Kemirgen kemiklerinin tüm kemik bükme testlerini içeren çalışmaların tasarımı, yürütülmesi ve yorumlanması için pratik hususlar

Özet

Kemirgen kemiklerinin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili bilgileri çıkarmak için değerli bir yöntemdir. Uygun pratik anlayıştan yoksun olarak, sonuçlar aşırı yorumlanabilir veya geçerlilikten yoksun olabilir. Bu protokol, geçerli ve işlevsel veriler sağlamak için mekanik testlerin doğru bir şekilde yapılmasını sağlamak için bir kılavuz görevi görecektir.

Özet

Kırılmaya yol açan iskelet kırılganlığı, her yıl 1,5 milyon kırık ve 18 milyar dolarlık doğrudan bakım maliyeti ile sonuçlanan bir Amerikan halk sağlığı krizidir. Kemik hastalığının altında yatan mekanizmaları ve tedaviye yanıtı anlama yeteneği sadece arzu edilen değil, aynı zamanda kritiktir. Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığını anlamak ve ölçmek için değerli bir teknik olarak hizmet eder. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi basit görünse de, geçerli varsayımlar ve temel adımlar kullanıcı tarafından göz ardı edilirse uygunsuz ve yanlış sonuçlara varılabilir. Bu, yöntemlerin yanlış kullanımı ve sonuçların yanlış yorumlanması ile çalışmalar yayınlanmaya devam ettikçe disiplinler arasında gözlemlenmiştir. Bu protokol, mekanik testlerle ilgili ilkeler ve bu tekniklerin uygulanmasıyla birlikte - numune boyutunun dikkate alınmasından doku toplama ve depolamaya, veri analizi ve yorumlanmasına kadar - için bir astar görevi görecektir. Bununla birlikte, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir ve hem akademik araştırmalar hem de klinik çözümler için daha iyi anlaşılabilir.

Giriş

Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili fonksiyonel bilgileri çıkarmak için birincil yöntemdir. Klinik öncesi çalışmalarda, çeşitli test yöntemleri kullanılabilir, ancak en yaygın olanı uzun kemiklerin bükülmesidir. Bu testlerin gerçekleştirilmesi kolaydır ve insandan fareye kadar değişen boyutlarda kemikler üzerinde kullanılabilir. Fareler, klinik öncesi araştırmalarda en sık çalışılan hayvanlardan biri olduğundan, bu protokol, farelerin femora ve tibiaları üzerinde yapılan bükme testlerine odaklanacaktır.

Bükme testleri yapılmadan önce kemikler uygun şekilde alınmalı ve saklanmalıdır. En yaygın saklama yöntemleri geleneksel olarak kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması, tek başına tuzlu suda dondurulması veya kemiklerin etanol ¹ içinde kurutulması olmuştur. Etanolde depolanan kemiklerin, donmuş olarak depolananlara kıyasla sertlik ve elastik modülün arttığı ve deformasyon parametrelerinin azaldığı gösterilmiştir¹. Testten önce kemikleri yeniden sulandırmak bile bu özellikleri normal seviyelere geri getirmez ¹. Tuzlu suya batırılmış olarak depolamak, salin genişledikçe basınç uygulandığından kemiğe zarar verebilir. Ek olarak, mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) taraması için kemikleri çıkarmak için çözeltinin tamamen çözülmesi gerekecektir. Sonuç olarak, taze hasat edilmiş kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması standart saklama yöntemi haline gelmiştir ve bu protokol boyunca tavsiye edilir.

Bir kemiğin büyüklüğü ve şekli kütle kuvvetini etkilediğinden ve birçok hastalık modeli kemik boyutunu ve morfolojisini önemli ölçüde değiştirdiğinden, dokunun davranışını tahmin eden özellikler üretmek için boyutun etkilerini normalleştirmek için mühendislik ilkeleri kullanılır². Bu yaklaşım, testten önce kemiklerin taramalarını oluşturmak için en yaygın olarak μCT kullanılarak elde edilen başarısızlık yerinin enine kesit geometrisini gerektirir. μCT, kullanılabilirliği ve yüksek görüntü çözünürlüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, yumuşak dokunun katkıları dahil değildir ve tarama, kemiğe kimyasal fiksasyon veya başka değişiklikler gerektirmez ^3,4. Tüm CT formlarında, bir X-ışını kaynağı bir nesneye odaklanırken, nesnenin diğer tarafındaki bir dedektör ortaya çıkan X-ışını enerjisini ölçer. Bu, numunenin bir görüntüye^{dönüştürülebilen} bir X-ışını gölgesi üretir ^3,5. Taranan nesne döndürülür (veya X-ışını kaynağı ve dedektör numunenin etrafında döndürülür), nesneyi temsil eden üç boyutlu bir veri setine yeniden oluşturulabilen görüntüler üretilir⁵.

