkz. Daha yüksek ATG9A moleküler ağırlıklı türleri görselleştirmek için zarın daha yüksek moleküler ağırlıklı bölümünü kesmeden bırakın.

ATG9A, birkaç hücre içi zar bölmesi 8,17,22,23,24 ile ilişkili bir transmembran proteinidir. Bazal koşullarda, ATG9A, endojen proteinin immünofloresansı ve bir cis-Golgi belirteci olan GM130 (Şekil 1A) ile örtüşmelerin yanı sıra endositik geri dönüşüm bölmesi (ERC) ile kısmen örtüşen küçük veziküllerde gösterildiği gibi, esas olarak trans-Golgi ağında (TGN) lokalizedir.23. Golgi'deki ATG9A lokalizasyonu, farklı immünofloresan protokolleri kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, ATG9A'nın veziküler fraksiyonu ve lokalizasyonunun değişmesi, özellikle veziküler havuzdaki artış, besin ve serum açlığı gibi spesifik uyaranlara yanıt olarak, yoğunluk açısından oldukça değişken olabilir ve geleneksel görüntüleme yaklaşımlarıyla görselleştirilmesi zor olabilir. Golgi'de lokalize ATG9A ile veziküler fraksiyona lokalize ATG9A arasındaki oran, ATG9A dağılım hızı olarak adlandırılır. ATG9A dağılım hızındaki değişiklikleri tespit etmek için, örneğin hem serum hem de amino asitleri tüketmek için kullanılan EBSS tedavisinde, GM130 veya TGN46 gibi bir Golgi belirteci ve hücre konturu25'i boyayan Phalloidin gibi bir hücre iskeleti belirteci, ATG9A dağılımını kolayca ölçmek için yararlıdır (Şekil 1B). Daha da önemlisi, ortalama floresan oranı analizi, sabit bir dağılım oranı olarak değil, yalnızca koşullar arasında karşılaştırmalı bir ölçü olarak yorumlanabilir. Bölmeler arasındaki oran, kullanılan hücre hattı, boyama kalitesi veya uygulanan eşikleme yöntemleri gibi biyolojik ve biyolojik olmayan faktörlere büyük ölçüde bağlıdır (Şekil 1B). Bu nedenle, araştırmacının ATG9A Golgi zenginleştirmesini kendi özel deneysel koşullarında tespit edebilen bir boru hattı kurması ve ardından analizi aynı parametrelerle analiz edilecek setteki tüm görüntülere genişletmesi gerekir. ATG9A ortalama floresansının analizi için seçilen temsili ikili görüntüler ve alanlar, Şekil 1B'de bir kılavuz olarak gösterilmiştir.

ATG9A, C-terminal dizisinin protein12'nin neredeyse yarısını kapsadığı, nispeten esnek ve yapılandırılmamış iki N- ve C-terminal alanı ile çevrili birkaç transmembran alanı barındırır. Daha da önemlisi, aşırı eksprese edilen ATG9A'nın lokalizasyon modeli, hangi protein ucunun etiketlendiğinden etkilenebilir (Şekil 2A). Özellikle, geçici ekspresyon sistemleri kullanıldığında ve ATG9A'yı doğrudan N-terminalinde bir floresan etiketle (örneğin, eGFP, mRFP veya türevleri) etiketlerken, Golgi lokalizasyonu kısmen tehlikeye girebilir, bazal (yani beslenen) koşullarda daha az zenginleştirme görülürken, ATG9A vezikülleri hala kolayca görülebilir (Şekil 2A). ATG9A'yı C-terminalinde etiketlemek, toplanabilecek daha büyük GFP pozitif kümelerini hafifçe indüklüyor gibi görünüyor. Son olarak, mRFP-ATG9A'nın monomerik bir versiyonu, aşırı eksprese eden hücrelerde benzer floresan vezikül kümeleri ve küçük Golgi boyaması gösterir (Şekil 2A).

ATG9A, Golgi ve ATG9A veziküllerine gönderilmeden önce ER membranında katlanır. Acil serviste ikamet etmesi sırasında, ATG9A, Asparagin 99 üzerindeki N-bağlı glikanlar tarafından modifiye edilir ve daha sonra Golgi'ye ulaştığında, karmaşık, olgun N-bağlı glikanlar 1,14 elde eder. Glikozilasyon ile bu modifikasyon, bir çift bant14'ün ortaya çıkmasıyla western blot yoluyla tespit edilebilir. Hücre içi lokalizasyonu ile tutarlı olarak, çoğu endojen ATG9A, kompleks N-bağlı glikanları barındırır ve bu nedenle, daha yüksek moleküler ağırlık bandı baskındır ve soluk bir düşük moleküler ağırlık bandı da görülebilir (Şekil 2B). Bir çift bandın varlığı, daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin çözünürlüğünü iyileştirmek için Tris-asetat jelleri kullanıldığında en kolay şekilde görülür (Şekil 2B, kontrol, t = 0). Endojen protein, kompleks N-bağlı glikanların çoğunu uzaklaştıran PNGase F (Peptit: N-glikozidaz F) tedavisine tabi tutulduğunda, protein tek bir bant olarak çalışır (Şekil 2B, PNGase F, t = 0). Bu nedenle, ATG9A'nın N-bağlı glikozilasyon durumu, ATG9A'nın ER'den Golgi'ye çıkışını izlemek için bir vekil olarak kullanılabilir, bu da iki bant arasındaki nispi oran tarafından yansıtılır.

