Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Membran taşıma proteinleri, hücreler arasındaki iletişimin yanı sıra hücresel homeostazı korumak için kritik öneme sahiptir. Membran taşıma proteinleri arasında iyon kanalları, hücrelerin büyümesini ve gelişmesini yönlendirmeye ve zorlu ve değişen ortamlarda hücrelerin durumunu korumaya hizmet eder. İyon kanallarının ayrıca hem sistemik olarak hem de merkezi sinir sisteminde (CNS) katı tümörlerin gelişimini yönlendirdiği ve desteklediği ^{bildirilmiştir1,2}. Örneğin, KCa3.1 kanalları, hücre döngüsü düzenlemesinde önemli olan membran potansiyelini düzenlemekten ve hücre hacmini kontrol etmekten sorumludur. Kusurlu KCa3.1 kanallarının tümör hücrelerinin^anormal proliferasyonuna katkıda bulunduğu bildirilmiştir 3. Ayrıca, iyon kanalları kanserlerin metastatik yayılımına katkıda bulunabilir. Örneğin geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları,^Ca2+ ve^Mg2+ akışında rol oynar; Bu akış, bir tümörü çevreleyen hücre dışı matrisi düzenleme işlevi gören birkaç kinaz ve ısı şoku proteinini aktive eder ve bu da kanser metastazını başlatmak için önemlidir⁴.

İyon kanalları kanserlerin gelişimine katkıda bulunabileceğinden, ilaca bağlı kanser tedavisi için de hedef olabilirler. Örneğin, kemoterapi ve yeni immünoterapi dahil olmak üzere tedavi yöntemlerine direnç, iyon kanalı fonksiyon düzensizliği ^5,6,7 ile ilişkilidir. Ek olarak, iyon kanalları, monoklonal antikorlar 1,2,8,9 dahil olmak üzere biyopolimerlerin yanı sıra yeniden tasarlanmış küçük moleküllü (FDA onaylı) ilaçların incelenmesiyle^, kanserlerin büyümesini ve gelişmesini engellemek için önemli ilaç hedefleri olarak ortaya çıkmaktadır. Bu cephede çok ilerleme kaydedilmiş olsa da, iyon kanalı kanseri ilaç keşfi az gelişmiş durumda. Bu kısmen, kanser hücrelerinde iyon kanallarını incelemenin benzersiz zorluklarından kaynaklanmaktadır. Örneğin, yavaş etkili bileşikler için elektrofizyoloji deneylerinin kurulmasında teknik sınırlamalar ve kanal aktivasyonu ve ilaç etkisinde zamansal farklılıklar vardır. Ayrıca, günümüzde yaygın olarak kullanılan otomatik elektrofizyoloji sistemlerinin çoğu, bileşik adsorpsiyonunun bir sonucu olarak artefaktlara katkıda bulunabilecek hidrofobik substratlar kullandığından, bileşiklerin çözünürlüğü de ilerlemeyi engelleyebilir. Ek olarak, doğal ürünler, peptitler ve monoklonal antikorlar gibi büyük biyoorganik moleküler terapötiklerin geleneksel elektrofizyoloji deneyleri kullanılarak taranması teknik olarak zordur¹⁰. Son olarak, kanser hücrelerinin biyoelektriksel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır¹¹.

Bu arada, iyon kanallarının immünofloresan boyaması genellikle zordur. Bu, kısmen, yapılarının karmaşıklığından ve mikroskopi çalışmaları için hem antikor üretme hem de kullanma yeteneğini etkileyen zardaki bağlamlarından kaynaklanmaktadır. İyon kanallarını boyamak için kullanılan antikorların özgüllük, afinite ve tekrarlanabilirlik açısından doğrulanması özellikle önemlidir. İyon kanalları için ticari antikorlar, doğrulama stratejilerine ve yayın kayıtlarına göre düşünülmelidir. Deneyler, hedef proteinin yıkılması veya nakavt edilmesiyle spesifik olmayan bağlanma eksikliğini göstermek için negatif kontroller içermelidir. Alternatif olarak, hedef proteinin bulunmadığı veya mRNA veya protein tayinlerine dayalı olarak düşük bollukta olduğu hücre hatları, negatif kontroller olarak işlev görebilir. Örneğin, bu çalışma (GABA) reseptör alt birimi Gabra5'in bir medulloblastoma hücre hattında (D283) lokalizasyonunu göstermektedir. Bir siRNA yıkımı olan D283 hücreleri ve başka bir serebellar medulloblastom hücre hattı olan Daoy hücreleri, Gabra5 için boyandı ve kayda değer bir boyama göstermedi (veriler gösterilmemiştir).

Burada, iyon kanalı fonksiyonunun yanı sıra iyon kanalı modülatörlerinin kanser hücreleri üzerindeki etkisini analiz etmek ve analiz etmek için yöntemler sunulmaktadır. (1) bir iyon kanalı için boyama hücreleri, (2) mitokondrinin polarize durumunun test edilmesi, (3) elektrofizyoloji kullanılarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulması ve (4) in vitro ilaç validasyonu için protokoller sağlanmıştır. Bu protokoller, A tipi gama-aminobütirik asit (GABA_A) reseptörü 2,12,13,14,15,16^, bir klorür anyon kanalı ve majör inhibitör nörotransmitter reseptörü ile ilgili çalışmaları vurgulamaktadır. Bununla birlikte, burada sunulan yöntemler, diğer birçok kanser hücresini ve iyon kanalını incelemek için geçerlidir.

