Yöntem makalesi

Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

DOI:

10.3791/65500

⸱

23 Haziran 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sentetik gen ağları, bilim insanlarının ve mühendislerin genetik düzeyde kodlanmış işlevselliğe sahip yeni sistemler tasarlamaları ve inşa etmeleri için bir platform sağlar. Gen ağlarının konuşlandırılması için baskın paradigma hücresel bir şasi içinde olsa da, sentetik gen ağları hücresiz ortamlarda da konuşlandırılabilir. Hücresiz gen ağlarının umut verici uygulamaları arasında biyosensörler bulunur, çünkü bu cihazlar biyotik (Ebola, Zika ve SARS-CoV-2 virüsleri) ve abiyotik (ağır metaller, sülfürler, böcek ilaçları ve diğer organik kirleticiler) hedeflere karşı gösterilmiştir. Hücresiz sistemler tipik olarak bir reaksiyon kabı içinde sıvı halde konuşlandırılır. Bununla birlikte, bu tür reaksiyonları fiziksel bir matrise gömmek, daha geniş bir ortam kümesinde daha geniş uygulamalarını kolaylaştırabilir. Bu amaçla, hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını çeşitli hidrojel matrislerine gömmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmaya elverişli hidrojellerin temel özelliklerinden biri, hidrojel malzemelerin yüksek su sulandırma kapasitesidir. Ek olarak, hidrojeller, işlevsel olarak faydalı olan fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Hidrojeller, depolama için dondurularak kurutulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere yeniden sulandırılabilir. CFPS reaksiyonlarının hidrojellere dahil edilmesi ve tahlili için iki adım adım protokol sunulmaktadır. İlk olarak, bir CFPS sistemi, bir hücre lizatı ile rehidrasyon yoluyla bir hidrojele dahil edilebilir. Hidrojel içindeki sistem daha sonra hidrojel yoluyla tam protein ekspresyonu için yapısal olarak indüklenebilir veya eksprese edilebilir. İkincisi, hücre lizatı, polimerizasyon noktasında bir hidrojele eklenebilir ve tüm sistem, hidrojel içinde kodlanan ekspresyon sistemi için indükleyiciyi içeren sulu bir çözelti ile daha sonraki bir noktada dondurularak kurutulabilir ve yeniden sulandırılabilir. Bu yöntemler, hidrojel malzemelere duyusal yetenekler kazandıran hücresiz gen ağlarına izin verme potansiyeline sahiptir ve laboratuvarın ötesinde konuşlanma potansiyeline sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sentetik biyoloji, doğada bulunmayan işlevleri yerine getirebilen biyolojik tabanlı parçalar, cihazlar ve sistemler tasarlamak ve tasarlamak için çeşitli mühendislik disiplinlerini bütünleştirir. Çoğu sentetik biyoloji yaklaşımı hala canlı hücrelere bağlıdır. Buna karşılık, hücresiz sentetik biyoloji sistemleri, geleneksel hücre tabanlı gen ekspresyon yöntemlerininkısıtlamalarının çoğunu ortadan kaldırırken, biyolojik sistemlerin mühendisliği için daha fazla esneklik ve kısaltılmış bir süre sağlayarak, tasarımda benzeri görülmemiş düzeyde kontrol ve özgürlüğü kolaylaştırır 1,2,3. CFPS, yapay hücreler oluşturmak, genetik devrelerin prototipini oluşturmak, biyosensörler geliştirmek ve metabolitler üretmek de dahil olmak üzere çok sayıda disiplinde artan sayıda uygulamada kullanılmaktadır 4,5,6. CFPS ayrıca, agregasyona eğilimli proteinler, transmembran proteinler ve toksik proteinler 6,7,8 gibi canlı hücrelerde kolayca eksprese edilemeyen rekombinant proteinlerin üretilmesi için özellikle yararlı olmuştur.

