İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), çeşitli hücre tiplerine farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerine uygun bir alternatif haline getirir¹. Bu hPSC'ler iki tipe ayrılır: blastosist^2'den türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) ve somatik hücrelerin doğrudan yeniden programlanmasıyla üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler)³. hPSC'leri β hücrelere ayırma tekniklerinin geliştirilmesi, hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir ^1,4. Diabetes mellitus, dünya çapında >400 milyon insanı etkileyen kronik bir hastalıktır ve vücudun pankreas β hücrelerinin bozulması veya kaybı nedeniyle glisemiyi düzenleyememesinden kaynaklanır⁵. Transplantasyon için pankreas adacık hücrelerinin sınırlı mevcudiyeti, diyabet^için hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini engellemiştir 2,4,6,7. hPSC'leri kullanarak glikoza duyarlı insülin salgılayan hücreler üretme yeteneği, insan adacık gelişimini ve işlevini incelemek için yararlı bir hücresel model görevi görür. Kontrollü bir ortamda diyabet tedavisi için potansiyel terapötik adayları test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, hPSC'ler, hastayla genetik olarak özdeş olan pankreas adacık hücreleri üretme potansiyeline sahiptir ve transplantasyondan sonra immün reddi riskini azaltır ^2,4,7.

Son yıllarda, hPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin iyileştirilmesinde önemli ilerlemeler olmuştur, bu da pankreas β hücreleri üretmeye yönelik farklılaşma sürecinin verimliliğinin ve tekrarlanabilirliğinin artmasına neden olmuştur ^8,9.

Aşağıdaki protokol, pankreas β hücrelerinin yönlendirilmiş farklılaşmasının temel aşamalarını özetlemektedir. Farklı zaman noktalarında spesifik hücre sinyal yollarının düzenlenmesini içerir. Sui L. ve ^ark.10 (2018) tarafından hPSC'lerin pankreas β hücrelerine dönüştürülmesi için geliştirilen protokole dayanmaktadır. En son araştırmalar, β hücrelerinin farklılaşmasını artırmak için aphidicolin (APH) tedavisinin kullanılmasının önemini vurguladığından, protokol Sui L. ve ^ark.11'in (2021) son güncellemelerine göre ayarlandı. Mevcut protokol, sürecin sonraki aşamalarında ortama APH eklenmesini içerir. Ayrıca, ilk protokole kıyasla farklılaşmanın erken aşamalarında ortamın bileşiminde değişiklikler yapılmıştır. Dikkate değer bir değişiklik, 6. günde Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF) eklenmesi ve 8. güne kadar devam etmesidir. Keratinosit büyüme faktörü (KGF), 6. günden 8. güne kadar verilir ve bu, KGF'nin evre 4 ortamına dahil edilmediği ilk protokol^10'dan biraz farklıdır.

β hücreli hücrelerin oluşumundaki ilk ve temel adım, hPSC'lerin, pankreas da dahil olmak üzere çeşitli organların epitel astarına yol açan ilkel bir germ tabakası olan kesin endoderm'e (DE) yönlendirilmiş farklılaşmasıdır. DE oluşumundan sonra, hücreler ilkel bağırsak tüpüne farklılaşır ve bunu posterior ön bağırsak kaderinin belirlenmesi izler. Posterior ön bağırsak daha sonra endokrin ve ekzokrin hücreler de dahil olmak üzere pankreasın tüm hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahip pankreas progenitör hücrelerine dönüşür. Süreçteki bir sonraki aşama, Langerhans adacıklarında bulunan hormon salgılayan hücrelere yol açan pankreas endokrin progenitörlerini içerir. Sonunda, farklılaşma süreci, tamamen işlevsel pankreas β hücresi benzeri hücreler^üreterek son aşamasına ulaşır ^9,10. Bu işlemin karmaşık olduğunu ve farklılaşmanın etkinliğini ve özgüllüğünü artırmak için spesifik büyüme faktörleri ve hücre dışı matris bileşenleri gibi kültür koşullarının optimizasyonunu gerektirdiğini^{belirtmek önemlidir 9,10}. Ayrıca, in vitro olarak hPSC'lerden fonksiyonel β hücre benzeri hücreler üretmek hala büyük bir zorluktur. Devam eden araştırmalar, farklılaşma protokollerini geliştirmeye ve ortaya çıkan β hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini geliştirmeye odaklanmaktadır⁹.