1. Kültürlenmiş hücrelerde immüno-etiketleme iyon kanalları

1. Hücrelerin hazırlanması ve deney düzeneği
   1. Hücreleri 75^cm2'lik kültür şişelerinde aktif olarak büyüyen bir kültür olarak muhafaza edin. Kullanılan hücre hattının iki katına çıkma süresine bağlı olarak, hücreleri% 50 -% 90 birleşene kadar bir kez geçirin.
      NOT: Bu çalışmada Grup 3 medulloblastoma hücre hattı olan D283 hücreleri kullanıldı.
   2. Hücreleri kültür şişesinden bir santrifüj tüpüne (15 mL veya 50 mL) toplayın ve yapışkan hücreleri ayırmak için 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. 5 dakika sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye üç ila beş kez dokunun. Tripsinin etkisini durdurmak için hücreleri% 10 FBS ile 10 mL ortamda toplayın.
   3. RT'de 5 dakika boyunca 480 x g'da santrifüjleyin. Ortamı nazikçe aspire edin. Hücre peletini rahatsız etmeyin.
   4. Kültürün yoğunluğuna bağlı olarak hücreleri 5 mL ila 10 mL ortamda yeniden süspanse edin.
      NOT: Yoğunluk, aktif olarak büyüyen hücrelerle tutarlı olmalıdır ve şişedeki hücrelerin birleşmesine bağlıdır. Optimal hücre yoğunluğunu tahmin etmek için görsel değerlendirme kullanılmalıdır; Spesifik olarak, hücreler %40-90 arasında birleşik ve eşit olarak dağılmış olmalıdır.
   5. 100 μL hücreyi çıkarın ve cansız hücreleri işaretlemek için 100 μL% 0.4 tripan mavisi içeren 1.5 mL'lik bir tüpe ekleyin. Hücre hattına bağlı olarak RT'de 5-15 dakika inkübe edin.
   6. Hücreleri 10 μL çözelti içinde bir hemositometre kullanarak manuel olarak sayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hemositometrenin 16 karesinin dört köşesinin her birindeki canlı, boyanmamış hücreleri sayın. Ortalama hücre sayısını seyreltme faktörü ile ve mililitre başına hücre (hücre/mL) vermek için 10.000 ile çarpın. Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayacı kullanılabilir.
   7. Hücreleri, her hücre hattı için belirtilen kültür ortamına 1 x 10⁵ hücre / mL'ye seyreltin. Tohum 1. Üreticinin talimatlarına göre 0,1 mg/mL poli-D-lizin ile önceden kaplanmış 22 mm x 22 mm'lik bir lamel içeren 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 8 mL hücre (bkz.
      NOT: Hücre hattına özgü tercihlerin^17,18 raporları olduğundan^, hem poli-D-Lizin hem de poli-L-Lizin kullanımını test etmek isteyebilirsiniz. Bazı hücre hatları, poli-L-lizini parçalayabilen proteazlara sahipken, poli-D-lizinin bazı hücre hatları için toksik olduğuna dair raporlar vardır. Buna karşılık, PC12 gibi nöronal hücrelerin poli-D-lizin yüzeylerinde daha sağlıklı olduğu bildirilmiştir.
   8. Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO₂ ortamına sahip bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de büyütün. Hücrelerin bağlanmasını ters çevrilmiş bir mikroskop altında 20x objektifle inceleyin.
      NOT: Hücreler, tedaviden veya doğrudan immün boyamadan önce lamel üzerine tam olarak bağlanmalıdır. Bu zamanda, hücreler ya konsantre bir stok ilavesiyle (örneğin, 600 μL 4x stok çözeltisi) ya da ortamın istenen 1x konsantrasyonda ilacı içeren taze ortamla değiştirilmesiyle ilaçlarla (veya araç kontrolüyle) tedavi edilebilir; Hücreler daha sonra 48 saate kadar inkübatöre geri döndürülebilir. İlacın hedef molekülün seviyesi ve lokalizasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için çözücü ile muamele edilmiş hücreler dahil edilir. Bu çalışmada, D283 hücreleri, 48 saat boyunca 600 μL 3.2 μM GABA_A reseptörü pozitif allosterik modülatör, QH-II-066¹⁴ (Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi ile muamele edildi. Kontrol hücreleri, eşdeğer hacimde DMSO ile muamele edildi.
2. İmmün etiketleme için hazırlık: Fiksasyon, geçirgenleştirme ve bloke etme
   1. Hücreleri 2.5 mL 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO 4, 2 mM KH₂PO₄, Malzeme Tablosuna bakınız) ile durulayın ve hemen çözeltiyi aspire edin.
   2. RT'de 1 saat boyunca 1x PBS'de 1 mL% 4 PFA kullanarak hücreleri sabitleyin.
      NOT: %4 PFA, immünoboyama için standart fiksatif iken, immünofloresan için membran proteinlerini sabitlemek için glutaraldehit veya glioksal da kullanılabilir. Buz gibi soğuk metanol ile yapılan tedaviler gibi alkol bazlı fiksasyon yöntemleri, daha az iyi korunmuş morfolojiye ve membran proteinlerinin kaybına^{yol açabilir 19,20}.
   3. Bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak 2.0 mL 1x PBS (yıkama başına 5 dakika) ile altı kez yıkayın. Primer antikorun konakçı türüne uyan% 0.8 Triton X-100 ve% 10 normal serum ile 1x PBS'den oluşan bir bloke edici tamponda RT'de 1 saat inkübe edin (alternatif olarak,% 3 BSA veya sığır serum fraksiyonu V albümini normal serum yerine kullanılabilir).
      NOT: Bu adım, belirli olmayan bağlamayı engellemek için kullanılır.
