Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı
Bu makalede
Özet
Özet
Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.
Giriş
İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer1, beyin2, karaciğer3, meme bezi4, bağırsak5 ve cilt6 dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi 8,9, inflamasyon 10 ve diğer çeşitli patolojiler ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması
- 3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.
- Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Canlı görüntüleme ekinin ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine uygun şekilde monte edilmesi ve ek parçanın üzerine transgenik bir farenin uygun şekilde yönlendirilmesi, ≥1 saatlik bir süre boyunca floresan etiketli, canlı kulak dokusunun z-yığınlarının elde edilmesiyle doğrulanır ve x, y- ve z eksenlerinde minimum sapma kanıtı vardır. Görüntüler tutarlı aralıklarla yakalanmalıdır (aralık süresi biyolojik soruya, floresan sinyalinin gücüne vb. bağlı olacaktır), böylece hücre dinamikleri ve görüntü kayması zaman iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
K14-mCherry-H2B fareleri için Valentina Greco'ya teşekkür ederiz. Emory Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi'ne cam lamel diskleri ürettiği için minnettarız. Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLRD Hizmeti'nden LS'ye Kariyer Geliştirme Ödülü #IK2 BX005370, MJMR'ye NIH Ödülleri RF1-AG079269 ve R56-AG072473 ve MJMR'ye I3 Emory SOM/GT Hesaplama ve Veri Analizi Ödülü ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3D Yazıcı | Qudi Tech | i-PLA | malzeme kullanarak hızlı 3D baskılar |
| 40x 1.25NA silikon objektif lens | Nikon | ||
| AxR Lazer Tarama Konfokal Mikroskop | Nikon | ||
| Pamuk Uçlu Çubuk | VWR | 76337-046 | Krem / merhem uygulaması |
| Doksisiklin hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Pdgfra-rtTA'da fibroblast çekirdeklerinin GFP etiketlemesini indükler; pTRE-H2B-GFP fareler |
| Düz Başlı Tornavida (2,5 mm) | Mikroskop aşamasına Affiix kesici uç | ||
| Düz Başlı Vidalar x 4 (#6-32) | Nikon | Mikroskop aşamasına vida yerleştirme | |
| Cam Alt Kültür Kabı | chemglass Yaşam Bilimleri | CLS-1811-002 | Canlı ek parça ile uyumlu lamel diski olarak kullanılmak üzere çanağın duvarları çıkarılarak değiştirildi; 35 mm genişliğindeki disk, 20 mm genişliğinde cam lamel içerir; çanak duvarlar vardı makine atölyesi tarafından kaldırıldı |
| Isı plakası kontrolörü | Physitemp | TCAT-2LV | Hayvan Sıcaklık Kontrol Cihazı - Alçak Gerilim; Fare vücut ısısının izlenmesi için anal prob eki |
| Altıgen Anahtar (1,5 mm) | M3 ayar vidası ayarları için | ||
| Altıgen Anahtar (2,5 mm) | Metal kulak klipsindeki gerginliği ayarlayın | ||
| İntravital Görüntüleme Eki | |||
| Isofluran | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Fare anestezisi |
| Etiketleme Bandı (veya Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Kulağı lamel için hareketsiz hale getirmek için metal kulak klipsine alternatif |
| Kulak klipsi olarak kullanılan | metal tutturucu | ||
| Fare: C57BL/6-PDGFRAEM1(rtTA)Xsun/J | Jackson Laboratuvarı | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblasta özgü promotör sürüş doksisiklin ile indüklenebilir rtTA ekspresyonu |
| Fare: K14-H2BPAmCherry | Yale Üniversitesi'nden Dr. Valentina Greco'nun izniyle | epidermal epitel hücre çekirdeklerini mCherry ile etiketler; metinde "K14-H2B-mCherry" olarak anılır | |
| Pdgfra-rtTA ile birleştirildiğinde ve doksisiklin ile indüklendiğinde GFP'li fibroblast çekirdeklerini etiketler | |||
| Çok Amaçlı Sızdırmazlık Sargısı | Glad | Fare sıcaklığını artırın | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Göz yağlayıcı |
| Ayar vidaları x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Isı plakası modülü için ek parça |
| Silikon Daldırma Yağı | 40x silikona uygulanır objektif | ||
| Küçük Hayvan Isıtma Plakası | Physitemp | HP-4M | Hayvana ısı sağlar |
| Somnoflow Düşük Akışlı Elektronik Buharlaştırıcı | Kent Scientific | SF-01 | Fare anestezisi |
| Vakum Gres | Flinn Scientific | AP1095 | Veet |
| Görüntüleme sonrası fare canlanması için | su sirkülasyonlu ısı yastığı | Stryker Medical | TP700 |
Kaynaklar
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196(202....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