Bu protokolde, hPSC'lerin kültürü ve geçişi sırasında nazik hücre ayrışmasının kullanılması, hücre canlılığını ve pluripotentliği korumak için esastır ve pankreas β hücrelerine farklılaşma etkinliğini önemli ölçüde artırır. Ek olarak, her aşamaya özgü ortam, insan adacığına çok benzeyen kümelerde yüksek miktarda insülin salgılayan hücre verimini teşvik etmek için Sui L. ve ^ark.10 tarafından geliştirilen protokol izlenerek titizlikle optimize edilmiştir.

Farklılaşmaya başlamadan önce, deneysel amaçlar için gerekli sayıda adacık benzeri organoidin belirlenmesi önerilir. 6 oyuklu bir plakada, %80'in üzerinde birleşmeye sahip tek bir kuyu tipik olarak 2-2,3 milyon hPSC'den oluşur. hPSC hatlarındaki farklılıklar ve farklılaşma verimliliği nedeniyle doğru bir tahmin zor olsa da, kaba bir tahmin, ilk kuyu sayısının 1,5 katıdır. Etkili bir şekilde yönlendirilmiş bir farklılaşma, genellikle altı oyuklu plakalarda oyuk başına 1.6 ila 2 milyon hücre verir ve yalnızca insülin üreten hücrelerden ziyade kümeler içindeki tüm hücreleri kapsar. 50 μm'lik bir küme için, yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde tahmin edilebilir. Tablo 1 , glikoz ile uyarılan insülin sekresyon tamponu ile birlikte, kök hücre matrisi ve ortamının üzerinde yönlendirilmiş farklılaşmanın her günü/aşaması için kullanılan ortam bileşiminin bir özetini sağlar.

1. İnsan pluripotent kök hücrelerinin 6 oyuklu plakalarda farklılaşmadan önce geçirilmesi

NOT: İnsan kök hücrelerinin β hücre benzeri hücrelere farklılaşmadan önce uygun şekilde geçirilmesi, deneysel sürecin oluşturulmasında çok önemli bir adımdır. Yanlış geçiş seyreltmesi veya bağlantı hücre numarası, farklılaşma verimliliğini ve aslına uygunluğu tehlikeye atabilir.

1. Kök hücre kültürü ortamı, kaplama ve ayrışma solüsyonları hazırlayın ( Tablo 1'de belirtildiği gibi).
2. Geçişten 1-2 saat önce, altı oyuklu bir plakayı soğuk kaplama çözeltisi (oyuk başına 1 mL) ile kaplayın ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
3. Kök hücre kültürü ortamının bir kısmını oda sıcaklığında (15-25 °C) 20 dakika ısıtın.
4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 1 mL kalsiyum/magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
5. Adım 1.4'ü tekrarlayın. Iki kez.
   NOT: D-PBS, hücreleri yıkamak ve önceki ortamı ve bileşikleri çıkarmak için eklenir. D-PBS'ye maruz kalmak hPSC'lere zarar vermediğinden, ozmozun neden olduğu hücre yırtılmasını veya büzülmesini önlediğinden, yıkama adımları için belirli bir zaman çerçevesine gerek olmadığına dikkat etmek önemlidir.
6. D-PBS'yi aspire edin, her kuyucuk için 500 μL ayrışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında (15 - 25 °C) 2-5 dakika bekletin.
7. Hücreler ayrışırken, yeni 6 oyuklu plakanın kaplama solüsyonunu aspire edin ve her oyuğa 1-2 mL kalsiyum / magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
8. Ters mikroskop altında ayrışma sürecini düzenli olarak kontrol edin.
9. Hücrelerin% 80 - 90'ı yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma çözeltisini aspire edin.
10. 10 μM ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin.
11. Ayrışmış hücreleri 1.000 μL steril filtreli pipet uçları ve bir P1000 pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
12. Kolonileri kırmak için 1.000 μL steril pipet filtreli uçla hücre süspansiyonunu pipette yavaşça yukarı ve aşağı ezin, ancak 10 katı geçmeyin.
13. Kalan hPSC'lerin ayrılmasına yardımcı olmak için ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mL konik tüpe aktarın (1.10).
14. D-PBS'yi yeni kaplanmış plakadan aspire edin ve hemen 15 mL'lik konik tüpten hücre süspansiyonunu ekleyin. Optimum hücre büyümesini sağlamak için, 6 oyuklu bir plaka (10'da 1 ila 50'de 1) kullanırken oyuk başına 2 x 10^5-1 x 10⁶ canlı hücre aralığını tohumlayın.
    NOT: Hacim hesaplaması için, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu, ROCK inhibitörlü 2 mL kök hücre ortamı içermelidir.
15. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 5 - 10 kez yan yana hareket ettirin.
16. Plakayı 37 °C'de, %5_CO2 inkübatörde 24 saat yerleştirin.
17. Ertesi gün ROCK inhibitörü içermeyen taze kök hücre besiyeri ile değiştirin ve daha sonra hPSC'lerin birleşmesi% 80 - 95'e ulaşana kadar her 2 günde bir.