3. İmmün etiketleme
   NOT: Floroforlara konjuge edilen antikorları ekledikten sonra, foto ağartmayı önlemek için ölçümler kısa sürede yapılmalıdır. Konjuge antikorlarla inkübasyonların ışıktan korunması gerekir. Serbest radikalleri temizleyen ajanlar içeren bir montaj ortamının kullanılması, foto ağartmayı azaltacaktır. Lamelleri kapattıktan sonra slaytları hafif sızdırmaz, opak bir kapta (4 °C'de) saklayın. Görüntüleme sırasında, uyarma aydınlatmasının yoğunluğu ve maruz kalma süreleri sınırlandırılarak foto ağartma en aza indirilebilir.
   1. 150 mm'lik bir kültür kabının tabanını filtre kağıdı ile kaplayarak nemlendirilmiş bir oda hazırlayın. Filtre kağıdını steril damıtılmış suyla nemlendirin. Filtre kağıdının üstüne sığacak şekilde kesilmiş bir laboratuvar filmi parçasına 3 x 2'lik bir ızgara çizin ve 6 oyuklu plakadaki lamellerin yönünü korumak için etiketleyin. Laboratuvar filmini, hazneyi nemlendirmek için üst ve alt kenarları açığa çıkaracak şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirin.
   2. % 3 BSA ile 1x PBS'de primer antikorun istenen seyreltilmesinin lamel başına 100 μL hazırlayın. GABRA gen protein ürününü tespit etmek için, 1:200 seyreltmede tavşan rekombinant monoklonal primer antikor kullanın (Gabra5 antikoru, orta bölge; Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Arka plan üzerinde optimal sinyali üreten birincil antikor konsantrasyonunu ampirik olarak belirlemek için, ikincil konsantrasyonu sabit tutarken birincil antikorun bir seyreltme serisini kullanın. Optimal primer antikor konsantrasyonları oluşturmak için 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 ve 1:1.000 dilüsyonları önerilir.
   3. Lameli 6 oyuklu plakadaki blok çözeltisinden laboratuvar filmi üzerine çizilen ızgara üzerinde uygun yere aktarın. Blok çözeltiyi 6 oyuklu plakadan atın ve yıkama adımları için plakayı saklayın.
   4. Her lamel ortasına dikkatlice 100 μL seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Çözeltiyi lamel kenarına yerleştirmekten kaçının. RT'de 1 saat inkübe edin.
   5. 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 2,5 mL 1x PBS ekleyin. Lameli 6 oyuklu plakadaki uygun yere geri aktarın.
   6. Her biri 2,5 mL 1x PBS ile 5 dakika boyunca altı yıkama yapın.
      NOT: Durulama adımları sırasında lamellerin kurumasına izin vermeyin, çünkü bu arka plan floresan sinyaline katkıda bulunabilir.
   7. Lamelleri laboratuvar filmi üzerinde uygun yere geri koyun. Her lamel için, 1x PBS +% 1 -% 5 BSA ile seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor ekleyin.
      NOT: Başlangıçta, Alexa Fluor 488'e konjuge edilen ikincil antikorlar ( Malzeme Tablosuna bakınız), 1x PBS +% 3 BSA'da 1: 1.000 seyreltmede kullanılır. İkincil antikor konsantrasyonu, düşük bolluktaki hedef proteinleri tespit etmek için konsantrasyonu artırarak veya gerekirse arka planı azaltmak için konsantrasyonu azaltarak optimize edilebilir.
   8. Kalan adımlar için, konjuge sekonder antikorun foto-ağartılmasını önlemek için ışığa maruz kalmayı en aza indirin. Kültür kabını alüminyum folyo ile örtün ve RT'de 1 saat inkübe edin.
   9. Lamelleri 6 oyuklu plakaya geri aktarın. Bir çalkalayıcı kullanarak, her biri 2,5 mL 1x PBS ile 5 dakika boyunca altı yıkama yapın. Plakayı lavabonun veya bir atık kabının üzerine ters çevirerek PBS'yi çıkarın. Son yıkamadan sonra, lamellerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için PBS'yi kuyuda bırakın.
   10. Her lamel için bir mikroskop lamı etiketleyin. Slaydın ortasına DAPI (çekirdekleri boyamak için) ( Malzeme Tablosuna bakın) ile bir damla gliserol içeren montaj ortamı ekleyin.
   11. Forseps kullanarak, lameli kuyudan çıkarın ve yavaşça sürgünün ortasındaki montaj ortamının üzerine yerleştirin.
       NOT: Montaj ortamında hava kabarcığı oluşmasını önleyin.
   12. Fazla montaj ortamını çıkarmak için küçük filtre kağıdı parçaları kullanın. Lamelin kenarlarını oje ile kapatın ve görüntülemeden önce cilanın tamamen kurumasını bekleyin. Cam slaytları 4 °C'de opak plastik bir kutuda saklayın.
4. Görüntüleme ve analiz
   1. Daldırma yağı ile 40x objektif altında bir floresan mikroskobu ile görüntüler elde edin (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Floresan görüntüleri uygun filtrelerle görselleştirin.
   3. NOT: Alexa Fluor 488 için 496 nm/519 nm'lik bir uyarma/emisyon kullanın; DAPI için 358 nm/461 nm'lik bir uyarma/emisyon kullanın.
   4. Dijital görüntü dosyalarını yakalayın ve kaydedin. Görüntü toplama oranlarını kolaylaştırmak ve arka planı azaltmak için 4 x 4'lük bir gruplama değeri kullanılır.
   5. Son görüntüleri hazırlayın. Görüntüler ImageJ veya piyasada bulunan yazılımlarla işlenebilir. Sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir.