Tarama çözünürlüğü veya iki nesnenin birbirine ne kadar yakın olabileceği ve yine de ayrı ayrı çözümlenebileceği, elde edilen görüntüdeki nominal voksel boyutu veya bir pikselin boyutu değiştirilerek kontrol edilir. Genel olarak, nesnelerin tanımlanması için tek bir vokselin en az iki katı büyüklüğünde olması gerektiği^{kabul edilir 3}, ancak daha yüksek bir oran daha fazla hassasiyet sağlayacaktır. Ayrıca, daha büyük vokseller kısmi hacim etkilerine daha yatkındır: tek bir voksel farklı yoğunluklarda dokular içerdiğinde, tek bir dokunun özgül yoğunluğundan ziyade bu yoğunlukların ortalamasına atanır, bu da doku alanlarının ve mineral yoğunluğunun fazla veya eksik tahmin edilmesine yol açabilir³. Bu sorunlar daha küçük voksel boyutları seçilerek hafifletilebilse de, daha yüksek bir çözünürlük kullanmak kısmi hacim etkilerinin ortadan kaldırılmasını sağlamaz ve daha uzun tarama süreleri gerektirebilir³. Kemikleri ex vivo olarak tararken, fare kemiklerinin trabeküler mimarisini doğru bir şekilde değerlendirmek için genellikle 6-10 μm'lik bir voksel boyutu önerilir. Kortikal kemik için 10-17 μm'lik daha büyük bir voksel boyutu kullanılabilir, ancak en küçük makul voksel boyutu kullanılmalıdır. Bu protokol, temel trabeküler özellikleri ayırt etmek ve kapsamlı tarama süresi olmadan kısmi hacim etkilerini en aza indirmek için yeterince küçük olan 10 μm'lik bir voksel boyutu kullanır.

Kemik dokusunun yüksek mineral yoğunluğu ve kalınlığı, iletilen X-ışını enerji spektrumunu büyük ölçüde zayıflattığı ve değiştirdiği için X-ışını enerjisi ve enerji filtresi ayarları da dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Genel olarak, yayılan X-ışını spektrumunun nesne^6'dan çıkan spektruma eşdeğer olduğu için, kemik gibi yoğun nesneler üzerinde düşük enerjili X-ışınlarının kullanılmasının, ışın sertleşmesi⁷ olarak bilinen bir artefakta yol açabileceği varsayılır. Bu artefaktların insidansını azaltmak için kemik örneklerini tararken 50-70 kVp'lik daha yüksek bir voltaj önerilir⁵. Ek olarak, bir alüminyum veya bakır enerji filtresinin takılması, daha konsantre bir enerji ışını oluşturarak artefaktları daha da en aza indirir ^4,7. Bu protokol boyunca 0,5 mm alüminyum filtre kullanılacaktır.

Son olarak, tarama döndürme adımı ve döndürme uzunluğu (örneğin, 180°-360°), son taramadaki gürültü miktarını belirleyen^yakalanan görüntü sayısını birlikte kontrol eder 4. Her adımda birden fazla karenin ortalamasını almak gürültüyü azaltabilir ancak tarama süresini artırabilir⁴. Bu protokol, 0,7 derecelik bir döndürme adımı ve 2 derecelik bir çerçeve ortalaması kullanır.

Tarama hakkında son bir not: hidroksiapatit kalibrasyon fantomları, zayıflama katsayılarının g/^cm35 cinsinden mineral yoğunluğuna dönüştürülmesini sağlamak için deneysel kemiklerle aynı tarama ayarları kullanılarak taranmalıdır. Bu protokol, farklı fantomlar mevcut olmasına rağmen, 0.25 g/^cm3 ve 0.75 g/^cm3 hidroksiapatit fantomları kullanır. Bazı tarama sistemlerinin, günlük sistem kalibrasyonunun bir parçası olarak dahili fantomlar kullandığını unutmayın.

