Bu çalışmada, su örneklerinde üç ana daldan Leptospira'yı tespit etmek için bir nokta-leke uygulaması tasarlanmıştır. Bu yöntem, bir anti-digoksigenin antikoru tarafından kolayca tespit edilen, digoksigenin etiketli bir prob tarafından spesifik olarak hedeflenen minimum DNA miktarlarının tanımlanmasına izin verir. Bu yaklaşım, tarama amaçları için değerli ve tatmin edici bir araçtır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Su Örneklerinde Leptospira Tespiti için Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Nokta-Blot Hibridizasyonu,
Bu makalede
Özet
Özet
Nokta lekesi, taşıyıcı DNA'nın varlığında prob hibridizasyonuyla özel olarak hedeflenen minimum miktarda DNA'nın tanımlanmasını sağlayan basit, hızlı, hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bilinen bir miktarda DNA'nın, nokta-leke aparatı kullanılarak ve elektroforetik ayırma olmaksızın naylon zar gibi inert bir katı destek üzerine aktarılmasına dayanır. Naylon membranlar, yüksek nükleik asit bağlama kapasitesi (400 μg/cm2), yüksek mukavemet avantajına sahiptir ve pozitif veya nötr yüklüdür. Kullanılan prob, digoksijenenin (DIG) ile uzun süre etiketlenmiş 18 ila 20 bazdan oluşan oldukça spesifik bir ssDNA fragmanıdır. Prob, Leptospira DNA'sı ile konjuge olacaktır. Prob, hedef DNA ile hibritlendikten sonra, bir anti-digoksigenin antikoru tarafından tespit edilir ve bir X-ışını filminde ortaya çıkan emisyonları sayesinde kolay tespit edilmesini sağlar. Emisyonlu noktalar, ilgilenilen DNA parçalarına karşılık gelecektir. Bu yöntem, çok uzun bir yarı ömre sahip olabilen probun izotopik olmayan etiketlemesini kullanır. Bu standart immüno-etiketin dezavantajı, izotopik problardan daha düşük bir hassasiyettir. Bununla birlikte, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve nokta-blot deneylerinin birleştirilmesiyle hafifletilir. Bu yaklaşım, hedef dizinin zenginleştirilmesini ve algılanmasını sağlar. Ek olarak, iyi bilinen bir standardın seri seyreltilmesiyle karşılaştırıldığında nicel bir uygulama olarak kullanılabilir. Su örneklerinde üç ana daldan Leptospira'yı tespit etmek için bir nokta-leke uygulaması burada sunulmaktadır. Bu metodoloji, Leptospiral DNA'nın varlığına dair kanıt sağlamak için santrifüjleme ile konsantre edildikten sonra büyük miktarlarda suya uygulanabilir. Bu, genel tarama amaçları için değerli ve tatmin edici bir araçtır ve suda bulunabilecek diğer kültürlenemeyen bakteriler için kullanılabilir, bu da ekosistemin anlaşılmasını geliştirir.
Giriş
İnsanlarda leptospirosis esas olarak çevresel kaynaklardan kaynaklanır 1,2. Göllerde, nehirlerde ve akarsularda Leptospira'nın varlığı, yaban hayatı ve sonunda bu su kütleleriyle temas edebilecek evcil ve üretim hayvanları arasında leptospirosis bulaşmasının bir göstergesidir 1,3,4. Ayrıca, Leptospira, kanalizasyon, durgun ve musluk suyu dahil olmak üzere doğal olmayan kaynaklarda tespit edilmiştir 5,6.
Leptosp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Numune hazırlama
- Her su örneğini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 8.000 x g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca konsantre edin. Numuneyi 250 μL'lik bir hacme konsantre etmek için bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın.
- DNA ekstraksiyon kitini üreticinin talimatlarına göre kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Kullanılacak nokta-leke probuna göre spesifik PCR'yi gerçekleştirin (Tablo 1).