2. Mitokondrinin polarize durumunun test edilmesi

NOT: Bu protokol, aktif mitokondrideki membran potansiyelini etiketlemek için TMRE (tetrametilrodamin, etil ester) testini kullanır ve negatif yükü^21,22 korur. TMRE, nispi negatif yükleri nedeniyle aktif mitokondride biriken hücre geçirgen, kırmızı-turuncu, pozitif yüklü bir boyadır. İnaktif veya depolarize mitokondri, membran potansiyelini azaltır ve orantılı olarak TMRE'yi tutamaz. Oksidatif fosforilasyonun (OXPHOS) bir iyonofor bağlayıcısı olan FCCP (karbonil siyanür 4-[triflorometoksi] fenilhidrazon), mitokondriyal zarları depolarize eder, böylece TMRE^23'ün birikmesini ve sekestrasyonunu önler. Bu, Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Hücrelerin hazırlanması ve deney düzeneği
   1. Hücreleri 75^cm2'lik kültür şişelerinde muhafaza edin. Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS ile durulayın.
   2. Yapışkan hücreleri ayırmak için 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. RT'de 5 dakika inkübe edin ve hücreleri 10 mL ortamda yeniden süspanse edin.
   3. Hücreleri kültür şişesinden 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. RT'de 5 dakika boyunca 480 x g'da santrifüjleyin.
   4. Kültürün orijinal birleşmesine bağlı olarak hücreleri 5 mL ila 10 mL ortamda yeniden süspanse edin, böylece hücre konsantrasyonu hemositometrede kare başına 50-100 hücre olur. Doğru sayım için gerekli hücre yoğunluğunu sağlamak için gerekirse ses seviyesini ayarlayın.
   5. 100 μL hücreyi çıkarın ve 100 μL% 0.4 tripan mavisi içeren 1.5 mL'lik bir tüpe ekleyin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri, fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamında 3 x 10⁴ hücre / mL'ye seyreltin.
      NOT: Fenol kırmızısı içermeyen DMEM ortamı kullanılır, çünkü fenol kırmızısına maruz kalma membran geçirgenliğini engeller ve arka plan otofloresansına katkıda bulunabilir.
   6. Üreticinin talimatlarına göre poli-D-lizin ile önceden kaplanmış 22 x 22 mm'lik bir lamel içeren 6 oyuklu bir plakaya oyuk başına 2.5 mL hücre süspansiyonu (22.000 hücre) tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   7. Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için hücreleri gece boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO₂ içeren bir inkübatörde büyütün.
   8. Hücrelerin bağlanmasını ters çevrilmiş bir mikroskop altında 20x objektifle inceleyin. Daha fazla ilerlemeden önce hücreler lamele tam olarak takılmalıdır.
2. Stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. 1 mM stok çözeltisi (1.000x) TMRE (MW = 514.96 g/mol) hazırlamak için ( Malzeme Tablosuna bakınız), 1 mg TMRE'yi 1.94 mL DMSO içinde çözün. Alın ve −20 °C'de ışıktan korunarak saklayın. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.
   2. 50 mM (2.500x) FCCP (MW = 254.17 g / mol) (mitokondriyal oksidatif fosforilasyon birleştirici) stok çözeltisi hazırlamak için, 786.9 μL DMSO içinde 10 mg FCCP'yi çözün. Alın ve −20 °C'de ışıktan korunarak saklayın. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.
   3. NOT: Hazırlanan stok çözeltileri, TMRE Mitokondriyal Membran Potansiyel Test Kitinin bir parçasıdır (Malzeme Tablosuna bakın).
3. Hücre hatları için TMRE konsantrasyonunun oluşturulması
   1. Hücre kültürü ortamında 500 nM çalışan bir TMRE çözeltisi hazırlayın. Çalışma solüsyonunu ışıktan koruyun.
   2. 50-200 nM arasında orta ila nihai konsantrasyon aralığında lameller üzerinde büyütülen hücrelere TMRE ekleyin. Bunu, önce kültür ortamını aspire ederek ve onu TMRE içeren kültür ortamıyla değiştirerek yapın.
   3. 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. Hücreler canlı olarak görüntülendiğinden, görüntülemeye izin vermek için tedavi sürelerini kademelendirdiğinizden emin olun.
   4. Hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın ve son TMRE konsantrasyonu ile etiketlenmiş bir mikroskop lamı üzerindeki lamel ters çevirin.
   5. Canlı hücreleri hemen görüntüleyin (tepe E_x / E_m = 549 nm / 575 nm).
      NOT: Hücreler ortamdan çıkarıldıktan ve bir mikroskop lamına yerleştirildikten sonra mitokondriyal sağlık tehlikeye girdiğinden, kültür koşullarından çıkarıldıktan sonra numuneleri hemen görüntüleyin. Lamellere alternatif olarak, hücreler cam tabanlı tabaklarda görüntülenebilir.
   6. Mevcut mikroskop ve yazılımı kullanarak görüntüleri yakalayın.
      NOT: TMRE konsantrasyon optimizasyonu işlemi sırasında deneysel mikroskopi görüntüleme parametreleri oluşturun ve doğru veri karşılaştırmasını sağlamak için sonraki deneylerde aynı koşulları koruyun. Ayrıntılı protokol, konfokal bir mikroskop ve uyumlu bir yazılım kullandı (Malzeme Tablosuna bakınız).
   7. Hücre hattına bağlı olan optimum TMRE konsantrasyonunu seçin.
      NOT: Mitokondriyal TMRE seviyelerindeki değişiklikleri çözmek için en iyi sinyali sağlayan TMRE konsantrasyonu, genellikle en düşük TMRE konsantrasyonudur ve eşit ve kolayca tespit edilebilir bir floresan sinyali verir.
4. Bir hücrenin polarize durumunu test etme
   1. Tahlil hazırlığı
      1. Arıtma stoğu çözeltilerini istenen konsantrasyonlarda hazırlayın ve analiz edilecek nihai bileşik konsantrasyonuna sahip ortamı hazırlayın. FCCP için stok çözeltisi 20 mM olmalıdır (50 mM stok çözeltisinden DMSO ile hazırlanır).
      2. Bir seferde tek bir lamel üzerinde çalışarak, hücrelere 1.8 mL ortam artı test bileşiği ekleyin.
      3. Hücreleri, test bileşiği ile 37 °C ve% 5 CO₂ sıcaklıkta nemlendirilmiş bir ortamda istenen süre boyunca inkübe edin.
         NOT: Tedavi süreleri, test bileşiğinin mitokondriyal membran potansiyelini değiştirebileceği mekanizmaya bağlı olarak değişecektir. Mitokondriyal membran potansiyellerini hızlı ve doğrudan depolarize eden FCCP gibi güçlü protonoforlar, tedaviden kısa bir süre sonra (dakikalar içinde) analiz gerektirir. Buna karşılık, protein aktivasyonunu veya protein döngüsünü değiştiren veya protein sentezi gerektirenler gibi mitokondriyal elektron taşıma zinciri fonksiyonunu dolaylı olarak etkileyen bileşiklerle tedavi etkilerinin bir etki göstermesi daha uzun sürebilir.
      4. İnkübasyon sırasında mikroskobu açın ve kazanç, lazer yoğunluğu, görüntü yakalama hızı, ortalama alma ve maruz kalma süresi dahil olmak üzere önceden belirlenmiş optimum görüntüleme parametrelerine ayarlayın.
      5. İlaç tedavisi süresinden sonra, kontrol ve ilaçla tedavi edilen hücrelere 200 μL 10x TMRE (yukarıda belirlenen optimal konsantrasyon) ekleyin.
      6. Nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de 15-30 dakika inkübe edin. Ortamı nazikçe aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile bir kez durulayın.
      7. Hücre kültürü ortamının veya tedavi bileşiklerinin neden olduğu arka planı önlemek için 1x PBS durulama adımını tekrarlayın ve lameli tedavi koşullarıyla etiketlenmiş bir mikroskop lamı üzerinde ters çevirin.
      8. Hücrelerin E_x/E_m = 549 nm/575 nm'de yaşadığını hayal edin. Konfokal bir mikroskop kullanarak, hücre bütünlüğü kaybolmadan önce yüksek hızlı görüntü yakalama (512 piksel x 512 piksel, ortalama = 4) ile birkaç z-yığını alanı toplayın.
      9. Görüntü dosyasını analiz için kaydedin ve saklayın. Bir sonraki deney koşulu için prosedür tekrarlanır.
   2. Deneysel kontroller
      1. Yukarıda belirtildiği gibi (adım 3.1.1-3.1.8) gerçekleştirilen ve ortamda test bileşiği bulunmayan, işlem görmeyen (negatif) bir kontrol kullanın.
      2. Protonofor bileşiği FCCP'den oluşan bir mitokondriyal membran potansiyel bozulma (pozitif) kontrolü kullanın. Hücrelere ortamda 1.8 mL 20 μM FCCP ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.1.1-3.1.2; ve adım 3.1.3-3.1.8'de belirtildiği gibi hücre görüntüleme), TMRE ile boyamadan önce nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
         NOT: Bu deneyler için hem pozitif hem de negatif kontroller gereklidir.
   3. Miktar
      1. Her bir z yığınının merkezi bölgesinden tek bir temsili görüntüden tek tek hücrelerin yakalanan piksel yoğunluklarını ölçün. Bu çalışmada, analizi kolaylaştırmak için tek bir odak düzlemi seçilmiştir.
      2. Tedavi başına en az 30 hücreden (tamamıyla) piksel yoğunluklarını analiz edin. Her tedavi için piksel yoğunluklarının ortalamasını almak için Excel veya Prizma kullanın ve ortalamanın standart hatasıyla çubuk grafik biçiminde sunun.
         NOT: ImageJ, floresan ölçümü için de kullanılabilir. Alternatif olarak, TMRE boyama floresansı ticari yazılım platformları ile ölçülebilir.