Tarama tamamlandıktan sonra, açısal çıkıntılar, tipik olarak üreticinin eşlik eden yazılımı kullanılarak nesnenin kesit görüntülerine dönüştürülür. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, rekonstrüksiyonda tüm kemiğin yakalandığından ve eşiğin kemik ile kemik olmayanın tanınmasına izin verecek şekilde uygun şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir. Rekonstrüksiyondan sonra, tüm taramaları üç boyutlu olarak döndürmek çok önemlidir, böylece kemikler yine üreticinin yazılımını kullanarak enine eksenle tutarlı ve düzgün bir şekilde hizalanır.

Rotasyonu takiben, mekanik normalizasyon için kortikal özellikler, trabeküler özellikler veya kırılma geometrisinin istenip istenmediğine bağlı olarak analiz için ilgi alanları (ROI) seçilebilir. İkincisi için, kırık bölgesinden kemiğin bir ucuna olan mesafeyi ölçerek ve tarama dosyasında karşılık gelen dilim konumunu belirlemek için voksel boyutu kullanılarak test edildikten sonra ROI'ler seçilmelidir. Seçilen bölge en az 100 μm uzunluğunda olmalı ve kırılma noktası ROI'nin yaklaşık merkezinde olmalıdır⁴.

ROI'ler seçildiğinde, mekanik normalizasyon için iki özellik gereklidir (eğilme gerilimini ve gerinimini hesaplamak için): nötr eğilme ekseninden arızanın başlatıldığı yüzeye olan maksimum mesafe (test kurulumu tarafından belirlenen, gerilimde yüklü yüzey olduğu varsayılır) ve nötr eksen etrafındaki atalet momenti alanı (ayrıca test kurulumuna bağlıdır). Bu protokol, bu değerleri belirlemek için özel bir kod kullanılmasını önerir. Koda erişmek için doğrudan ilgili yazarla iletişime geçin veya daha fazla bilgi için https://bbml.et.iupui.edu/ adresindeki laboratuvar web sitesini ziyaret edin.

μCT taraması tamamlandıktan sonra mekanik test başlayabilir. Bükme testleri, dört noktalı veya üç noktalı konfigürasyonlarda gerçekleştirilebilir. Dört noktalı eğilme testleri, yükleme noktaları arasındaki kemikteki kayma gerilmesini ortadan kaldırdığı ve bu bölgede saf eğilmenin gerçekleşmesine olanak sağladığı için tercih edilmektedir³. Kemik daha sonra gerginlik nedeniyle kırılacak ve kemiğin gerçek bükülme özelliklerini daha iyi temsil eden bir başarısızlık yaratacaktır³. Bununla birlikte, kemik, her iki yükleme noktasında da aynı yükü verecek şekilde yüklenmelidir (bu, döner bir yükleme kafası ile kolaylaştırılabilir). Üç nokta eğilme testlerinde, yük noktasının kemikle birleştiği yerde kayma gerilmesinde büyük bir değişiklik olur ve bu da kemiğin bu noktada gerilme³ değil kayma nedeniyle kırılmasına neden olur. ASTM standartları, bükülmeye maruz kalan malzemelerin uzunluk-genişlik oranının 16:1 olmasını önermektedir,^{yani kesme 8,9} etkilerini en aza indirmek için destek açıklığının uzunluğu kemiğin genişliğinden 16 kat daha büyük olmalıdır. Küçük kemirgen kemiklerini test ederken bunu başarmak genellikle imkansızdır, bu nedenle yükleme aralığı mümkün olduğunca büyük, ancak enine kesit şeklinde mümkün olduğunca küçük bir değişiklikle yapılır. Ayrıca, dört noktalı bükme yapılırken, alt ve üst açıklığın uzunlukları arasındaki oran ~3:1⁸ olmalıdır, bu genellikle tibiada elde edilebilir, ancak daha kısa femurda zordur. Ek olarak, femurların daha ince kortikal duvarları, onları test sırasında kemik kesitinin şeklini değiştiren halka tipi deformasyona duyarlı hale getirir (bu, üç noktalı bükülmeye kıyasla aynı bükülme momentini indüklemek için daha büyük bir kuvvet gerektiğinden dört noktalı testlerde vurgulanabilir). Bu nedenle, bu protokol boyunca fare femora için üç noktalı bükme kullanılırken, tibia için dört noktalı bükme kullanılacaktır.