2. İnsan kök hücresi kaynaklı β hücrelerine yönelik farklılaşma

NOT: hPSC'ler,% 80-95 birleşme sağlandığında pankreas β hücrelerine doğrudan farklılaşma işlemi için kullanılabilir.

1. Gün -1: Hücrelerin geçişi Farklılaşmanın -1. günü:
   1. Geçişten 1-2 saat önce, 6 oyuklu bir plakayı 37 °C,% 5_CO2 inkübatörde 1 saat boyunca soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın.
   2. 1.1'den 1.10'a kadar olan adımları izleyin ve hücreleri saymaya devam edin.
   3. 10 μL hücre karışımı yükleyin, eşit hacimde Tripan Mavisi ekleyin ve hafifçe karıştırın.
   4. Hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Kaplanmış 6 oyuklu plakayı oyuk başına 2 mL ortam ile kaplamak için 10 μM ROCK inhibitörü içeren 0.8 × 10 6 hücre / mL - 1.0 x 10⁶ hücre / mL kök hücre ortamı kullanın.
   5. Plakayı üç kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   6. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 10 kez tekrar yan yana hareket ettirin. Ardından plakayı 4 saat inkübe edin.
      NOT: İnkübatöre yerleştirildikten sonra plakayı hareket ettirerek hücrelerin maksimum bağlantısının ve eşit dağılımının hücreleri rahatsız etmediğinden emin olun. İnkübatörü çok dikkatli bir şekilde açın ve kapatın.
   7. Bazal ortam şişesini 0 ila 4. günler için 4 ° C'de gece boyunca eritmek için yerleştirin.
2. Gün 0
   NOT: hPSC'ler %80 - 95 birleşim şeklinde olmalıdır, bu birleşim altında kesin endoderm için farklılaşma sürecini başlatmayın.
   1. Buz üzerinde, hem 0 ila 4. günler için bazal ortamı hem de takviyeleri çözün (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. İki konik tüpte sadece 1. günde kullanılacak gerekli hacmi hazırlayın (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve ayrı bir tüpte, 2.5 ila 4. gün için hacmi iki katına çıkarın (2 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 x 6 mL). Gün 2.5 ila Gün 4 ortamını 4 °C'de saklayın.
   3. Gün 1 ortamı ve yıkama ortamı 1'in gerekli hacminde bir alikotu 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın.
   4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
      NOT: Protokolde kullanılan yıkama besiyeri, %1 antibiyotik ile desteklenmiş, her güne/evreye özgü bazal besiyerinden oluşur. Doğrudan farklılaştırma protokolünün yıkama adımları, yalnızca belirtilen yıkama ortamının ("yıkama ortamı 1 veya 2", Malzeme Tablosu olarak anılır) eklenmesini ve ardından açıklanan prosedür 2.2.4'ü izleyerek aspirasyonu içerir. Bu yıkama adımları için belirtilen belirli bir zaman dilimi olmadığını belirtmek önemlidir.
   5. Yıkama ortamı 1'i aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL Gün 1 ortamı ekleyin.
   6. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO₂ 'de 24 saat inkübe edin.
3. 1. Gün
   1. 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca gerekli hacimde 2,5 ila 4 orta miktarda bir alikotu önceden ısıtın.
   2. Gün 1 ortamını aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2.5 ila 4 orta günün 2 mL'sini ekleyin. Hücreleri yıkamayın.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
4. Günler 2,5 ila 4
   1. Günün kalan hacminin bir kısmını 2,5 ila 4 orta boy 37 °C su banyosunda 5 dakika önceden ısıtın.
   2. Ortamı aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL taze hazırlanmış Gün 2.5 ila 4 orta ekleyin.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
5. 4. Gün
   NOT: Bu aşamada, kesin endoderm belirteçlerinin ekspresyonu maksimumdadır ve hücreler ilkel bağırsak tüpü farklılaşmasını başlatabilir.
   1. 4. Gün ilkel bağırsak aşaması ortamının (altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) gerekli hacminin bir alikotunu hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. Aspire Günleri 2,5 ila 4 orta ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
   3. Yıkama ortamını 1 aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 4. gün ilkel bağırsak aşaması ekleyin.
   4. Plakayı 48 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
6. 6 ila 8. Günler
   NOT: Bu aşamada, hücreler posterior ön bağırsak kaderi üzerinde daha fazla farklılaşma başlatır.
   1. Gerekli hacim 6 ila 8 posterior foregut ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 4. Gün ortamını aspire edin ve hemen kuyunun kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 48 saat boyunca% 5 CO₂ içeren 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
7. 8 ila 12. Günler
   NOT: Hücreler pankreas progenitörlerinin farklılaşmasına hazırdır.
   1. Gerekli hacim 8 ila 12 gün pankreas progenitörleri sahne ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 6 ila 8 orta günleri aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca %5_CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.
8. 12. Gün: Kümeleme adımını gerçekleştirme