- Amplifikasyonları, 1 X tampon, 2.5 birim Taq polimeraz, her primerden 1 μM, her dNTP'den 0.2 mM, 1.5 mMMgCl2 ve her su örneğinden veya referans genomik DNA'dan 100 ng he....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tekniğin etkinliğini değerlendirmek için, her bir Leptospira serovarının saf kültürlerinden elde edilen genomik DNA, dala özgü prob ile birlikte kullanıldı. Membranlar, her bir serovar için PCR reaksiyonu başına 100 ng genomik DNA ile hazırlandı, ardından akraba olmayan bakterilerin sekiz genomik DNA'sı ve ad hoc Leptospira serovarlarının değişken genomik DNA konsantrasyonları izledi. Her tahlil pozitif, negatif ve şablon olmayan kontrolü içeriyordu. Bu ilişkili olmayan genomik DNA, nokta-leke probları .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Nokta-blot tekniğinin kritik adımları şunları içerir: (1) DNA immobilizasyonu, (2) membran üzerindeki serbest bağlanma bölgelerinin homolog olmayan DNA ile bloke edilmesi, (3) tavlama koşulları altında prob ve hedef fragman arasındaki tamamlayıcılık, (4) hibritlenmemiş probun çıkarılması ve (5) raportör molekülün41 tespiti.
PCR-Dot-blot'un, tekniğin hibritleştirilmiş parçanın37 boyutu hakkında bilgi sağlamaması, ikinci veya üçüncü bir prob ile ye.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Veterinerlik ve Zootekni Fakültesi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nün Leptospira koleksiyonuna borçluyuz. Referans Leptospira suşlarının cömert bağışı için minnettarız; Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6 ve Leptospira biflexa serovar Patoc suşu Patoc I'den Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma'ya. CIBAC Koordinatörü Dr. José Antonio Ocampo Cervantes'e ve personele lojistik destekleri için teşekkür ederiz. EDT, Metropolitan Özerk Üniversitesi-Kampüsü Cuajimalpa'nın lisans öğrencileri için Terminal Projesi programı kapsamındaydı. Şekil 1 ve 3'ten 9'a kadar olan şekill....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAKTİFLER< / güçlü > | |||
| Purelink DNA ekstraksiyon kiti | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimeraz (Uç Nokta PCR Taq polimeraz kiti) | Promega | M3001 | |
| Whatman filtre kağıdı, sınıf 1, | Merk | WHA1001325 | |
| Naylon Membranlar, pozitif yüklü Rulo 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçaları Koyun Poliklonal Birincil antikor | Roche | 11093274910 | |
| Orta Baz EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Zenginleştirme EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Bloke Edici Reaktif | Roche | 11096176001 | |
| CSPD kullanıma hazır Disodyum 3- (4-metoksispiro {1,2-dioksetan-3,2 & prime; - (5 & prime; -kloro) trisiklo [3.3.1.1 3,7 < / sup>] dekan} 8< / sup>-4-yl) fenil fosfat | Merk | 11755633001 | |
| Ringa balığı sperminden deoksiribonükleik asit | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Geliştirici Carestream | Carestream Sağlık A.Ş | GBX5158621 | |
| Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, Disodyum Tuzu (Dihidrat) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauril sülfat Sodyum Tuzu (Sodyum dodesil sülfat; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | Anyonik bir yüzey aktif maddedir |
| Polivinilpirolidon (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polietilen glikol Sorbitan monolaurat (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Sodyum Klorür (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Sodyum fosfat dibazik (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Terminal transferaz, rekombinant | Roche | 3289869103 | |
| Tris hidroklorür (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | Aşağıdaki Ev yapımı olabilir Ek Dosya 6 |
| Primerler | Sigma-Aldrich | Talep üzerine | Tablo 1'i takip edin |
| Problar | Sigma-Aldrich | Talep üzerine | Tablo 1'i takip edin |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ Bir Spektrofotometre | Termo-Bilimsel | ND-ONE-W | |
| Soğutmalı mikrosantrifüj Sigma 1-14K, 14.000 rpm'de 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerinin santrifüjlenmesi için uygun | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Dezenfekte edilmiş ayarlanabilir pipetler, aralık 2-20 ve mikro; L, 20-200 ve mikro; l | Gilson | SKU: F167360 | |
| Tek kullanımlık 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri (otoklavlanmış) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Tek Kullanımlık 600 ve mikro; l mikrosantrifüj tüpleri (otoklavlanmış) | Axygen | 3208 | |
| Tek Kullanımlık Pipet uçları 1-10 ve mikro; l | Axygen | T-300 | |
| Tek Kullanımlık Pipet uçları 1-200 & l | Axygen | TR-222-Y | |
| Nokta-Leke aparatı Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Taşınabilir Hergom Emme | Hergom | 7E-A | |
| Bilimsel Işık Kutusu (Görünür ışık PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Çapraz Bağlayıcı | Hoefer | UVC-500 | |
| Termo Hybaid PCR Ekspres Termocycler | Hybaid | ||
| IP Plakalı Radyografik kaset14 X 17 | Fuji |
Kaynaklar
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