mRFP-ATG9A geçici olarak transfekte edildiğinde, aşırı eksprese edilen protein başlangıçta ER'de birikir, çünkü potansiyel olarak kaçakçılık makinesi tüm ATG9A'yı katlayamaz ve trafiğe çıkaramaz ve daha düşük moleküler ağırlık bandı baskındır (Şekil 2C, kontrol t = 0). Özellikle, mRFP-ATG9A'nın 24 saatlik ekspresyonundan sonra, üst ve alt bantlar arasında yaklaşık olarak eşit bir dağılım vardır, bu da mRFP-ATG9A havuzunun Golgi'ye doğru hareket ettiğini düşündürür (Şekil 2C, Kontrol, t = 24). Hücreler, de novo protein sentezini bloke eden sikloheksimid (CHX) ile tedavi edilirse26, ATG9A'nın ER'den katlanması ve çıkışı açıklığa kavuşturulabilir. Endojen protein katlandığından, glikosile edildiğinden ve Golgi'de yerleşik olduğundan, CHX ile tedavi, düşük ve yüksek moleküler ağırlık bantlarının oranını önemli ölçüde değiştirmez (Şekil 2B, Kontrol). Bununla birlikte, mRFP-ATG9A'nın geçici ekspresyonunu kullanarak, CHX tedavisi daha yüksek moleküler ağırlık bandının birikimini teşvik eder (Şekil 2C, Kontrol, CHX t = 24). Daha yüksek moleküler ağırlıklı aşırı eksprese edilen mRFP-ATG9A bandı, PNGase F ile tedaviden sonra alt banda çöker (Şekil 2C, PNGase F, t = 24). Bu veriler, endojen proteinin, daha yüksek moleküler ağırlık bandının baskınlığı ile yansıtıldığı gibi, hızlı bir şekilde olgun glikanlar edindiğini ve CHX takibinin çift bantların oranını etkilemediğini göstermektedir (Şekil 2B). Geçici olarak aşırı eksprese edilen mRFP-ATG9A durumunda, CHX tedavisi üst bandın birikmesini indükler, bu da ER havuzu katlanıp ER'den Golgi'ye çıktıkça daha olgun glikanların elde edildiğini gösterir (Şekil 2C).

ATG9A dizisi ve floresan etiketler arasına bir bağlayıcının eklenmesi, proteinin daha fizyolojik bir lokalizasyonunu ve ticaretini teşvik etmede yardımcı olabilir. Bir N-terminal florofor ve ATG9A arasında bir 3x-FLAG dizisinin (24 amino asit) kaynaştırılması, aşırı eksprese edilen proteinin endojen olana benzer şekilde davranmasına yardımcı olur (Şekil 3). Gerçekten de, aşırı eksprese edilen mCherry-3xFLAG-ATG9A, beslenen koşullarda Golgi işaretleyici GM130 ile birlikte bulunur (Şekil 3A). Daha da önemlisi, bu lokalizasyon ve ATG9A veziküler kompartmanı zaman içinde korunur ve ATG9A kaçakçılığının uzay-zamansal çalışmasına izin verir (Şekil 3B).

Şekil 1: Endojen ATG9A lokalizasyonunun görüntü analizi. (A) Aktin hücre iskeletini (camgöbeği) görselleştirmek için endojen ATG9A (kırmızı), Golgi belirteci olarak GM130 (yeşil) ve Phalloidin'in temsili immünofloresan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Golgi bölgesinde lokalize olan endojen ATG9A fraksiyonunu belirlemek için görüntü analizinin iş akışı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Floresan etiketli ATG9A yapılarının lokalizasyon ve glikozilasyon ile analizi . (A) eGFP N-terminal etiketli ATG9A, Golgi'de daha az lokalizedir ve esas olarak veziküllerde bulunur. eGFP C-terminal etiketli ATG9A, hücre içinde agregalar sergiler (bazı örnekler beyaz ok uçlarıyla işaretlenmiştir; eGFP-ATG9A ve ATG9A-eGFP yeşil renktedir). mRFP N-terminal etiketli ATG9A, Golgi'de daha az lokalizedir ve öncelikle veziküllerde bulunur. N, hücre çekirdeğinin yaklaşık konumunu gösterir ve mRFP-ATG9A kırmızı renktedir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) Endojen ATG9A, western blot (ok uçları) ile analiz edildiğinde iki bant olarak görünür: bir üst bant (kompleks N-bağlı glikanlar) ve bir alt bant (olgun N-bağlı glikanlar yok). Sikloheksamit (CHX) ile tedavi, üst ve alt bantlar arasındaki oranı etkilemez. PNGase F ile tedavi, üst bandın kaybolmasına neden olur. (C) HEK293A hücrelerde mRFP etiketli ATG9A'nın geçici transfeksiyonundan sonra, batı lekesinde (ok uçları) iki belirgin bant görülebilir. PNGase F ile tedavi, üst bandın kaybolmasına neden olur. Transfeksiyondan sonra CHX ile tedavi, transfekte edilmiş ATG9A havuzu ER'den Golgi'ye kaçırılırken glikozilasyonun artmasına neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İmmünofloresan ve canlı görüntüleme ile mCherry-3xFLAG-ATG9A lokalizasyonunun analizi. (A) mCherry-3xFLAG-ATG9A'yı geçici olarak aşırı eksprese eden ve Golgi marker GM130 ile boyanan HEK293A hücrelerin immünofloresan deneyleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A kırmızı renktedir ve GM130 Golgi işareti yeşil renktedir. (B) mCherry-3xFLAG-ATG9A'yı geçici olarak aşırı eksprese eden HEK293A hücrelerinde yapılan canlı görüntüleme deneylerinden montaj. N, çekirdeğin yaklaşık konumunu gösterir. Zaman çerçevesi = 1 fps. Ölçek çubuğu = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A kırmızı renktedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S.A.T., Casma Therapeutics'in bilimsel danışma kurulunda görev yapmaktadır.