   NOT: Bu aşamada, hücreler yoğun bir tek tabaka oluşturur ve kümeler oluşturmak için 3D hücre kültürüne geçirilir. Bu adım, β benzeri hücrelerin doğal insan adacıklarına yapısal benzerliğini arttırmak için farklılaşma için çok önemlidir, ancak aynı zamanda hem hücresel hem de küme seviyelerinde işlevsel benzerliklerini geliştirir¹¹ (Şekil 1).
   1. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2 mL yapışma önleyici durulama solüsyonu ile 400 μm'lik mikro kuyular içeren 6 oyuklu bir plakaya (Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi: İnsan Kök Hücresinden Kaynaklı β Hücreler Yönlendirilmiş Farklılaşma, Gün 12) muamele edin.
      NOT: Mikro kuyu, hücrelerin kuyu dibine yapışmasını önler ve 3D kümelerin mekanik oluşumunu kolaylaştırır.
   2. Santrifüj plakasını 1.300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Ters mikroskop altında herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Kabarcık gözlenmezse, yapışma önleyici durulama solüsyonunu aspire edin ve hemen 2 mL yıkama ortamı 2 ekleyin (Malzeme tablosu).
   4. Adım 1.8.3'ü tekrarlayın. iki kez.
   5. Küme ortamının gerekli hacmini hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 -25 °C) 20 dakika ısıtın. 6 oyuklu bir plakanın iki oyuğunun, 4 mL küme ortamı ile 400 μm mikro kuyulu 6 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna girdiğinden emin olun.
   6. Pankreas progenitör ortamını aspire edin ve ayrışma tamponu ekleyin (oyuk başına 0.5 mL).
   7. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2-5 dakika inkübe edin. Ayrışma sürecini ters çevrilmiş bir mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin ve hücrelerin çoğu yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma tamponunu aspire edin.
   8. Ayrışma tamponunu aspire edin ve hemen her oyuğa 1 mL küme ortamı ekleyin.
   9. P1000 pipet ve 1.000 μL filtre uçları kullanarak altı kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın.
   10. Hücreleri ve küme ortamı karışımını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   11. Kalan tüm hücreleri toplamak için 1 mL küme ortamı ekleyin.
   12. Küme ortamını gereken toplam hacme ekleyin, böylece mikro kuyu plakasının her bir oyuğu 4 mL karışım kümesi ortamına/hücrelerine sahip olur.
   13. Yıkama ortamını 2 mikro kuyulu 6 oyuklu plakadan aspire edin ve hücre süspansiyonunu aktarın. Plakayı 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
9. 13. Gün: Kümelenme sonrası hücrelerin ele alınması ve 13. günden itibaren ortamlarının değiştirilmesi.
   NOT: Kümeler son derece hassastır ve sonraki günlerde bütünlüklerini ve yaşayabilirliklerini sağlamak için dikkatli bir şekilde ele alınmaları gerekir. Bu nedenle, 12. günden sonraki kümelenme sonrası dönemde kümeleri yakından izlemek çok önemlidir. Deneysel süreçte başarılı sonuçları teşvik etmek için düzenli değerlendirme ve ayarlamalar şarttır.
   1. Gerekli hacimde 13 gün ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve 15 ila 20 pankreas endokrin progenitör ortamı için 50 mL'lik ayrı bir konik tüpte hazırlayın.
   2. Bir p1000 pipet ve 1.000 μL filtrelenmiş uçlar kullanarak mikro kuyu 6 oyuklu plakadan kümeleri 50 mL'lik bir konik tüpe yavaşça toplayın.
   3. Kalan kümeleri toplamak ve kümeleri tüpe aktarmak için 1 mL Gün 13 ortamı ekleyin.
   4. Hücrelerin yerçekimi altında 5 dakika boyunca konik tüpün dibine doğal olarak oturmasına izin verin.
   5. Hücre kümelerini bozmadan tüpten mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin. Pipet uçları kümelere dokunmamalı veya aspire etmemelidir, sadece süpernatanta dokunmalıdır.
   6. Aşağıdakilere göre gerekli Gün 13 ortamı hacmini ekleyin: 1 kuyucuklu mikro kuyu 6 oyuklu plaka, düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakanın (oyuk başına 2 mL ortam) üç kuyucuğuna gider.
   7. Aspirasyon kümelerinden kaçınarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   8. Süspansiyonu çok düşük yapışan 6 oyuklu bir plakaya aktarın.
   9. Plakayı altı kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   10. Plakayı 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
   11. Bu bölüm 2.9'da açıklandığı gibi, farklılaşmanın sonuna kadar sonraki tüm adımlarda ortam değişikliklerini gerçekleştirin.
10. 15 - 20. Günler
    1. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe toplayarak ve 13. gün için 2.9.4 ila 2.9.10 arasındaki adımları izleyerek, farklılaşmanın 21. gününe kadar her 48 saatte bir pankreas endokrin progenitör evre ortamına geçin.
11. 21-27. Günler
    NOT: Bu aşamada, kümeler pankreas β hücrelerine farklılaşır.
    1. Pankreas β hücreli aşama ortamını hazırlayın.
    2. Ortamı 15 ila 21. günler için açıklandığı gibi iki günde bir değiştirin.
       NOT: 25. günden sonra, adacık benzeri organoidler, tamamen işlevsel olduklarını doğrulamak için analize tabi tutulabilir.