CFPS tipik olarak sıvı reaksiyonlarda gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, herhangi bir sıvı hücresiz cihazın bir reaksiyon kabı içinde bulunması gerektiğinden, bazı durumlarda konuşlandırılmalarını kısıtlayabilir. Burada sunulan yöntemlerin geliştirilmesinin gerekçesi, hücresiz sentetik biyoloji cihazlarının hidrojellere gömülmesi için sağlam protokoller sağlamaktı, kendi başına bir protein üretim platformu olarak değil, bunun yerine, hidrojellerin hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için fiziksel bir şasi olarak kullanılmasına izin vermekti. Hidrojellerin CFPS şasisi olarak kullanılmasının çeşitli avantajları vardır. Hidrojeller, yüksek su içeriğine rağmen (bazen% 98'den fazla), katı özellikleresahip polimerik malzemelerdir 9,10,11. Macunlar, yağlayıcılar ve yapıştırıcılar olarak kullanımları vardır ve kontakt lensler, yara örtüleri, deniz yapışkan bantları, kir iyileştiriciler ve bebek bezleri 9,11,12,13,14 gibi çeşitli ürünlerde bulunurlar. Hidrojeller ayrıca ilaç dağıtım araçlarıolarak aktif olarak araştırılmaktadır 9,15,16,17. Hidrojeller ayrıca biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir ve kendi 9,18,19,20 uyaran tepkilerine sahip olabilir. Dolayısıyla buradaki amaç, moleküler biyolojiden türetilen işlevsellik ile malzeme bilimi arasında bir sinerji yaratmaktır. Bu amaçla, hücresiz sentetik biyolojiyi kollajen, laponit, poliakrilamid, fibrin, PEG-peptid ve agaroz 11,21,22 dahil olmak üzere bir dizi malzemeyle entegre etmenin yanı sıra cam, kağıt ve kumaş yüzeylerini kaplamak için çaba sarf edilmiştir 11,23,24 CFPS cihazları ile. Burada sunulan protokoller, örnek malzeme olarak agaroz kullanılarak CFPS reaksiyonlarını makro ölçekli (yani >1 mm) hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi göstermektedir. Agaroz, yüksek su emme kapasitesi, kontrollü kendi kendine jelleşme özellikleri ve ayarlanabilir mekanik özelliklerinedeniyle seçilmiştir 11,24,25,26. Agarose ayrıca fonksiyonel CFPS'yi destekler, diğer birçok hidrojel alternatifinden daha ucuzdur ve biyolojik olarak parçalanabilir, bu da onu deneysel bir model sistem olarak çekici bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin daha önce CFPS'yi bir dizi alternatif hidrojele gömmek için uygun olduğu gösterilmiştir11. Hidrojellerin geniş uygulama yelpazesi ve CFPS'nin işlevselliği göz önüne alındığında, burada gösterilen yöntemler, araştırmacıların kendi amaçlarına uygun biyolojik olarak geliştirilmiş hidrojel malzemeleri geliştirebilecekleri bir temel sağlayabilir.

Önceki çalışmalarda,23,27,28,29,30,31 reaksiyon tamponuna batırılmış hidrojellerde CFPS gerçekleştirmek için 1 μm ila 400 μm boyut aralığına sahip mikrojel sistemleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, hidrojelleri CFPS reaksiyon tamponlarına daldırma gerekliliği, kendi başlarına malzeme olarak konuşlandırılma fırsatlarını sınırlar. Burada sunulan protokoller, jelleri reaksiyon tamponlarına daldırmaya gerek kalmadan hidrojeller içinde CFPS reaksiyonlarının gerçekleşmesine izin verir. İkincisi, makro ölçekli jellerin (2 mm ila 10 mm boyutunda) kullanılması, hidrojeller ve hücresiz gen ekspresyonu arasındaki fiziksel etkileşimin incelenmesine izin verir. Örneğin, bu teknikle, hidrojel matrisinin CFPS reaksiyonlarını11 nasıl etkilediğini ve CFPS reaksiyonlarının hidrojel matrisini31 nasıl etkileyebileceğini incelemek mümkündür. Daha büyük boyutlardaki hidrojeller ayrıca yeni, biyo-programlanabilir malzemelerin geliştirilmesine de izin verir32. Son olarak, CFPS reaksiyonlarını hidrojellere gömerek, plastik reaksiyon kaplarına olan gereksinimde de potansiyel bir azalma olur. Hücresiz sensörlerin konuşlandırılması için bu, plastik malzemelere bağımlı cihazlara göre açık avantajlara sahiptir. Birlikte ele alındığında, CFPS reaksiyonlarının hidrojellere gömülmesi, hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için çeşitli avantajlar sağlar.

Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, hidrojel matrisleri içinde CFPS reaksiyonlarının çalışmasına izin vermektir. Hücresiz protein üretim reaksiyonlarını makro ölçekli hidrojel malzemelere gömmek için iki farklı yöntem gösterilmiştir (Şekil 1). Yöntem A'da, CFPS bileşenleri, aktif bir sistem oluşturmak için liyofilize agaroz hidrojellere eklenir. Yöntem B'de, erimiş agaroz, tam bir CFPS hidrojel sistemi oluşturmak için CFPS reaksiyon bileşenleri ile karıştırılır, daha sonra liyofilize edilir ve ihtiyaç duyulana kadar depolanır. Bu sistemler, reaksiyonu başlatmak için bir hacim su veya tampon ve analit ile rehidre edilebilir.

Bu çalışmada Escherichia coli hücre lizat bazlı sistemler kullanılmaktadır. E. coli hücre lizat preparatı basit, ucuz ve yüksek protein verimi sağladığı için bunlar en popüler deneysel CFPS sistemlerinden bazılarıdır. Hücre lizatı, ribozomlar, tRNA'lar, aminoasil-tRNA sentetazları ve başlatma, uzama ve sonlandırma faktörleri dahil olmak üzere transkripsiyon ve translasyonu gerçekleştirmek için gereken makromoleküler bileşenlerle tamamlanır. Spesifik olarak, bu makale, E. coli hücre lizatları kullanılarak agaroz hidrojellerde eGFP ve mCherry üretimini gösterir ve bir plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi kullanarak floresan görünümünü izler. Mikrotitre plaka okuyucu için temsili sonuçlar Whitfield ve ark.31'de görülebilir ve temel veriler kamuya açıktır 33. Ayrıca, jeller boyunca floresan proteinlerin ekspresyonu konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanır. Bu yazıda gösterilen iki protokol, hücre içermeyen gen devrelerinin saha dağıtımını destekleyecek şekilde dağıtımı için uygun bir fiziksel ortam yaratma nihai hedefi ile CFPS tabanlı genetik cihazların materyalde birleştirilmesine ve depolanmasına izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre lizat tamponu ve ortam hazırlama

  1. 2x YT+P agar ve besiyerinin hazırlanması
    1. 16 g/L tripton, 10 g/L maya özütü, 5 g/L NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 ve 15 g/L agar ölçerek 2x YT+P agar hazırlayın. 2x YT+P et suyu için önceki bileşimi takip edin ancak agarı atlayın.
    2. 2x YT+P'yi otoklavlayarak sterilize edin.
  2. S30A tamponunun hazırlanması
    1. S30A tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat, 12.195 g/L K-glutamat ve 25 mL/L 2 M Tris ile hazırlayın, asetik asit ile pH 7.7'ye ayarlayın.
    2. S30A tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
  3. S30B tamponunun hazırlanması
    1. S30B tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat ve 12.195 g/L K-glutamat ile hazırlayın, 2 M Tris ile pH 8.2'ye ayarlayın.
    2. S30B tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.