3. Elektrofizyoloji kullanarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulması

NOT: Bu bölümdeki prosedür, bir kanser hücre hattındaki test bileşiklerini taramak için otomatik bir elektrofizyoloji testinin kullanımını açıklar (Şekil 3).

1. Hücrelerin hazırlanması
   1. Ölü hücrelerden ve/veya aşırı hücre büyümesinden yoksun sağlıklı bir kültürden hücre toplayın. Yapışık ve kümelenmiş hücreleri toplamak için kimyasal hücre ayırma solüsyonu TrypLE veya manuel hücre kazıyıcı kullanın. Özellikle CNS kanser hücreleri arasında yaygın olan kümeler veya küreler halinde büyüyen hücreleri ayrıştırın.
      NOT: Hücrelerin nazikçe ayrışması, iyon iletkenliği için gerekli olan zar proteinlerinin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur.
   2. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 561 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti DMEM (fenol kırmızısı olmadan), HEPES ve penisilin / streptomisin içinde% 20 FBS ve 4 mM L-glutamin ile süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de tutuldu.
      NOT: Fenol kırmızısı içermeyen DMEM ortamı kullanılır, çünkü fenol kırmızısına maruz kalma membran geçirgenliğini engeller.
   3. Hücreleri düşük yoğunlukta poli-L-lizin kaplı bir lamel üzerine yerleştirin, böylece tek hücreler arasında ayrım olur.
      NOT: Poli-L-lizin daha iyi kaplama özelliklerine sahip olduğundan, burada poli-D-lizin değil, poli-L-lizin kullanılır.
   4. Kayıt almadan önce hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir odada₁₂ saat ila 24 saat (optimum sürenin belirlenmesi gerekecektir) inkübe edin.
2. Elektrofizyoloji kaydı
   1. Ortamı lamellerden çıkarın. Hücreleri 1x PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. ~300 μL TrypLE çözeltisi ekleyin. Pipeti kullanarak, hücreler ayrılana kadar dört ila beş kez hafifçe yukarı/aşağı pipetleyin.
   2. Serumsuz ortam (DMEM) (fenol kırmızısı içermeyen) ekleyin ve hacim başına en az 1 milyon hücre / mL'lik bir son hücre sayısını koruyun. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre kümelerinden yoksun bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri düzenleyin.
   3. Hücre süspansiyonunu 1 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre zarını stabilize etmek için hücreleri 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. Hücre kümelerinin oluşumunu önlemek için hücrelerin bir çalkalayıcı üzerinde dönmesini sağlayın (yumuşak döngü).
   4. Port-a-Patch kurulumunu hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Bilgisayarı, amplifikatörü ve perfüzyon sistemini açın. Patch-Master yazılımını açın ve yeni bir dosya oluşturun.
   5. Tamponları (hücre dışı ve dahili) RT'ye getirin ve ardından tamponları ilgili perfüzyon tüplerine yükleyin.
      NOT: GABA_A reseptörünün kayıtları, hem 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES ve 6 mM D-glikoz içeren bir "hücre dışı (banyo) çözelti" gerektirir (pH, NaOH kullanılarak 7.4'e ayarlanır) ve 120 mM KCl, 2 mM MgCl ₂, 10 mM EGTA içeren bir "dahili çözelti", ve 10 mM HEPES (pH, NaOH kullanılarak 7.2'ye ayarlanır).
   6. Bir elektrot çipinin (üretici tarafından sağlanan) altını 5 μL dahili çözelti ile doldurun ve elektrot çipini Port-a-Patch'in Faraday üstüne yerleştirin. Çipe 10 μL harici çözelti ekleyin ve Patch-Master yazılımını kullanarak osiloskop üzerindeki dikdörtgen darbeyi gözlemleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Direnç 2-3 MΩ aralığında olabilir, ancak bu hücre hattına bağlıdır.
   7. Dikdörtgen darbe göründüğünde, ilk elektronik ayarlamalardan sonra ve yazılım kullanıcıdan hücre eklemesini istedikten sonra kayda başlayın.
   8. Elektrotun orta kısmına yavaşça 20 μL tek hücreli süspansiyon ekleyin ve yazılımdaki direnç değerlerini gözlemleyerek hücre yamasını ve ardından bir Giga-Ohm contasını bekleyin.
   9. Hücre yamasının canlı ilerlemesi, yazılımın sol sütununda gözlemlenebilir. Hücre "tam hücre modunda tutulduğunda", yazılım içinde bir protokol açarak kayıtlara başlayın.
   10. Tutma potansiyelini −80 mV olarak ayarlayın. Hücreden gelen akımı kaydetmek için Patch-Master yazılımını kullanarak boşluksuz bir sürekli kayıt protokolü çalıştırın.
   11. Kararlı bir taban çizgisi elde edin ve yazılımın sol panelindeki otomatik perfüzyon sekmesini kullanarak belirli bir süre boyunca bir ligand ve ilgili bileşik uygulamasına geçin.
   12. Patch-Master yazılımını kullanarak veri elde edin.
       NOT: Veriler 1 kHz'de düşük geçişli filtrelenir ve 100 kHz'de dijitalleştirilir.
   13. Nest-o-Patch yazılımını kullanarak mevcut yanıtın maksimum genliğini hesaplayarak veri analizi gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).