3. Pankreas β hücreli kümelerin boyanması

NOT: Farklılaşma sonrası kümelerin işlevsel değerlendirmesini incelemek için bu adımı gerçekleştirin

1. Farklılaşmanın sonunda 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde beş ila on küme toplayın.
2. Hücre kümelerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin.
3. Kümelere 1 mL PBS ekleyin ve kümeleri bozmadan 1.000 μL'lik bir pipet ucuyla PBS'yi çıkarın.
4. Kümelere 200 μL %30 sükroz ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Kümeleri bir kriyokalıba aktarın, fazla sakkarozu çıkarın, bir damla OCT ortamı ekleyin ve kümeleri OCT ortamı ile karıştırın.
6. Cryomold'u kuru buz üzerinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
7. Bir mikrotom/veya kriyostat kullanarak mikroskop lamları üzerindeki donmuş bloktan 5 μm'lik kesitler kesin.
8. Slaytları lekelenene kadar -80 °C dondurucuda saklayın.
9. Boyama gününde slaytları -80 °C dondurucudan çıkarın.
10. Kriyo kalıbın bölümlerinin etrafındaki buzu dikkatlice çıkarın.
11. Hücre kümelerini hidrofobik bir kalemle slaytlar üzerinde daire içine alın.
12. Slaytları PBS içeren bir slayt boyama kavanozunda 15 dakika boyunca rehidre edin.
13. Slayt boyama kavanozuna soğuk metanol ekleyin ve sürgülü kavanozu -20 °C'de 10 dakika bekletin.
14. Slaytları bir PBS kavanozuna daldırın.
15. Adım 3.14'ü üç kez tekrarlayın.
    NOT: Aşağıdaki tüm yıkama adımları için bu yöntemi kullanın.
16. PBS'yi slaytlardan çıkarın ve PBS-T'de %2-5 BSA içeren 100 μL engelleme solüsyonu ile hemen kapatın.
17. Her slayta engelleme solüsyonu ekleyin ve parafin filmle örtün.
18. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 1 saat inkübe edin.
19. Reaktifler ve Çözeltiler bölümünde verilen oranları kullanarak bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin.
20. Engelleme çözümünü slaytlardan çıkarın.
21. Hemen seyreltilmiş antikorlar ekleyin ve slaytın kurumasını önlemek için slaytları parafilm ile örtün.
22. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
23. Ertesi gün slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
24. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası hazırlayın.
25. Slaytlardan fazla PBS-T'yi çıkarın.
26. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası ekleyin. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 45 dakika inkübe edin.
27. Slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
28. Slaytlardaki sıvıyı çıkarın.
29. Her bölüme bir damla histoloji montaj ortamı ekleyin.
30. Slaytı bir cam kapakla örtün.
31. Floresan mikroskobu kullanarak lekeli slaytların fotoğraflarını çekin.