2. Hücre lizat hazırlığı (4 günlük protokol)

  1. 1. Gün
    1. 2x YT+P'yi 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş agar plakalarına dökün.
    2. E. coli'yi −80 °C gliserol stoğundan ayırın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün
    1. 2x YT+P plakasından tek bir koloniyi 1 L'lik şaşkın bir şişede 400 mL 2x YT+P et suyuna (ampisilin ile desteklenmiş) aşılayın.
    2. 37 °C'de 220 rpm çalkalayarak 24 saat inkübe edin.
  3. 3. Gün
    1. 24 saatlik kültürlerin OD600'ünü ölçün ve kaydedin; 3-4'lük bir OD600'de büyüme yeterlidir.
      NOT: 1 mL'lik bir bakteri kültürü alikutu alın ve OD600 nm'yi ölçmeden önce orta (2x YT+P suyu) ile seri seyreltme gerçekleştirin. OD600'ü hesaplarken seyreltme etkisine izin verin.
    2. Kültürü önceden soğutulmuş 500 mL'lik santrifüj şişeleri arasında eşit olarak aktarın.
    3. 4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
    4. Santrifüjleme sırasında, önceden hazırlanmış S30A tamponuna 2 mL/L 1 M DTT ekleyerek, tamponu karıştırarak ve buz üzerinde tutarak S30A tampon hazırlığını tamamlayın.
    5. Hücre peletlerini 200 mL S30A tamponunda yeniden süspanse edin.
    6. Tüm pelet tamamen çözünene kadar şişeleri kuvvetlice vorteksleyin ve hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
    7. 4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
    8. 2.3.5-2.3.7 (dahil) adımlarını tekrarlayın.
    9. Her santrifüj şişesine 40 mL S30A tamponu ekleyin, peletleri yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.
    10. 4.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve kalan süpernatanı pipetle çıkarın ve mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
    11. Santrifüj tüplerini yeniden tartın, yeni kütleyi kaydedin ve peletlerin kütlesini hesaplayın.
    12. Peletleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.
  4. 4. Gün
    1. Peletleri buz üzerinde çözdürün.
    2. 1 g pelet başına aşağıdakileri ekleyin: 1.2 mL S30A tamponu (kullanımdan önce DTT eklenir), 275 μL proteaz inhibitörü (8 mM stok) ve 25 μL lizozim (10 mg/mL stok).
    3. Peletler kalan kümeler olmadan tamamen çözünene kadar kuvvetlice girdap yapın, onları mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
    4. 50 mL santrifüj tüplerinde, hücre süspansiyonlarını 120 W, 20 kHz,% 30 genlik ve 20 s / 40 s açma / kapama darbelerinde 5 dakikalık sonikasyon için sonikleştirin.
    5. Hücre kalıntılarını peletlemek için 4,000 ° C'de 1 saat boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı taze 50 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.
    7. Tüpleri 37 °C'de 220 rpm'de 80 dakika inkübe edin.
    8. S30B tamponuna 1 mL/L 1 M DTT ekleyerek diyaliz malzemelerini hazırlayın. Karıştırın ve 1 L'lik steril bir behere 900 mL ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve 4 °C'de tutun.
    9. Akış reaksiyonunu takiben, hücre ekstraktını adım 2.4.7'den 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
    10. Peletsiz süpernatanı 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde buz üzerinde birleştirin.
    11. Üretilen hücre ekstraktının toplam hacmini belirleyin ve gerekli sayıda 10K MWCO diyaliz kasetini 2 dakika boyunca S30B'ye batırarak nemlendirin.
    12. Kasetleri 3 mL'ye kadar ekstrakt içeren bir şırınga ile yükleyin. 4 °C'de 3 saat karıştırarak 1 L beher başına üç kasete kadar diyalize edin.
    13. Ekstraktı berraklaştıran diyaliz tamamlandıktan sonra, ekstraktı 2 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    14. Arıtılmış ekstraktı buz üzerinde taze bir santrifüj tüpünde birleştirin ve karıştırmak için kısaca girdap yapın.
    15. Bir florometre kullanarak ekstraktın protein konsantrasyonunu belirleyin.
    16. Ekstraktı önceden soğutulmuşddH2Okullanarak 44.5 mg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin.
    17. 200 μL'lik alikotlara ayırın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.

