Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) her tür hücreye farklılaşabilir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerinin mükemmel bir alternatif kaynağı haline getirir. hPSC'ler, blastosistten türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) veya bir yeniden programlama işlemi kullanılarak doğrudan somatik hücrelerden üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler) olabilir. Burada, farklılaşmadan ve daha sonra insülin üreten pankreas hücrelerinin oluşturulmasından önce hPSC'ler için optimal kültür ve geçiş koşullarını ana hatlarıyla belirtmek için video tabanlı bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hPSC'lerin kesin endoderm (DE), ilkel bağırsak tüpü, posterior ön bağırsak kaderi, pankreas progenitörleri, pankreas endokrin progenitörleri ve nihayetinde pankreas β hücrelerine farklılaştığı β hücreye yönelik farklılaşma için altı aşamalı süreci takip eder. Bu farklılaşma metodolojisinin insan pankreas β hücrelerini oluşturmak için 27 günlük bir süre alması dikkat çekicidir. İnsülin sekresyonunun potansiyeli, immün boyama ve glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu içeren iki deneyle değerlendirildi.
Giriş
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), çeşitli hücre tiplerine farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerine uygun bir alternatif haline getirir1. Bu hPSC'ler iki tipe ayrılır: blastosist2'den türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) ve somatik hücrelerin doğrudan yeniden programlanmasıyla üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler)3. hPSC'leri β hücrelere ayırma tekniklerinin geliştirilmesi, hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir 1,4<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Farklılaşmaya başlamadan önce, deneysel amaçlar için gerekli sayıda adacık benzeri organoidin belirlenmesi önerilir. 6 oyuklu bir plakada, %80'in üzerinde birleşmeye sahip tek bir kuyu tipik olarak 2-2,3 milyon hPSC'den oluşur. hPSC hatlarındaki farklılıklar ve farklılaşma verimliliği nedeniyle doğru bir tahmin zor olsa da, kaba bir tahmin, ilk kuyu sayısının 1,5 katıdır. Etkili bir şekilde yönlendirilmiş bir farklılaşma, genellikle altı oyuklu plakalarda oyuk başına 1.6 ila 2 milyon hücre verir ve yalnızca insülin üreten hücrelerden ziyade kümeler içindeki tüm hücreleri kapsar. 50 μm'lik bir küme için, yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde tahmin edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yazıda açıklanan protokol, β benzeri hücreleri hPSC'lerden10 ayırt etmek için oldukça verimli bir yaklaşım sunar. Bu süreç, kolayca ölçeklendirilebilen bir 2D kültür sistemi kullanır ve farklılaşmayı öğrenme, daha küçük projeler ve laboratuvarlar ve bir iPSC hattının farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için pilot testler gibi çeşitli deneysel ortamlarda kullanılmasını sağlar.
Glikoz homeostazı hakkında fikir edinmek için adacıklardaki farklılaşmış β hücrelerinin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
hPSC'lerin pankreas β hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaşması, rutin kültürlemenin ve seçilen hPSC'lerin geçişinin tüm yönlerinin optimize edilmesine bağlıdır. Bu, hücre hattının normal bir karyotipe sahip olmasını, mikoplazma enfeksiyonu için negatif olmasını ve plazmit veya viral vektör genomlarından arınmış olmasını sağlamayı içerir. Ayrıca, hiPSC'leri kullanırken, pilot deneyler için hala yeniden programlanmakta olan en eski pasajı kullanmaktan kaçınmak önemlidir. Bu deneyler, en iyi farklılaşma potansiyeline .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Ines Cherkaoui, Araştırmacı Ödülü için Wellcome Trust'a (212625/Z/18/Z), Program hibesi için UKRI MRC'ye (MR/R022259/1), Proje hibesi için Diabetes UK'ye (BDA16/0005485), başlangıç fonları için CRCHUM'a, John R. Evans Lider Ödülü için Innovation Canada'ya (CFI 42649) teşekkür eden GAR'a Diabetes UK öğrenciliği (BDA 18/0005934) tarafından desteklendi. Proje hibesi için NIH-NIDDK (R01DK135268) ve ekip hibesi için CIHR, JDRF (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-SN). Camille Dion ve Dr Harry Leitch, insan hiPSC'lerinin üretimi ve kültürüne yardımları için, NIHR Imperial BRC (Biyomedikal Araştırma Merkezi) Organoid tesisi, Londra.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL TubeOne Mikrosantrifüj Tüpü | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6 oyuklu Hücre kültürü plakası | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6 oyuklu plaka | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ | 34425 | |
| Anti-glukagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Anti-İnsülin | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biyolojikler | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
| B-27 Takviyesi (50X), serum içermez | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Sığır Serumu Albümini, yağ asidi içermez | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Kalsiyum klorür dihidrat | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Kalsiyum / Magnezyum içermeyen D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Siklopamin-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D - (+) - Glikoz, BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Disodyum hidrojen fosfat, susuz | Sigma-Aldrich | 94046-100ML-DMEM | |
| artı GlutaMAX | Thermo Fisher Yıkama | 10566016 | 2: DMEM artı GlutaMAX %1 PS. |
| DMEM/F-12 (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Epredi SuperFrost Plus Yapışma slaytları | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Etanol | VWR | 20821.33 | |
| Fetal Sığır Serumu | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Gama-Sekretaz İnhibitörü XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Thermo | Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1'i soğuk DMEM/F-12 ortamına 1:100'lük bir nihai seyreltme sağlamak için bastırın. |
| Keçi Anti-Gine domuzu, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Keçi Anti-Gine domuzu, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Keçi anti-Fare İkincil Antikoru, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Keçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikoru, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| HEPES tamponu | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, Trihidroklorür | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| İnsan FGF-7 (KGF) Rekombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Hidrojen klorür | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP Kalem | Agar Bilimsel | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Magnezyum klorür hekzahidrat | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Bileşiği 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS Tabletleri, Fosfat Tamponlu Salin, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Penisilin-Streptomisin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Rekombinant İnsan EGF Proteini | R & D Systems | 236-EG-200 | |
| Dikdörtgen kapaklı camlar, 22&/kez; 50 mm | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (Hidroklorür) | STEMCELL Teknolojileri | 72394 | |
| RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | 1: RPMI 1640 artı GlutaMAX %1 PS. |
| Shandon Bağışıklık Montajlı | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodyum dihidrojen fosfat susuz | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm ve nbsp; | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | StemFlex Supplement'i gece boyunca 4 ° C'de çözdürün; C, takviye şişesinin kalan sıvısını StemFlex Basal Medium'a aktarın. |
| Stemolekül All-Trans Retinoik Asit | Reprocell | 04-0021 | |
| Tiroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| TripL Ekspres Enzim (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Süspansiyon Kültürü için Ultra Düşük Yapışma Plakası | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (Dihidroklorür) | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ | 72302 | |
| Çinko Sülfat | Sigma-Aldrich | Z4750 |
Kaynaklar
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