4. GSIS (glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu testi)

1. Üç farklı çözelti hazırlayın: düşük glikozlu KREBS çözeltisi, yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ve KCl'li düşük glikozlu KREBS çözeltisi.
2. Tüm çözeltileri 37 °C su banyosunda ısıtın.
3. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak benzer büyüklükte yaklaşık 10 - 15 kümeyi dikkatlice seçin ve kümelerin kurumasını önlemek için bunları az miktarda farklılaştırılmış ortamla birlikte 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Kümeler çıplak gözle görülebilmelidir, ancak değilse, kümeleri seçmek ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için farklılaşmış kümeler içeren plakayı ters mikroskop altına yerleştirin.
4. Tüpü kümeler ve ortam ile bir tüp rafına yerleştirin ve kümelerin tüpün dibine batmasını bekleyin.
5. 200 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı yavaşça aspire edin ve 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin.
6. Adacıkları düşük glikoz çözeltisinde 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Deneylerde küme sayılarının ve tutarlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için, tüpe yapışma eğiliminde olduklarından, aktarım sırasında çözeltideki tüm kümelerin varlığının kontrol edilmesi önerilir.
7. Tüpü inkübatörden çıkarın ve herhangi bir küme aspire etmeden 200 μL KREBS çözeltisini yavaşça aspire edin.
8. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
9. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisinin hacmini 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
10. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
11. 200 μL yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
12. 200 μL yüksek glikozlu KREBS'yi 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümü için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
13. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
14. 200 μL KCl KREBS çözeltisi ekleyin ve ayrı tedaviler için tekrarlayın.
15. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
16. 200 μL KCl KREBS solüsyonunu 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Diğer tedaviler için tekrarlayın.
17. 50 μL ultra saf su ekleyin ve toplam insülin içeriğini ölçmeye devam edin.
18. Adacıklar ve ultra saf su ile tüpe 150 μL asit etanol çözeltisi ekleyin.
19. Numuneleri gece boyunca (12 - 15 saat) 4 °C'de saklayın.
20. Ertesi gün, her numuneyi girdaplayın.
21. Adacık dokusunun tamamen parçalanmasını sağlamak için 1 saniye boyunca% 20 güce ayarlanmış bir elektrik sonikatörü ile sonikasyon gerçekleştirin.
    NOT: Görünür küme kalmayana kadar 4.21 adımını yineleyin.
22. Tüm numuneleri 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı saklayın.
23. Daha sonra insülin ölçümlerini normalleştirmek için kullanılabilecek bir nanodrop spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.

Bu yazıda açıklanan protokol, β benzeri hücreleri hPSC'lerden10 ayırt etmek için oldukça verimli bir yaklaşım sunar. Bu süreç, kolayca ölçeklendirilebilen bir 2D kültür sistemi kullanır ve farklılaşmayı öğrenme, daha küçük projeler ve laboratuvarlar ve bir iPSC hattının farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için pilot testler gibi çeşitli deneysel ortamlarda kullanılmasını sağlar.

Glikoz homeostazı hakkında fikir edinmek için adacıklardaki farklılaşmış β hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek esastır. Bu tipik olarak, β hücre belirteçleri ve insülin ekspresyonu için immün boyama gibi çeşitli deneylerin yanı sıra, düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak adacık işlevini test eden glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testleri yoluyla elde edilir 12,13. β hücreleri, β hücre kimliğini oluşturmak ve sürdürmek için kritik olan Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 ve Neurod1 dahil olmak üzere imza genlerine sahiptir9. İmmün boyama teknikleri, doku kesitleri içinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştırmak için değerlidir. β hücreli belirteçler için immün boyama, temel pankreas soy belirteçlerinin ekspresyon seviyelerini değerlendirebilir ve farklılaşma sürecinin aslına uygunluğu ve belirli uygulamalar için optimizasyonu hakkında içgörüler sağlayabilir 9,12.

Bu çalışmada, insan doğal adacıklarında bulunanlara benzeyen β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerini içeren kümeleri ayırt etmek için Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC raportör hattı kullanıldı. Bu belgedeki Şekil 2 , farklılaşma sürecinin verimliliği ve doğruluğu ile ilgili önemli bulgular sunmaktadır. Sonuçlar, pankreas soyu içinde insülin eksprese eden hücrelerin yüksek oranda zenginleştiğini ve bu hücrelerin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu sergilediğini göstermektedir. Bu, farklılaşma süreci boyunca fonksiyonel β benzeri hücrelerin başarılı bir şekilde üretildiğini gösterir.

Farklılaşmış hücreler düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonları ile uyarıldı ve GSIS sonuçları, Mel1 hücrelerinden türetilen kümelerin, glikoza insülin sekresyonu yanıtlarında adacıklara benzer şekilde işlev gördüğünü gösterdi. Mel1'den türetilen kümelerin, düşük glikoz konsantrasyonlarına kıyasla yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 100 kat daha fazla insülin salgıladığı bulundu. Spesifik olarak, insülin içeriği 3.3 mM düşük glikozda %0.003 ± %0.002 ve 16.7 mM yüksek glikozda %0.236 ± %0.197 idi.