3. Liyofilize hidrojellerin hazırlanması (Yöntem A)

  1. 0.75 g agaroz tartın, 100 mL'lik bir hacmeddH2Oekleyin ve erimiş agaroz stoğu oluşturmak için yüksek sıcaklıklarda 30 s'de mikrodalgada pişirin.
  2. Bir pipet kullanarak, 50 μL erimiş agarozu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve jelin 20-30 dakika polimerize olmasına izin verin (jeller bir buzdolabına aktarılırsa polimerizasyon daha hızlı gerçekleşir).
  3. Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
  4. Santrifüj tüplerinin kapağını çıkarın, santrifüj tüpü açıklıklarını balmumu filmiyle kapatın ve filmi bir iğne veya pipet ucuyla birkaç kez delin.
  5. Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini 1-2 saat boyunca −80 ° C'de depolayın.
  6. Santrifüj tüplerini −80 °C'lik depodan kurtarın ve tüplerin tamamen kuru olduğundan emin olarak bir dondurarak kurutucuya koyun.
  7. Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar.
  8. Jeli gece boyunca donarak kurumaya bırakın.
  9. Jelleri dondurarak kurutucudan kurtarın ve gerekli olana kadar −80 °C'lik bir depoya koyun.
    NOT: Jeller 1 yıla kadar dondurularak kurutulmuş olarak saklanabilir.

4. 14x enerji çözeltisi stoğunun hazırlanması

  1. 14x enerji çözeltisi üretmek için tüm reaksiyon bileşenlerini (Tablo 1) buz üzerinde 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde birleştirin.
  2. 14x enerji çözeltisini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve −80 ° C'de saklayın (daha küçük hacimli alikotlar kullanılabilir).
    NOT: 14x enerji çözeltisi, tüplerin tekrar tekrar donarak çözülmesi önlenirse, −80 °C'de birkaç ay saklanabilir.

5. 4x amino asit stoğunun hazırlanması

  1. Bir RTS Amino Asit Örnekleyici kitinin 20 amino asit bileşeninin tümünü buz üzerinde çözün. Tamamen çözündüklerinden emin olmak için amino asitleri vorteksleyin.
  2. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 20 amino asidin tümünü birleştirin ve çözelti berraklaşana kadar 12 mL sterilddH2O. Vorteks ekleyin, sadece hafif bir beyaz renklenme bulanıklığı ile.
  3. 4x amino asitleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (500 μL alikotlar) ayırın.
  4. 4x amino asit çözeltisi alikotlarını sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve alikotları −80 °C depolamaya taşıyın.

6. Hücresiz tampon kalibrasyonu

NOT: Hidrojel reaksiyonları için kullanılan CFPS tamponu, Sun ve ark.35'ten modifiye edilen Banks ve ark.34'teki protokol izlenerek optimal DTT, Mg-glutamat ve K-glutamat konsantrasyonları için kalibre edilmiştir. Kalibrasyon reaksiyonu bileşimleri, K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) ve DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) stokları. JMP Pro 15, özel bir DOE tasarımı oluşturmak (Tablo 2) ve optimal faktör konsantrasyonlarını belirlemek için analiz yapmak için kullanıldı.

  1. Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve buz üzerinde çözdürün.
  2. 4x amino asit, 14x enerji solüsyonu, %40 PEG-8000, plazmit DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat ve 100 mM DTT stoklarını buz üzerinde çözün.
  3. 12.5 μL 4x amino asit, 3.57 μL 14x enerji çözeltisi, 2.5 μL %40 PEG-8000, 3 μg plazmit DNA ve 10 μL hücresiz ekstrakt (44.5 mg/mL) birleştirerek bir kalibrasyon ana karışımı oluşturun ve ddH2Oile reaksiyon başına 35 μL'ye kadar yapın.
  4. 35 μL ana karışımı 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtın.
  5. DOE tasarımını takiben, her reaksiyonu 50 μL'ye kadar yapmak içinddH2Oile birlikte her reaksiyona uygun hacimde Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT ekleyin.
  6. Açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın (mCherry için): uyarma: 587 nm, emisyon: 610 nm, dalga boyu bant genişliği: 12 nm, optik: üst, sıcaklık: 37 °C, floresan okumaları toplam okuma süresinin 4 saati boyunca her 5 dakikada bir toplanır. Plakaları 60 rpm'de darbeli bir ayarda çalkalayarak inkübe edin.
  7. Sonuçları JMP DOE tasarımına yükleyin ve istenen yanıt değişkenlerine dayalı olarak K-glutamat, Mg-glutamat ve DTT için optimal konsantrasyon seviyelerini belirlemek için bir tahmin profili oluşturun; Bu durumda, maksimum floresan ve reaksiyon hızı yanıt değişkenleriydi.
  8. 3X CFPS tamponunu oluşturmak için reaktifleri Tablo 2'te gösterildiği gibi birleştirin
  9. Aliquot ve −80 °C'de saklayın

