Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi ^1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu ^3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür⁵. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus'tan (sFE) ⁶ fibrinolitik enzim olan fibrini^doğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE'ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında ^7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus'un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır¹⁰.

Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE'nin S. nudus'tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir^10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE'nin basit bir saflaştırma programı, sFE'nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE'nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.

Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE'nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.

1. Hazırlık

1. Numune tedavisi
   1. Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.
   2. Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.
   3. Homojenatı 3x dondurarak çözün.
   4. Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
2. Protein çökeltmesi
   1. Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir.
   2. Protein çökeltisini elde etmek için santrifüj (10.956 × g, 0.5 h, 4 °C); Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
3. Protein resüspansiyonu
   1. Protein çökeltisini 30 mL Tris-HCl tamponu (0.02 M, pH 7.4) ile yeniden askıya alın. Bu ham protein çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.

2. Afinite kromatografisi

1. Çözelti filtrasyonu
   1. Ham protein çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre membranından filtreleyin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
2. Kolon paketleme
   1. Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin.
      NOT: Kolon 2-8 °C'de, matris mağaza tamponuna (%20 etanol) daldırılarak saklanabilir.
3. Afinite saflaştırma
   1. Afinite kromatografisi kolonunu önce ddH₂O (1 mL/dak, 10 sütun hacmi), ardından Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/dak, 5 sütun hacmi) ile dengeleyin.
   2. Protein çözeltisi numunesini önceden dengelenmiş kolona yükleyin (1 mL/dak, 1/3 sütun hacmi).
      NOT: Numune yükleme hacmi, sFE konsantrasyonuna bağlıdır.
   3. Kolonu Tris-HCl tamponu ile yıkayın (0,02 M, pH 8,0, beş sütun hacmi).
   4. Kolonu sırasıyla 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M ve 0,65 M NaCl (1 mL/dak, beş sütun hacmi) ile kaldırın.
   5. 0.15 M NaCl elüsyonunda görünmesi gereken elüsyon tepesini arayın ve ardından fraksiyonları 5 mL tüplerde toplayın.
   6. Elüsyon numunesini 3 kD ultra santrifüj filtre (3.944 × g, 1,5 saat, 4 °C) kullanarak konsantre edin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

3. Saflık değerlendirmesi

1. Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel preparatı
   1. SDS-PAGE jeli, %5 konsantre jel ve %12 ayırma jeli¹³ kullanarak Laemmli'nin yöntemine göre hazırlayın.
2. Elektroforez
   1. Numuneyi (15 μL) 5x SDS-PAGE protein yükleme tamponu (1/4 hacim) ile karıştırın, kaynar suda 5 dakika ısıtın, SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 80 V, 60 mA'da 1,5 saat boyunca çalıştırın.
3. Analiz
   1. Elektroforezden sonra, jeli üreticinin protokolüne göre bir Gümüş Leke Kiti ile lekeleyin ve kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanarak lekeli jeli gözlemleyin.
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak hedef proteinin saflığını analiz edin: hedef proteinin saflığı = hedef proteinin yoğunluk değeri / toplam proteinin yoğunluk değeri.

4. Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi

1. Fibrin plaka hazırlama
   1. 25 mg fibrinojen çözeltisini 1.25 mL fizyolojik salin ile karıştırarak hazırlayın.
   2. 100 U trombini 1.05 mL fizyolojik salin ile tamamen karıştırarak trombin çözeltisini hazırlayın.
   3. 22.5 mL Tris-HCl tamponuna (0.02 mol / L, pH 7.4) 0.5 g agaroz ekleyerek agaroz çözeltisini hazırlayın. Agaroz çözeltisini karıştırın ve tamamen çözünene kadar 100 ° C'de ısıtın.
   4. Agaroz çözeltisini yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğutun ve fibrinojen çözeltisi ekleyin. Ardından, hemen trombin çözeltisini ekleyin, hızlıca karıştırın ve 60 mm'lik bir kültür kabına dökün.
2. Yükleme
   1. Steril bir delici kullanarak hazırlanan fibrin plakalara 3 mm'lik kuyular delin ve kuyucukları 10 μL numunelerle doldurun.
3. Analiz
   1. 37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap.
      NOT: Fizyolojik salin tamponu, ham protein (protokol adım 1.3.1'de elde edilen örnek) ve ürokinaz sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol için kullanılmıştır. Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk.

Bu protokolü takiben, ham doku lizatları ekstrakte edildi, arginin-agaroz matriksi ve lizin-agaroz matriks afinite kromatografisi kolonları oluşturuldu, saflaştırılmış sFE elde edildi ve saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve fibrinolitik aktivitesi sırasıyla SDS-PAGE ve fibrin plakaları ile ölçüldü.

Santrifüjlemeden sonra, toplanan süpernatant şeffaf bronz viskoz bir sıvıydı. Yağış, bu süpernatant doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırıldığında başladı. 12 saat bekletildikten sonra, tüpün dibinde ağır bir çökelti oluştu. Tris-HCl tamponu ile yeniden askıya alındığında, protein çökeltisi hızla kayboldu ve tamponda çözüldü ve şeffaf soluk sarı bir sıvı olarak göründü.