4. İn vitro etki

NOT: Bu prosedür, ilaç gücünü belirlemek için bir MTS testini detaylandırır. Tek Çözeltili Hücre Proliferasyon Testi, gerekli tüm tahlil reaktiflerini, deneysel bileşiklerle işlemden sonra hücre canlılığını ve proliferasyonunu değerlendirmek için hücre kültürü kuyularına tek adımda eklenebilen hazırlanmış bir çözeltide birleştirir. Reaktif, üreticinin tavsiyelerine göre sulandırılır ( Malzeme Tablosuna bakın), alıntılanır ve -20 °C'de saklanır. Bu bölüm, belirli bir hücre hattındaki test bileşiklerinin IC_50'sini belirlemek için tahlilin kullanımını açıklar (Şekil 4). Bu MTS reaktifi, bilinen konsantrasyonlarda çok sayıda bileşiğin yüksek verimli taraması için de kullanılabilir.

1. Hücrelerin hazırlanması
   NOT: Hücre sayısı, her bir hücre hattının büyümesine ve metabolizmasına bağlıdır. Herhangi bir araştırma tedavisini değerlendirmek için testi kullanmadan önce deneysel olarak optimal hücre sayısını belirleyin.
   1. Tripsinizasyon yoluyla kültürden yapışan hücreleri toplayın ve kümeler veya küreler halinde büyüyen hücreleri ayırmak için Accutase ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
      NOT: Glioblastoma ve primer medulloblastoma hücre hatları, kümeler veya küreler halinde büyüme eğiliminde olduklarından genellikle Accutase gerektirir.
   2. Hücreleri sayın ve 75 μL'lik bir hacimde oyuk başına 10.000 hücre içeren bir hücre çözeltisi yapın. Test edilecek hücre numaraları için stoğun seyreltilmesini yapın. Seyreltme başına en az 1 mL hazırlayın.
   3. Her seyreltmenin 75 μL'sini 96 oyuklu bir plakada ardışık beş kuyucuktan oluşan setler halinde plakalayın. Nemlendirilmiş bir ortamda (yani bir inkübatörde) gece boyunca 37 °C ve %5_CO2'de inkübe edin.
      NOT: Yavaş büyüme veya metabolizmaya sahip hücre hatları (büyüme ortamlarını 3 günden fazla asitleştiren), üst hücre sayısı aralığı olarak 10.000'den fazla hücre gerektirebilirken, hızla büyüyen hücre hatları (genellikle 20 saatten daha hızlı) iki katına çıkma süresi) daha az hücre gerektirir. Yüksek metabolizmaya sahip hücre hatları, kuyu başına 1.000'den az hücre gerektirebilir. Hücre aralığı, bu hücre hatları için MTS testi için en uygun kaplama yoğunluğunu belirlemek üzere ayarlanabilir.
2. Sahte tedavi kontrolü
   1. MTS tahlilinde test bileşiğinin eklenmesini simüle etmek için oyuk başına 25 μL ortam ekleyin.
      NOT: Gerçek MTS tahlilinde, test bileşiği için seçilen tedavi konsantrasyonunun 25 μL'lik bir 4x stoğu (burada bir GABA_A reseptör modülatörü, QH-II-066), oyuk başına toplam 100 μL hacimde 1x nihai tedavi konsantrasyonunu vermek için hücrelere eklenecektir.
   2. 37 °C ve %5_CO2'de nemlendirilmiş bir ortamda 48 saat inkübe edin. Bu, bir ilacın varlığında standart inkübasyonu simüle eder.
3. MTS testi
   1. MTS reaktifinin gerekli alikotlarını çözün. Oyuk başına 20 μL MTS reaktifi ekleyin. 37 °C ve %5_CO2'de nemlendirilmiş bir ortamda 1 saat inkübe edin.
   2. Absorbans okumasını engelleyebilecek kabarcıkları çıkarmak için plakayı (5 dakika boyunca 1.350 x g ) oda sıcaklığında santrifüjleyin.
      NOT: İnce bir iğne ile kabarcıkları çıkarın.
   3. 490 nm'de absorbansı okuyun. Verileri bir Excel dosyası olarak kaydedin.
   4. Plakaları %5 CO_2'de 37 ° C'ye getirin ve testin 4 saatlik doğrusal aralık süresi içinde tekrar tekrar okuyun.
      NOT: Absorbansı okumadan önce yeniden santrifüjlemeye gerek yoktur. Daha sonraki okumalardan, özellikle 2 saatlik okumadan elde edilen veriler, bir hücre hattının MTS reaktifini ne kadar hızlı metabolize ettiğini incelemek için önemli olabilir ve tahlil için plakaya hücre sayısının seçilmesinde yararlıdır.
   5. Absorbans optik yoğunluğunu (OD) 490 nm'de (OD₄₉₀) Excel veya Prizma kullanarak kaplanmış hücre numarasına göre çizin.
   6. Tahlil için hücre numarasını seçin. Optimum hücre sayısı doğrusal aralıkta ve doygunluğun altında olacaktır (OD₄₉₀ = 1).
      NOT: Yavaş büyüyen hücreler için, kaplanan en yüksek hücre sayısı oyuk başına 20.000 hücreye ayarlanabilir ve oyuk başına 500 hücre tahlil dışında bırakılabilir.
4. IC'nin belirlenmesi₅₀
   1. 1. Gün: MTS tahlili için hücreleri plakalayın
      1. Etütteki her satırın hücre satırı adını ve geçiş numarasını kaydedin. Tahlil sırasında buharlaşmaya karşı koymak için, en azından, tahlil sırasında buharlaşmaya karşı koymak için 96 oyuklu plakanın dış çevre üst ve alt sıralarını ve uç sol ve sağ çevre sütunlarını kuyu başına 1x PBS, 100 μL ile doldurun.
      2. Testin başlamasından önce belirlenen her hücre hattı için en uygun hücre sayısını plakalayın. Hücreleri, HEPES tamponu içermeyen fenol kırmızısı içermeyen, antibiyotik içermeyen ortam başına 75 μL'de kaplayın. Hücre hatlarının büyümesini desteklemek için FBS% 20'ye yükseltilebilir.
         NOT: Fenol kırmızısına maruz kalma membran geçirgenliğini engellediği için orta eksik fenol kırmızısı kullanılır.
      3. Tedavi konsantrasyonu için numuneyi en az beş kopya halinde plakalayın. Manuel veya otomatik bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