7. Rehidre liyofilize hidrojellerde CFPS (Yöntem A)

NOT: CFPS reaksiyonlarında kullanılan plazmitler, E. coli 36 için EcoFlex modüler araç setindeki bileşenler kullanılarak oluşturulmuştur ve Whitfield ve ark.1 JM23100 1'de açıklanmıştır. Bu bileşenler Addgene'den edinilebilir.

  1. Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.
  2. 2x CFPS tamponunu ve plazmit DNA'yı toplayın ve buz üzerinde çözdürün.
  3. Dondurularak kurutulmuş hidrojelleri toplayın ve jelleri tezgahta bekleterek 15 dakika oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.
  4. Jelleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, gerekirse jelleri kuyucuklara sığdırmak için bir neşter ile kesin.
  5. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 25 μL 2x CFPS tamponu ve 4 μg plazmit DNA ile birleştirin; CFPS çözeltisini oluşturmak için ddH2Oile toplam 50 μL hacme kadar çıkın.
  6. CFPS çözeltisini dondurularak kurutulmuş hidrojellerin üzerine pipetleyin.
  7. Jellerin oda sıcaklığında 5-10 dakika CFPS sisteminde ıslanmasına izin verin.
  8. Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.
  9. Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki çalışmalarda mevcuttur31,33.