Mel1 INS-GFP hESC'lerden türetilen kümeler, GSIS testine ek olarak bileşimlerini ve işlevselliklerini belirlemek için daha fazla analize tabi tutuldu. Spesifik olarak, β hücreli imza genlerinin ekspresyonu ve kümeler içinde farklı hücre tiplerinin varlığı araştırıldı. Sonuçlar, bu işlemden elde edilen pankreas soyunun insülin pozitif hücrelerde yüksek oranda zenginleştirildiğini gösterdi, bu da hESC'lerin β hücre benzeri hücrelere farklılaşma sürecinde yüksek düzeyde başarı olduğunu gösterdi. Ayrıca, β hücreli kimliklerin kurulması ve sürdürülmesi için önemli olan Nkx6.1 ve Pdx1 gibi imza genlerinin ekspresyonu incelenmiştir. Analiz, hücrelerin yaklaşık% 25 ve% 40'ının sırasıyla Nkx6.1 ve Pdx1'i eksprese ettiğini ortaya koydu ve kümelerin farklılaşmış β benzeri hücreler içerdiğine dair ek kanıtlar sağladı (küme başına ortalama Nkx6.1+ hücreleri% 24.9 ±% 6.2, n = 9 küme, Pdx1+ hücreleri% 40.2 ±% 6.2, n = 9, SEM, Şekil 2). Ek olarak, kümeler, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık% 15'ini oluşturan glukagon pozitif hücreler gibi diğer hücre tiplerini içeriyordu. Bu hücreler tipik olarak Langerhans'ın doğal adacıklarının alfa hücrelerinde bulunur, bu da kümelerin hücre bileşimi açısından insan adacıklarına çok benzediğini düşündürür.

Şekil 1: hPSC'lerin pankreas β hücrelerine doğru farklılaşması. (A) Şematik gösterimi in vitro hPSC'lerin pankreas β hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması, altı ardışık aşamayı içerir: kesin endoderm indüksiyonu, ilkel bağırsak tüpü oluşumu, posterior ön bağırsak kader spesifikasyonu, pankreas progenitör üretimi, pankreas endokrin progenitör oluşumu ve nihayetinde pankreas β hücre farklılaşması. Pankreas β hücre farklılaşması, belirli zamanlarda belirli hücre sinyal yollarının düzenlenmesi ile insan adacık gelişiminin temel aşamalarını kullanır. B27: B-27 Eki; Ri: rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü veya ROCK inhibitörü; T3: tiroid hormonu; KGF: insan KGF / FGF-7 proteini; RepSox: Aktivin / Nodal / TGF-β yolu inhibitörü; ALK5'i inhibe eder; RA: Retinoik asit; ZS: çinko sülfat; UFH: fraksiyone edilmemiş heparin; XX: gama-Sekretaz İnhibitörü XX; APH: afidikolin; EGF: epidermal büyüme faktörü; LDN: BMP İnhibitörü III, LDN-212854; Siklo: Siklopamin- KAAD. (B) Pluripotent kök hücrelerden pankreas β hücrelerine farklılaşmanın çeşitli aşamalarında yakalanan hücresel morfoloji görüntüleri. İlk görüntü, farklılaşmanın ilk gününde insan pluripotent kök hücrelerini göstermektedir (HPSC'lerin tek tabakası). (C) 11. günde, hücreler pankreas progenitör aşamasındadır. 100 μm'lik ölçek çubuğu. (D) 12. günde, pankreas progenitör aşamasında hücrelerin ayrışmasından sonra 6 oyuklu plakanın mikro kuyularında kümeler oluşur. (E) 13. günde, kümeler düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakadadır. 100 μm'lik ölçek çubuğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farklılaşmış Mel1 InsGFP/w hESC raportör hattı14'ten elde edilen kümeler, β hücre olgunluk belirteçlerini eksprese eden insülin üreten hücrelerin varlığı açısından değerlendirildi. (A) Kümelerin immünofloresan görüntüleri, glukagon üreten hücrelere (yaklaşık% 15) kıyasla insülin üreten hücrelerin (yaklaşık% 60) baskınlığını ortaya çıkaran dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak kriyokalıp kesitlerinden (5 μm) yakalandı (n = 9 küme, yaklaşık 18.000 hücre, SEM). (B) Kümelerin immünofloresan görüntüleri, pankreas β hücresi belirteçleri Nkx6.1'i birlikte eksprese eden insülin üreten hücrelerin baskınlığını gösteren dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak kriyokalıp kesitlerinden (5 μm) elde edildi (n = 9 küme, yaklaşık 18.000 hücre). (C) İnsülin pozitif, glukagon pozitif ve β hücreli belirteçler Nkx6.1 pozitif hücrelerin ve β hücreli belirteçler Pdx1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için belirteçlerin immün boyanması için özel olarak tasarlanmış ImageJ hücre sayacı makrosu kullanıldı. (D) Farklılaşmış kümelerde (n=9, SEM) yüksek glikoz stimülasyonuna (16.7mM glikoz) yanıt olarak 100 kat artış gösteren Mel1 InsGFP/w hESC türevi kümelerin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yönlendirilmiş farklılaşma için medya kompozisyonunun özeti. Bu tablo, glikoz ile uyarılan insülin sekresyon tamponu ile birlikte kök hücre matrisi ve ortamının üzerinde yönlendirilmiş farklılaşmanın her günü/aşaması için kullanılan ortam bileşiminin bir özetini sağlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