         NOT: Manuel bir hemositometre kullanmak için, (1) tripan mavisi içinde ortamda yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 1:1 seyreltmesini hazırlayın; (2) hücre hattına bağlı olarak 5-15 dakika inkübe edin; (3) tripan mavisindeki hücrelerin 10 μL'sini hemositometre sayım odasına yükleyin; (4) dört köşedeki ve orta karelerdeki canlı hücreleri sayın ve kare başına ortalama hücre sayısını belirleyin; (5) Mililitre başına canlı hücreleri aşağıdaki gibi hesaplayın:
         mL başına canlı hücreler = Ortalama canlı hücreler × 2 (seyreltme faktörü) × 10⁴
      4. HEPES tamponu içermeyen fenol kırmızısı içermeyen, antibiyotik içermeyen ortamda istenen hücre konsantrasyonunu hazırlamak için yeterli bir hacim kullanın (yani, kuyu başına 75 μL x plaka başına 60 kuyu = plaka başına 4.5 mL hücre).
         NOT: Her plakanın arka plan çıkarma işlemi için yalnızca orta kontrole sahip olması gerekir. Ortam kontrolü, gerekirse PBS kuyularını değiştirebilir.
   2. 2. Gün: Tedavi bileşiğinin eklenmesi
      1. 75 μL ortamda (= oyuk başına toplam 100 μL hacim) kaplanmış hücrelere 25 μL tedavi solüsyonu eklendiğinde istenen nihai konsantrasyonu vermek için istenen nihai konsantrasyonun 4 katında deney işlemlerini hazırlayın.
      2. Test çözeltilerini (bu durumda, GABA_A reseptör modülatörü QH-II-066) en yüksek konsantrasyonlu stokların seri seyreltilmesiyle hazırlayın. Örneğin, nihai ilaç konsantrasyonları 5.0 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM ve 0.3125 μM olacaksa, sırasıyla 10 μM, 5 μM, 2.5 μM ve 1.25 μM konsantrasyonları elde etmek için 20 μM ile başlayan 1:1 seri seyreltmeler hazırlayın.
         NOT: Her plaka, yalnızca ortam kontrolüne ek olarak iki hücre tabanlı kontrol gerektirir: işlenmemiş hücreler (tek başına ortam) ve bilinen bir konsantrasyonda çözücü ile işlenmiş hücreler (genellikle DMSO). Aracın, bileşiğin aktif aralığında hücre proliferasyonunu etkilememesini sağlamak iyi bir uygulamadır.
      3. Test bileşiği eklendikten sonra, hücreleri 37 °C ve %5_CO2'de nemlendirilmiş bir ortamda 48 saat inkübe edin.
   3. 3. Gün: Hücre proliferasyon testinin (MTS) gerçekleştirilmesi
      1. İhtiyaç duyulan MTS reaktifinin hacmini hesaplayın (100 μL test kültürü başına 20 μL) ve gerekli miktarda alıntılanmış MTS reaktifini çözün (Malzeme Tablosuna bakın).
      2. Vorteks yapın ve kullanmadan önce reaktifin tamamen çözelti içinde olduğundan emin olun. Çözülmüş reaktifi steril bir 25 mL reaktif haznesine pipetleyin.
      3. 100 μL kültür ortamında numuneler içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 20 μL MTS reaktifi (çok kanallı bir pipet kullanarak) pipetleyin.
      4. Plakayı 37 °C ve %5_CO2'de nemlendirilmiş bir ortamda 1 saat ila 4 saat inkübe edin. Plakalar birden fazla zaman noktasında okunabilir. Genellikle plakalar 1 saatte ve 2 saat veya 3 saatte okunur.
      5. Ortamdaki kabarcıklar hatalı sonuçlara yol açabilir. Plaka okuyucuda okumadan önce, plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.350 x g'da döndürün. Santrifüjlemeden sonra kalan kabarcıkları çıkarmak için bir iğne veya pipet ucu kullanılabilir.
      6. Uygun bir mikroplaka okuyucu veya spektrofotometre kullanarak 490 nm'de absorbansı ölçün (Malzeme Tablosuna bakın).
      7. Verileri bir Excel dosyası olarak kaydedin.
         NOT: Test bileşiğinin varlığında inkübasyon süresi, test edilen bileşiğe ek olarak, metabolizma hızına ve incelenen hücre hattının büyümesine bağlı olarak değişecektir. 48 saatlik bir inkübasyon süresi, çoğu hücre hattı ve test bileşiği için iyi bir başlangıç noktasıdır.
5. Veri analizi
   1. Verileri bir Excel dosyasına aktarın ve test bileşiği konsantrasyonunu artırarak her çoğaltma için verileri düzenleyin. Yalnızca orta düzeydeki kontrol değerinin ortalamasını alın ve bu değeri deneysel verilerden çıkarın.
   2. Kontrolü her kopya için %100 proliferasyona ayarlayarak araç kuyularına (veya solventle işlenmiş kontrol kuyularına) kıyasla arıtma kuyularındaki hücre proliferasyon yüzdesini belirleyin.
   3. Excel'de oluşturulan verileri tercih ettiğiniz bir programa aktarın. Yazarlar, hücre proliferasyonunu %50 oranında inhibe eden ilaç konsantrasyonunu belirlemek için genellikle Prism yazılımını (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanırlar (IC₅₀).
   4. Prism yazılımında, yan yana alt sütunlarda beş çoğaltma değeri için hücre numaraları olarak X sütunu ve ortalama OD olarak Y sütunu olan bir veri tablosu oluşturun.
   5. Bir ilaç tedavisini analiz ederken X sütununa tedavi konsantrasyonu değerlerini girin. X eksenini işlem bileşiği adı ve konsantrasyon birimleriyle etiketleyin.
   6. Excel analizinden hesaplanan çoğaltma hücresi canlılık değerlerini Y alt sütunlarına girin. Y eksenini hücre proliferasyonu (%) olarak etiketleyin.
   7. Analiz aracını kullanarak, XY analizleri altında Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğini belirleyin.
   8. Doz-yanıt [inhibisyon] ve normalleştirilmiş yanıt-değişken eğimi seçin.
   9. Analiz işlevini gerçekleştirin. IC₅₀ için hesaplanan en uygun değerleri ve eğri uyum grafiğini görmek için sonuç tablosunu görüntüleyin. İstenirse grafiğin x ekseni günlük ölçeğine değiştirilebilir.