Protein çözeltisi arginin-agaroz matris afinite sütununa yüklendiğinde, ~ 40 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 1, akış zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 66 dakikada salınımı durdurdu. Gradyan elüsyon aşamasında, 0.15 M NaCl ile salınımlandığında, ~ 94 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 2, elüsyon zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 110 dakikada salınımı durdurdu. Kalan elüzyon aşamalarında belirgin bir elüsyon zirvesi görülmemiştir (0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M ve 0.65 M NaCl) (Şekil 1A). Bu çalışmada arginin-agaroz matriks afinite kolonunu 10 defaya kadar tekrar kullandık ve kolonun performansının anlamlı olarak değişmediğini tespit ettik.

Protein çözeltisi lizin-agaroz matrisi afinite sütununa yüklendiğinde, ~ 38 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 1, akış zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 60 dakikada salınımı durdurdu. Degrade elüzyon aşamasında, 0.15 M NaCl ile salınımlandığında, ~ 80 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 2, elüsyon zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 86 dakikada salınımı durdurdu. Kalan elüzyon aşamalarında belirgin bir elüsyon zirvesi görülmemiştir (0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M ve 0.65 M NaCl (Şekil 1B). Arjinin-agaroz matriks afinite kolonu ile lizin-agaroz matriks afinite kolonunun elüsyon profilleri benzerdi. Daha önce de belirtildiği gibi, arginin-agaroz matris afinite kolonunun 10 kata kadar tekrar kullanılması, bu sütunun performansını değiştirmedi.

Hazırlanan fibrin plakaya saflaştırılmış sFE (10 μL, elüsyon tepe numunesi, tepe 2) ilave edildi. Ek olarak, pozitif kontrol, boş ve negatif kontrol için sırasıyla 10 μL ürokinaz (100 U), 10 μL fizyolojik salin tamponu ve 10 μL ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek) kullanılmıştır. 18 saatlik inkübasyondan sonra, iki fibrin plakası benzer sonuçlar verdi: ürokinaz kontrolünde bir lize bölgesi (1.3 cm çapında) ortaya çıktı; fizyolojik salin tamponunda lizing bölgesi gözlenmedi; ham protein kuyusunda bir lizing bölgesi (2.1 cm çapında) ortaya çıktı; ve saflaştırılmış sFE kuyusunda bir liz bölgesi (1.8 cm çapında) ortaya çıktı (Şekil 2). Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk. Elüsyon tepe numunesi, afinite kolonuna yüklenen numuneninkiyle aynı hacme ayarlandığından, afinite kolonunun geri kazanım hızı, fibrin plakası üzerindeki lizing bölgesinin boyutu (çap x çap) ile gösterilir. Benzeşim sütununun iyileşme oranı ~s.5 idi.

Saflık analizi için ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen numune) ve saflaştırılmış sFE (elüpsiyon tepe numunesi, tepe 2) kullanılmıştır. SDS-PAGE ve boyamadan sonra, ham proteinde üç ana protein bandı (25, 26 ve 27 kD) ve altı küçük bant (20, 24, 28, 35, 40 ve 45 kD) sunulmuştur. Saflaştırılmış sFE'de bir majör bant (27 kD) ve iki minör bant (26 ve 28 kD) sunulmuştur (Şekil 3). Gri değer analizi sayesinde, saflaştırılmış sFE'nin saflığının ~% 92 kadar yüksek olduğunu bulduk.

Şekil 1: Afinite saflaştırma profili . (A) Ham sFE numunesi arginin-agaroz matrisi afinite saflaştırması ile saflaştırıldı. Belirgin bir akış zirvesi ~ 40 dakikada ortaya çıktı ve ~ 66 dakikada salınımı durdurdu. Belirgin bir elüsyon zirvesi ~ 94 dakikada ortaya çıktı ve ~ 110 dakikada salınımı durdurdu. (B) Ham sFE örneği, lizin-agaroz matris afinite saflaştırması ile saflaştırıldı. Belirgin bir akış zirvesi ~ 38 dakikada ortaya çıktı ve ~ 60 dakikada salınımı durdurdu. Belirgin bir elüsyon zirvesi ~ 80 dakikada ortaya çıktı ve ~ 86 dakikada salınımı durdurdu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi. Örnekler fibrin plakaya eklendi ve fibrinolitik aktiviteleri ölçüldü ve 18 saat sonra plaka üzerindeki bozunma bölgeleri ile değerlendirildi. Farklı şekilde işlenmiş örnekler kırmızı Arap rakamlarıyla gösterilir. (A) Arjinin-agaroz matriks afinite kolonu ile saflaştırılan sFE'nin fibrinolitik aktivitesi. # 1, 100 U ürokinaz; # 2, fizyolojik salin tamponu; #3, ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); # 4, saflaştırılmış sFE (elüzyon tepe örneği, tepe 2). (B) Lizin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin fibrinolitik aktivitesi. # 1, 100 U ürokinaz; # 2, fizyolojik salin tamponu; #3, ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); # 4, saflaştırılmış sFE (elüzyon tepe örneği, tepe 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Saflık analizi. Saflaştırılmış sFE'nin saflığı SDS-PAGE ile analiz edildi. (A) Arjinin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin saflığı. M: protein belirteci; Şerit 1: ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); şerit 2: saflaştırılmış sFE (elüsyon tepe örneği, tepe 2). (B) Lizin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin saflığı. M: protein belirteci; Şerit 1: ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); şerit 2: saflaştırılmış sFE (elüsyon tepe örneği, tepe 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: 8ZHP: snFPITE-n1'in kristal yapısı. PDB X-ışını yapısal doğrulama raporu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 8ZHO: snFPITE-n2'nin kristal yapısı. PDB X-ışını yapısal doğrulama raporu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.