The successful differentiation of hPSCs into pancreatic β-cells depends on optimizing all aspects of routine culturing and passage of the selected hPSCs. This includes ensuring that the cell line has a normal karyotype, is negative for mycoplasma infection, and is free of plasmid or viral vector genomes. Furthermore, when using hiPSCs, it is important to avoid using the earliest passage which are still undergoing reprogramming, for pilot experiments. These experiments should be conducted on a small scale to identify the hPSC line with the best differentiation potential and the optimal number of passages.

Other parameters that can influence differentiation efficiency include the quality of the stem cell medium used, the coating density, and the number of passages^10,12. This protocol has been optimized to maximize the efficiency of differentiation by ensuring that all relevant parameters are optimized¹⁰.

Differentiation media with specific formulations are used at each stage to support the differentiation of hPSCs into β-cells. Activin A and a Wnt agonist are used in the differentiation medium to initiate the transition to definitive endoderm cells. During the primitive gut tube stage, KGF is added to the medium to promote further differentiation into β-cells¹⁵, and this inclusion of KGF is maintained from day 6 to 8, differing from the original protocol by Sui, Egli, et al.¹⁰. During the pancreatic progenitor stage, the specific media composition is optimized to enhance the expression of the Pdx1 transcription factor. This is achieved by using a high concentration of retinoic acid (RA), KGF, and LDN193189, which inhibits the bone morphogenetic protein (BMP) pathway⁸. As the differentiation progresses to the endocrine stage, the culture medium is modified to downregulate Notch signaling. This is achieved by incorporating XXI, a γ-secretase inhibitor, along with T3 (thyroid hormone), RA, and RepSox, an inhibitor of the Activin/BMP/TGF-β pathway⁸. This specific combination of compounds is used to promote the differentiation of pancreatic progenitors into endocrine progenitors. Finally, to optimize the direct differentiation process, aphidicolin (APH) is introduced during the differentiation from pancreatic progenitors into endocrine progenitors. This addition of APH aims to further enhance β-cell differentiation, and it represents a distinct modification from the initial protocol proposed by Sui, Egli, et al.^10,11.

During the differentiation process, it is crucial to monitor cell density and prevent over-confluence, as this can hinder proper differentiation. High-density cultures can maintain high Oct4 expression, inhibiting differentiation to definitive endoderm. Removing the ROCK inhibitor during the first washing step is essential for initiating differentiation and allowing the pluripotent state of hPSCs to be altered. Using a fluorescence marker, such as Mel1 INS-GFP with a GFP integrated at the insulin locus, facilitates the assessment of differentiation progress at the pancreatic progenitor and β-cell stages, aiding downstream experiments¹⁴.

The current protocol for differentiating human pluripotent stem cells into pancreatic β-like cells has demonstrated variability in efficiency among different hPSC lines¹⁰. Additionally, the resulting β-like cells exhibit functional immaturity compared to human pancreatic islets, showing lower insulin secretion per cell. To address this limitation further, in vivo maturation of β-like cells can be achieved by transplantation of islet organoids into animal models during the final stages of differentiation^6,7.

Despite these limitations, the differentiation of hPSCs into pancreatic β-cells has significant potential with respect to existing methods^8,9,10. This technique allows to produce large numbers of β-cell-like cells that are responsive to glucose and express β-cell markers (Pdx1 and Nkx6.1, see Figure 2). This is done without the ethical, technical, and source limitations associated with the use of human pancreatic islets. In addition, this technique has the potential to be applied to personalized medicine, as patient-specific β-cells can be generated for drug testing and disease modeling^4,6,7. The technique may also have future applications in treating diabetes that involve the loss or dysfunction of pancreatic β-cells^4,6,7.