8. Konuşlandırılabilir hidrojellerde hücresiz protein sentezi (Yöntem B)

  1. −80 °C depolamadan hücresiz ekstraktı geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.
  2. Plazmid DNA'sını toplayın ve buz üzerinde çözdürün.
  3. Buz üzerinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 3 μg plazmit DNA ve 25 μL 2x CFPS tamponu ile birleştirerek toplam hacmi 37.5 μL'ye kadar birleştirin.
  4. 3 g agaroz ölçün ve% 3 agaroz oluşturmak için 100 mL ddH2Otamponuna ekleyin.
  5. Mikrodalgada %3 agaroz 30 saniyede yüksek güçte patlar.
  6. 12.5 μL erimiş agarozu, toplam 50 μL hacme kadar CFPS karışımı içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin.
  7. Erimiş agarozun soğumasına izin verin, ancak polimerize olmayın, agarozu 50 °C'ye ayarlanmış bir ısı bloğunda bırakın.
  8. Erimiş agarozu CFPS çözeltisi ile birleştirin; pipetleme yoluyla karıştırın ve uçla karıştırın ve CFPS çözeltisi karıştırılmadan önce jel polimerizasyonunu önlemek için hızlı hareket ettiğinizden emin olun.
  9. Jellerin oda sıcaklığında soğumasını bekleyin ve yaklaşık 2 dakika polimerize edin.
  10. Polimerize agarozu bir spatula ile 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
  11. Flaşla dondurulan hidrojelleri 1 saat boyunca −80 °C'de saklayın.
  12. Jelleri depodan kurtarın; Mikrosantrifüj tüpü kapaklarını çıkarın, tüpleri balmumu filmiyle örtün ve nemin kurumasını sağlamak için filmi delin.
  13. Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar, 18 saat dondurarak kurutma (gece boyunca).
  14. Dondurularak kurutulmuş CFPS cihazlarını kullanana kadar −80 °C'lik bir depoda saklayın.
  15. Yaklaşık 50 μL ıslak hacme sahip dondurularak kurutulmuş CFPS cihazları, fazla sıvı olmadan 50 μLddH2Oile rehidre edilebilir. Rehidrasyon yaklaşık 30 dakika sürer.
  16. Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.
  17. Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki yayınlardamevcuttur 31,33.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, CFPS reaksiyonlarını hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi detaylandırır ve Şekil 1 , iki yaklaşımın şematik bir özetini sunar. Her iki yöntem de dondurarak kurutmaya ve uzun süreli depolamaya uygundur. Yöntem A, iki nedenden dolayı en çok kullanılan metodolojidir. İlk olarak, bir dizi hidrojel malzeme ile çalışmak için en uygun yöntem olduğu gösterilmiştir11. İkincisi, Yöntem A, genetik yapıların paralel olarak test edilmesine izin verir. Yöntem ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, E. coli hücresi lizat bazlı CFPS reaksiyonlarının agaroz hidrojellere dahil edilmesi için iki protokol özetlenmiştir. Bu yöntemler, materyal boyunca eşzamanlı gen ekspresyonuna izin verir. Protokol diğer CFPS sistemleri için uyarlanabilir ve burada ayrıntıları verilen laboratuvarda hazırlanmış hücre lizatlarına ek olarak ticari olarak temin edilebilen CFPS kitleri ile başarılı bir şekilde yürütülmüştür. Daha da önemlisi, protokol, harici bir sıvı fazın yokluğunda gen ekspresyonuna izin verir. Bu, sistemi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nin BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ve BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi - Savunma Bilimi ve Teknoloji Laboratuvarları ödülü EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.) ödüllerinin desteğini büyük ölçüde kabul etmektedir. Bu yayını destekleyen veriler şu adreste açıkça mevcuttur: 10.25405/data.ncl.22232452. Yazar, açık erişim amacıyla, ortaya çıkan herhangi bir Yazar Kabul Edilmiş Makale sürümüne Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme< / güçlü >
3-PGASanta Cruz Biyoteknolojisc-214793B
Asetik AsitSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgarozSevern Biotech30-15-50
Amino Asit Örnekleyici KitiVWR
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Koenzim A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinik AsitSigma-AldrichF7878-100MG
GTPKarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamatSigma-AldrichG1149-100G
LizozimSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamatSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potasyum Hidroksit (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potasyum Fosfat Dibazik (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potasyum Fosfat Monobazik (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Proteaz İnhibitörü kokteyliSigma-AldrichP2714-1BTL
Kübit Protein konsantrasyon kitiThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidinSigma-Aldrich85558-1G
TriptonThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Maya ÖzüSigma-AldrichY1625-1KG
güçlü > Ekipman< / güçlü >
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO diyaliz kasetleriThermo Fisher Scientific66381
15 mL santrifüj tüpüSarstedt62.554.502
50 mL santrifüj şişeleriSarstedt62.547.254
500 mL santrifüj şişeleriThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus dondurarak kurutucuMesihParça No. 101521, 101522, 101527
Tezgah Üstü SantrifüjThermo Fisher ScientificH-X3R
Siyah 384 kuyulu mikrotitre plakalarıFischer Scientific66
KüvetlerThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab KorosuElga#####
Eppendorf Mikrosantrifüj 5425REppendorfEP00532
Yüksek Hızlı SantrifüjBeckman CoulterB34183
JMP lisansıSAS Enstitüsü15
Manyetik KarıştırıcıFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Fotospektrometre (Biyofotometre)Eppendorf16713
Pipetler ve uçlarGilson#####
Hassas DengeSartorius 16384738
Qubit 2.0 FlorometreThermo Fisher ScientificQ32866
Çalkalama İnkübatörüThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonikatör)Thermo Fisher Scientific12893543
Statik İnkübatörSanyoMIR-162
Şırınga ve iğnelerThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Çalkalamalı İnkübatör)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° c metreVWR662-1657
BTRABR1401801 < Varioskan Lux plaka okuyucu Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702(2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429(2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261(2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050(2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64(2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105(2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150(2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165(2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hidrojel G mmeSentetik Gen A larProtein Ekspresyon HidrojelleriH cre Lizat ReaksiyonlarDondurularak Kurutulmu HidrojellerFloresans Alg lamaAgaroz JellerTan CihazlarPlaka Okuyucu Analizi

İlgili makaleler