Son olarak, istatistiksel analiz için çalışmayı uygun şekilde güçlendirmek önemlidir. Mekanik testler için genel bir öneri, bazı mekanik özellikler, özellikle akma sonrası parametreler oldukça değişken olabileceğinden, farklılıkları tespit edebilmek için deney grubu başına 10-12 kemiklik bir örneklem büyüklüğüne sahip olmaktır. Bazı durumlarda, bu, çalışma sırasında meydana gelebilecek yıpranma göz önüne alındığında daha yüksek bir hayvan örneklem büyüklüğü ile başlamak anlamına gelebilir. Bir çalışmaya başlamadan önce mevcut veriler kullanılarak örneklem büyüklüğü analizi tamamlanmalıdır.

Çok sayıda sınırlama ve varsayım vardır, ancak bükme testleri, özellikle gruplar arasındaki göreceli farklılıklar söz konusu olduğunda oldukça doğru sonuçlar verebilir. Bu özellikler, trabeküler mimari ve kortikal morfolojinin analizi ile birlikte, hastalık durumları ve tedavi rejimleri hakkında daha iyi bilgi sağlayabilir. Deneyin kontrolümüzde olan yönlerine (örneğin, hasat, depolama, tarama ve test etme) dikkat edilirse, doğru sonuçların üretildiğinden emin olabiliriz.

Protokol

Bu protokol boyunca açıklanan ve hayvanları içeren tüm prosedürler, prosedürden önce Indiana Üniversitesi Fen Bilimleri Okulu Kurumsal Hayvan ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Prosedürde tarif edilen hayvanlar, CO₂inhalasyonu yoluyla ötenazi yapıldı ve ardından ikincil bir ötenazi aracı olarak servikal çıkık yapıldı.

1. Kemiklerin toplanması, depolanması ve çözülmesi

1. Hasat ve depolama
   1. Fareyi ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Bir tarafta femur ve pelvisin yaklaşık birleşim yerinde bir kesi yapmak için bir neşter (veya tıraş bıçağı veya makas) kullanın.
   2. Kalça eklemi bulunana kadar ilk insizyona dorsal olarak devam edin; Pelvise bağlı küçük beyaz bir küre gibi görünen femur başını arayın.
   3. Femur başı yuvadan çıkana kadar femur başının proksimal kenarına bir neşter kenarı ile basınç uygulayın. Arka ayağı karkasın geri kalanından kurtarmak için ek dokuyu çıkarın.
   4. Arka bacak izole edilmişken, diz ekleminde fleksiyonu indükleyerek tibia ve femuru ayırın. Kemikler arasındaki bağlar da dahil olmak üzere herhangi bir bitişik dokuyu kesmek için neşteri dizin ön yüzeyinde medial-lateral yönde hareket ettirin.
   5. Bu kemikleri ayırmazsa, arka yüzeye erişime izin vermek için diz eklemini uzatın. Kemiği kesmekten veya eklem kıkırdağını kazımaktan kaçınmaya dikkat edin.
   6. Femur ve tibia ayrıldıktan sonra, eklemi esneterek ve eklemin arka yüzeyinde medial-lateral bir testere hareketi kullanarak arka ayağı tibiadan çıkarın. Gerekirse, ön yüzeyi ortaya çıkarmak için eklemi uzatın. Kemiği kesmemeye dikkat edin.
   7. İzole edildikten sonra, tüm yapışkan yumuşak dokuların kemiklerini temizleyin. Tibia üzerinde dört noktalı bükme testleri yapıyorsanız, fibulayı da çıkarın. Fibula, proksimal uçtaki bağlarla bağlanır, ancak kemiğin distal ucuna yakın tibiaya kaynaşır. Fibulayı ayırmak için bağlantı noktasının yakınında keskin bir makas kullanın.
   8. İzole edilmiş ve temizlenmiş kemikleri ayrı ayrı tuzlu suya batırılmış gazlı beze sarın ve -20 °C'de saklayın. Bunu hasattan hemen sonra yapın.
   9. Karkasın diğer tarafı için 1.1.1'den 1.1.8'e kadar olan adımları tekrarlayın.
      NOT: 1.1.4-1.1.6 adımlarında kemikleri ayırmaya çalışırken direnç varsa, kemikleri ayırmaya çalışmak yerine adımları tekrarlamak en iyisidir. Kuvvetli hareketler kemiklerin hasar görmesine veya kırılmasına neden olabilir.
2. Çözdürme
   NOT: Aşırı donma-çözülme döngüleri kemiğin mekanik özelliklerini zararlı bir şekilde etkileyebileceğinden, bir kemiğin maruz kaldığı donma-çözülme döngülerinin sayısı en aza indirilmelidir. μCT taraması için kısmi çözülme, kemiğin oda sıcaklığında 5-10 dakika bekletilmesiyle sağlanabilir. Kemiği sadece aşağıda açıklandığı gibi bükme testleri yaparken tamamen çözün.
   1. Bir gecede çözülme tercih edilir
      1. Kemikleri -20 ° C'deki depolamadan soğuk bir odada veya buzdolabında 1-4 ° C'ye taşıyın. Testten önce kemiklerin tamamen çözülmesi için 8-12 saat orada kaldığından emin olun.
   2. Hızlı çözülme
      1. Banyo sıcaklığını yaklaşık 37 °C'ye ayarlayın. Bu sıcaklığa geldikten sonra kemikleri banyoya ekleyin.
      2. Kemikleri banyoda yaklaşık 1 saat bekletin.

