RGBradford: Akıllı Telefon Kamerası ile Protein Kantitasyonu

Özet

Bu makale, Bradford tahlili ve analitik bir cihaz olarak bir akıllı telefon kullanarak protein miktar tayini için bir protokol sağlar. Numunelerdeki protein seviyeleri, bir akıllı telefonla çekilen bir mikroplaka resminden çıkarılan renk verileri kullanılarak ölçülebilir.

Özet

Protein miktarı, yaşam bilimleri araştırmalarında önemli bir prosedürdür. Diğer birçok yöntem arasında, Bradford testi en çok kullanılanlardan biridir. Yaygın olması nedeniyle, Bradford testinin sınırlamaları ve avantajları, performansını artırmak için orijinal yöntemin çeşitli modifikasyonları da dahil olmak üzere kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir. Orijinal yöntemin değişikliklerinden biri, analitik bir araç olarak bir akıllı telefon kamerasının kullanılmasıdır. Bradford tahlili koşullarında var olan Coomassie Brilliant Blue boyasının üç formundan yararlanan bu makale, bir mikroplakanın tek bir resminden çıkarılan renk verilerini kullanarak numunelerdeki proteinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini açıklamaktadır. Testi bir mikroplakada gerçekleştirdikten sonra, bir akıllı telefon kamerası kullanılarak bir resim çekilir ve ücretsiz ve açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı uygulaması kullanılarak resimden RGB renk verileri çıkarılır. Daha sonra, standart bir eğriye dayalı olarak protein içeriğini hesaplamak için bilinmeyen protein konsantrasyonlarına sahip numunelerin mavinin yeşile oranı (RGB ölçeğinde) kullanılır. RGB renk verileri kullanılarak hesaplanan değerler ile geleneksel absorbans verileri kullanılarak hesaplanan değerler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.

Giriş

Aşağı akış kullanımından bağımsız olarak (örneğin, ELISA, enzim kinetiği, western blotlama, protein saflaştırma ve kütle spektrometresi), yaşam bilimleri laboratuvarlarında doğru analiz için protein miktar tayini çok önemlidir. İkincil okumalar olarak kullanımlarına ek olarak (yani, protein kütlesi başına analitlerin nispi seviyelerini hesaplamak için), bir numunedeki protein seviyeleri de istenen çıktının kendisi olabilir. Örneğin, gıda kaynakları¹ veya idrar^2'deki protein seviyeleri ile ilgilenilebilir. Doğrudan UV absorbans okumaları 4, protein-bakır şelasyonu ^5,6, protein boyası bağlayıcı kolorimetrik deneyler 7 ve protein boyası bağlayıcı floresan deneyleri 8 dahil olmak üzere numunelerde³ protein konsantrasyonunu ölçmek için birçok yöntem mevcuttur. Protein kantitasyonunun önemi, en çok alıntı yapılan literatürün ^5,7'ünde protein ölçüm yöntemlerini^5,7 açıklayan iki makalenin^{varlığıyla} kanıtlanmıştır ^9,10. Birçok yazarın birincil olmayan referanslara atıfta bulunarak veya hiçbir şeyden alıntı yapmayarak gerçek alıntılarını ihmal etmesine rağmen, Lowry protein tahlilini ve Bradford protein tahlilini açıklayan orijinal makalelerin her^{biri 10} >200.000 alıntıdır.

Bradford testinin popülaritesi, satın alınabilirliğinden, basitliğinden, hızından ve hassasiyetinden kaynaklanmaktadır. Test, asidik koşullar altında proteinler ve Coomassie Brilliant Blue G boyası arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Tahlil koşulları altında (yani, düşük pH), boya üç şekilde bulunur: λ ile kırmızı katyonik formmaks 470 nm'de; λmax 650 nm'de yeşil nötr bir form; ve λ ile mavi anyonik formmaks 590 nm ^11,12'de (Şekil 1). Katyonik form, proteinlerin yokluğunda baskındır. Proteinler boya ile etkileşime girdiğinde, mavi anyonik formu stabilize ederek çözeltinin renginde kahverengimsiden maviye gözle görülür bir değişikliğe neden olurlar. Genellikle, boyanın mavi formunun konsantrasyonundaki değişiklik, 590-595 nm'deki absorbansı tahlildeki protein miktarı ile orantılı olan spektrofotometrik olarak ölçülür.