Yukarıda, kanserli hücrelerdeki iyon kanallarını karakterize etmek için kullanılabilecek seçilmiş prosedürler bulunmaktadır. İlk protokol, bir iyon kanalının boyanmasını vurgular. Ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bir iyon kanalını veya bu nedenle hücre dışı zarda bulunan herhangi bir proteini boyarken birçok zorluk vardır. Şekil 1'de gösterilen, pentamerik GABAA reseptörünün bir alt biriminin boyanmasıdır. İkinci protokol, kanserli hücrelerde mitokondrinin polarize durumunun test edilmesinin sonuçlarını vurgulamaktadır. Mitokondri, hücre canlılığı ve çoğalmasının yanı sıra hücre ölümü için gerekli rolleri oynar. Memeli hücrelerinde mitokondri, mitokondriyal iç ve dış zarlar arasında bulunan Bcl-2 ailesi proteinlerinin salınması yoluyla hücresel strese yanıt olarak apoptozu aktive eder. Sitozolde, Bcl-2 ailesi proteinleri, programlanmış hücre ölümüne aracılık eden kaspaz proteazlarını aktive eder. Plazma membran iyon kanalı fonksiyonundaki değişiklikler, mitokondri içindeki iyon seviyeleri de dahil olmak üzere hücre içi iyon homeostazının bozulmasına neden olabilir, bu da membran potansiyeli kaybına yol açabilir ve böylece apoptozutetikleyebilir 14. Ca2 +, K +, Na + ve H + seviyeleri, mitokondriyal tarafından başlatılan hücre ölümünü tetikleyebilecek sinyal olaylarında önemli belirleyicilerdir. Şekil 2'de gösterilen, negatif yükü21,22 koruyan aktif mitokondrideki membran potansiyelini etiketlemek ve görüntülemek için hücre geçirgen, pozitif yüklü boya TMRE ile boyamadır. TMRE, nispi negatif yükleri nedeniyle aktif mitokondri ile bağlanan kırmızı-turuncu bir boyadır. Depolarize veya inaktif mitokondriler membran potansiyelini azaltır ve bu nedenle TMRE'yi sekestre edemez. Bu deneyde, iyonofor birleştirici FCCP, mitokondriyal membranları depolarize ettiği ve böylece TMRE23 birikimini önlediği için önemli bir kontroldür. Üçüncü protokol, tek hücreli yama-kelepçe elektrofizyolojisini vurgular. Şekil 3'te, hasta kaynaklı medulloblastoma hücre hattı D283'ten kaydedilen bir izin temsili kayıtları gösterilmektedir. Son olarak, dördüncü protokol, kanserli hücrelerin çoğalma durumunu belirlemek için bir tahlili vurgular. Şekil 4'te, MTS testinin nasıl çalıştığına dair ayrıntılar ve incelenen kanser hücrelerinin canlılığını bozan bir ajanla (bu durumda DAOY) inkübe edildiğinde plakanın ve okumanın bir resmi gösterilmektedir.

Şekil 1: İyon kanalları için boyama hücreleri. (A) D283 medulloblastoma kanser hücrelerinde GABAA reseptörünün bir alt birimi olan Gabra5 proteininin boyanması. (B) DNA'ya bağlanan floresan boyama 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile muamele edilen sabit hücreler. (C) Hem Gabra5 hem de DAPI için boyanmış medulloblastoma kanser hücrelerinin birleşmesi. Ölçek çubukları = 10 μm. Şekil Kallay ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mitokondrinin polarize durumunun test edilmesi . (A) Canlı D283 medulloblastoma kanser hücreleri, QH-II-066 ilacının artan konsantrasyonları ile tedavi edilir. Hücreler daha sonra aktif (negatif yüklü) mitokondride biriken pozitif yüklü, hücre geçirgen TMRE (tetrametilrodamin, etil ester) ile muamele edilir. Depolarize veya inaktif mitokondri, membran potansiyelini azaltır ve bu nedenle TMRE boyasını tutamaz; Sonuç olarak, düşük bir floresan sinyali gösterirler. Floresan mikroskobu ile görüntülendi; FCCP (karbonil siyanür 4- [triflorometoksi] fenilhidrazon). Tepe noktası: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Ölçek çubukları = 10 μm. (B) Yazılım platformu kullanılarak TMRE boyamanın miktarının belirlenmesi (panel A'da gösterilen resimler). Veriler, ortalamanın ortalama ve standart hatası olarak sunulur. Şekil Kallay ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Elektrofizyoloji kullanarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulması . (A) Gösterilen, bir Faraday kafesi (a), kayıt odası (b) ve emme ünitesinden (c, sağ) oluşan bir Port-a-Patch kurulumu veya teçhizatıdır. (B) Bir perfüzyon girişi (a), çıkış (b) ve referans elektrot (c) ile donatılmış kayıt odasını vurgulayan Port-a-Patch teçhizatının üstten görünümü. (C) Port-a-Patch, otomatik ve manuel çalışma modları ve çözelti rezervuarları ile hızlı bir çözelti değişim perfüzyon sistemine bağlanır. (D) Bir Port-a-Patch teçhizatı (Nanion) ve D283 medulloblastoma kanser hücreleri kullanılarak tam hücre yama kelepçesi elektrofizyoloji kaydından temsili akım izi. GABA (10 μM) 5 sn boyunca uygulandı ve tutma potansiyeli -80 mV oldu. (E) GABA (1 μM) ve GABAA reseptör agonisti (genel anestezik) propofol (50 μM) ile birlikte uygulanarak bir Port-a-Patch teçhizatı (Nanion) ve D283 medulloblastoma kanser hücreleri kullanılarak tam hücre yama kelepçesi elektrofizyoloji kaydından temsili akım izi, tek başına GABA tarafından indüklenen akımı güçlendirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İlaç gücünü değerlendirmek için MTS testi. (A) Hücre proliferasyonundaki bir azalma ile yansıtıldığı gibi, bir ajanın gücünü değerlendirmek için kullanılan "MTS testinin" altında yatan kimyasal reaksiyonlar. MTS tetrazolyumun canlı hücreler tarafından indirgenmesi, formazan boyası üretmesi. (B) Artan ilaç konsantrasyonları ile bir MTS testinin kolorimetrik sonuçlarını gösteren 96 oyuklu bir plaka. Bu deneyde, DAOY medulloblastoma kanser hücreleri, GABAA reseptörünün pozitif bir allosterik modülatörü olan klinik öncesi bir ilaç olan KRM-II-08'in artan konsantrasyonları ile tedavi edilir. (C) MTS tahlili ile oluşturulan bir doz-yanıt eğrisi (96 oyuklu plakanın miktarının belirlenmesinden). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Manuel ve yarı ve/veya tam otomatik elektrofizyoloji kurulumlarının karşılaştırılması.

D.A.P.K., Amlal Pharmaceuticals Inc.'in kurucu ortağı, başkanı ve CEO'sudur.