2. μCT taraması

1. Hidrasyonu korumak için taramadan önce kemikleri parafilme sarın. Taranmayı beklerken diğer tüm kemikleri buz üzerinde tutun.
2. Parafilme sarıldıktan sonra, tarayıcıyla arayüz oluşturmak için kemiği bir tutucuya yerleştirin. Taranan tüm kemiklerin aynı yönde hizalandığından emin olun, çünkü tutarlı hizalama analizin ilerleyen bölümlerinde döndürmeyi basitleştirecektir.
3. Tarama ayarlarını, taramanın uygulanmasına göre ayarlayın. Fare kemikleri için aşağıdaki genel tarama ayarları önerilir: çözünürlük/voksel boyutu: 10 μm; piksel boyutu: orta, 2000 x 1048; filtre: 0,5 mm alüminyum; Dönme adımı: 0.7; Çerçeve ortalaması: 2.
   NOT: Bu ayarlar, tarama için kullanılan sisteme bağlı olarak farklılık gösterebilir ve gerektiğinde üreticinin ve kullanım kılavuzunun kullanımına başvurulmalıdır.
4. X-ışını kaynağı açıldıktan sonra, artefaktları en aza indirmek için düz alan düzeltmesi yapın. Bunu yapmak için önce haznenin boş olduğundan emin olun ve düz alanı kapatın.
5. Alanın ortalama yoğunluğunu ölçün ve `'a ayarlayın. `'a ulaştığında, düz alanı güncelleyin ve tekrar açın.
6. 
   

3. 
   

2. 3. 
      
   9. 
      
4. 7. 
      

1. 1. 
      
   2. 
      
2. 1. 
      
   2. 
      
3. 2. 
      

1. 
   
3. 2. 
      
      2. 
         

Sonuçlar

BT taramasının tamamlanmasının ardından, yetersiz taramaların çoğu rekonstrüksiyonda yakalanabilir. Genellikle, zayıf taramalar, tarama sırasındaki bir hatanın açık bir göstergesi olan yüksek bir yanlış hizalama telafisine sahip olacaktır. Ancak, diğer adımlarda hatalar oluşabilir ve yanlış verilere de yol açabilir. Bu hatalar genellikle tek tek hesaplanan mimari özellikler incelenirken fark edilebilir. Değerler bir gruptaki diğer değerlerin aralığının çok dışında kalıyorsa, tarama, ROI ve özellikleri hesaplama yöntemi y...

Tartışma

Tarama ve test süreci boyunca, sorun giderme ve optimizasyonun uygun olduğu anlar vardır. Bunlardan ilki, μCT kullanarak kemikleri tararken ortaya çıkar. Birçok sistem, bir nesnenin tutulabileceği ve taranabileceği bir tutucu ile birlikte gelirken, aynı anda birden fazla kemiği taramak için özel tutucular üretilebilir. Birden fazla kemiğin taranması optimizasyon için mükemmel bir nokta olabilir, ancak artefaktların indüklenmediğinden emin olmak için tarama ve analiz süreci boyunca dikkatli olunmalıdır. X-ışınları her açı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CTAn	Bruker	NA	CT Tarama Analiz Yazılımı
DataViewer	Bruker	NA	CT Tarama Rotasyon Yazılımı
Matris Laboratuvarı (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Veri analizi için kullanılan kodlama platformu
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction yazılımı
SKYSCAN 1272-100 kV, 16 MP CCD dedektörlü, 3D Suite Yazılımı ve nbsp;	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Bir nesne aracılığıyla her sanal dilimde 209 mP'ye kadar tahribatsız bir şekilde görselleştirebilen Micro-CT sistemi