Şekil 1: Bradford testi koşulları altında Coomassie parlak mavi G absorpsiyon spektrumları. Üç ana tepe noktası, boyanın kırmızı (470 nm), yeşil (650 nm) ve mavi (590 nm) formlarının λmax'ını gösteren oklarla işaretlenmiştir. Spektrumlar, protein yokluğunda (sarı çizgi) ve 3 μg (gri çizgi) ve 10 μg (mavi çizgi) sığır serum albümini varlığında kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bradford testinin yaygın kullanımı, çeşitli sınırlamaların tanımlanmasına (örneğin, farklı proteinlere¹¹ değişken tepkiler ve lipitler¹³ ve deterjanlar⁷ tarafından girişim) ve performansını iyileştirmek için modifikasyonların geliştirilmesine yol açmıştır (örneğin, deterjanların^{eklenmesi 14,15}, alkalinizasyon^14,16 ve absorbans oranının kullanılması¹⁷). Testin kendisindeki değişikliklere ek olarak, analitik sinyalleri yakalamak için akıllı telefonlar veya kameralar gibi alternatif cihazların kullanımı da tanımlanmıştır 18,19,20. Gerçekten de, akıllı telefonları taşınabilir kimyasal analizörler olarak kullanan yöntemlerin geliştirilmesi aktif bir araştırma alanı olmuştur. Akıllı telefonların kullanım motivasyonu, bu cihazların satın alınabilirliğinden, taşınabilirliğinden, kullanım kolaylığından ve yaygın olarak bulunmasından kaynaklanmaktadır.

Bu makale, analitik bir cihaz olarak bir akıllı telefon kullanan RGBradford testi^20'yi kullanarak protein ölçümü için bir protokol sağlar. Orijinal RGBradford yayını^20'nin aksine, burada renk çıkarma işlemini kolaylaştıran bir prosedür tanıtıldı. Bir mikroplaka resminin her bir kuyucuğundan renk bilgilerini otomatik olarak çıkarmak için ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılım uygulamasının kullanılmasını içerir, bu da önemli ölçüde zaman ve emek tasarrufu sağlar. Bu, bir grafik düzenleme yazılımı uygulaması²⁰ kullanarak her bir kuyudan renk verilerini tek tek manuel olarak elde etmenin önceki yöntemine bir alternatiftir. Sonuç olarak, numunelerdeki protein seviyeleri, bir akıllı telefonla çekilen bir mikroplaka resminden çıkarılan renk verileri kullanılarak ölçülebilir.

Protokol

1. Bradford protein tahlil reaktifinin hazırlanması

1. 100 mg Coomassie Brilliant Blue G'yi 50 mL% 95 (a / h) etanol içinde çözün. Coomassie Brilliant Blue G tamamen eriyene kadar karıştırın.
   DİKKAT: Etanol yanıcıdır ve göz tahrişine neden olur. Alevlerden kaçının ve gözlük kullanın.
2. 
   
6. 
   

4. 
   

1. 
   
4. 
   

2. >
3. >
4. >
5. >
12. 
    

1. 
   
2. >
7. 
   

1. 
   

Sonuçlar

Şekil 4, renk verilerinin çıkarıldığı ve 450 nm ve 590 nm'de absorbansın kaydedildiği bir mikroplakanın resmidir. Burada temsili olarak bildirilen RGB renk verileri, bölüm 5'te açıklandığı gibi otomatik olarak elde edilmiştir. Tipik bir renk verisi modeli, mavi değerlerde bir artış ve kırmızı ve yeşil değerlerde bir azalmadır (Şekil 5). Tüm kuyucuklardaki belirgin yansımaya ve mükemmel hizalanmamış bir mikroplakaya (Şekil 4) rağmen,...

Tartışma

Bu makale, bir Bradford protein tahlilinden veri kaydetmek, renk verilerini çıkarmak ve yakın zamanda açıklandığı gibi biyolojik örneklerdeki protein seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için bir akıllı telefon kamerası kullanan bir yöntem olan RGBradford'u açıklamaktadır²⁰. Orijinal RGBradford yönteminden bir fark, burada bir ImageJ eklentisi²² ile renk verilerini otomatik olarak elde etmek için bir prosedürün kullanılmış olmasıdır. RGBradford yönteminin ana yeniliği, RGB...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 oyuklu düz tabanlı polistiren mikrotitre plakaları	Jet Biofil, Guangzhou, Çin	TCP011096	Optik okuma ile uyumlu herhangi bir düz tabanlı mikroplaka yeterli olacaktır.
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Etil alkol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Kameralı başka bir akıllı telefonla değiştirilebilir
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Fosforik asit	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung
SpectraMax 384 Artı. Mikroplaka okuyucu.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	450 nm ve 590 nm'de okuma yapabilen herhangi bir mikroplaka okuyucu çalışacaktır. Bu isteğe bağlıdır. Yöntem aslında bir mikroplaka okuyucunun ihtiyacını ortadan kaldırmak için yaratıldı.