Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rahim Ağzı Kanseri Hücre Büyümesi ve Sisplatin Duyarlılığındaki Rolünü Doğrulamak için FAM83A'nın Yıkılması

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65667

⸱

9 Şubat 2024

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, FAM83A yıkım prosedürlerini gösteriyoruz; rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalması, göçü ve istilası üzerindeki etkilerini tespit etmek için yapılan tahliller; ve bu hücrelerin sisplatine duyarlılığı. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri için umut verici bir hedef gen ve daha ileri ilaç araştırmaları için bir referans sağlar.

Özet

Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde bir tümör hedef geni FAM83A'nın tanımlanmasında yer alan adımları özetledik. İlk olarak, kadınlarda FAM83A'nın ekspresyonunu ve prognostik önemini doğrulamak için Kanser Genom Atlası veri seti kullanıldı. HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullanıldı. Daha sonra, tümör hücrelerinin proliferasyon yetenekleri üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) boyaması yapıldı. Tümör hücre göçü ve invazyon yeteneklerini değerlendirmek için yara iyileşmesi ve gözenekli membran insert testleri yapıldı.

Apoptozla ilişkili protein seviyelerini ölçmek için Western blotlama kullanıldı. Mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Ayrıca, hedef genin terapötik potansiyelini değerlendirmek için sisplatin (diamindikloroplatin, DDP) müdahalesi kullanıldı. Genin antikanser özelliklerini daha fazla doğrulamak için akış sitometrisi ve koloni oluşumu testleri yapıldı. Sonuç olarak, FAM83A yıkımının rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve istilasını inhibe ettiği ve bu hücreleri sisplatine duyarlı hale getirdiği gösterilmiştir. Bu kapsamlı metodolojiler, FAM83A'yı tümörle ilişkili bir hedef gen olarak toplu olarak doğrular ve rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisinde potansiyel bir terapötik hedef olarak umut vaat eder.

Giriş

Rahim ağzı kanseri, dünya çapında jinekolojik malignitelerin önde gelen türlerinden biri olduğu ve kadınlarda kansere bağlı ölümlerin başlıca nedeni olduğu için küresel bir sorundur1. Radikal cerrahi ve kemoradyoterapi, birincil aşamada yüksek kür oranları ile ilişkilidir. Bununla birlikte, rahim ağzı kanserinin ileri evresinde metastatik hastalık gelişen hastalar için tedavi sonuçları çok elverişsizdir2. Bu nedenle, rahim ağzı kanseri hücrelerinin göçünün ve istilasının altında yatan biyolojik mekanizmaları daha iyi anlamak ve bu hastalığın önlenmesi ve tedavisi için potansiyel terapötik hedefleri belirlemek çok önemlidir.

Kanserin ilerlemesinde rol oynayan hedef genlerin belirlenmesi ve ekspresyonlarını veya etkilerini engellemenin yollarını bulmak umut verici tedavi seçenekleri sunar. Bu çalışmada, FAM83'ü kansere neden olan bir gen olarak tanımladık ve C33a ve HeLa hücreleri üzerindeki inhibitör etkilerini daha fazla araştırdık. FAM83 ailesi onkogenleri (FAM83A-H) insan kanserlerinde yaygın olarak bildirilmiştir 3,4. Son zamanlarda, FAM83A'nın akciğer5, meme6, yumurtalık7 ve pankreas8 kanserlerinde yukarı regüle olduğu bildirildi, bu da FAM83A'nın tümör hücrelerinde proliferasyon, invazyon, kök hücre benzeri özellikler ve ilaç direncini teşvik ederek kanserin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını gösteriyor. Önemli olarak, FAM83A, servikal lezyon progresyonu ve karsinogenez9 ile ilişkili yeni aday genlerden biri olarak tanımlanmıştır. İnsan rahim ağzı kanseri hücrelerinde artmış FAM83A ekspresyonunun doğrulanmasına rağmen, FAM83A'nın rahim ağzı kanserindeki spesifik etkisi ve altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır.

Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde FAM83A'nın bir tümör hedef geni olarak tanımlanmasında yer alan protokolleri özetledik ve HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullandık. Tümör hücresi proliferasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-Etinil-2'-deoksiüridin (EdU) boyaması yapılırken, yara iyileşmesi ve gözenekli membran ekleme testleri tümör hücresi göçü ve invazyon yeteneklerinin değerlendirilmesine yardımcı oldu.

Apoptozla ilişkili proteinlerin seviyelerini belirlemek için Western blotlama yapıldı ve mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Bu nedenle, FAM83A'nın serviks kanserinde hücre proliferasyonu, metastaz ve invazyonunda kritik bir rol oynadığını bildirdik. PI3K / AKT yolu ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyon ve apoptoz yoluyla, FAM83A nakavt rahim ağzı kanseri hücrelerini sisplatine (diamindikloroplatin, DDP) duyarlı hale getirdi. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri ve muhtemelen diğer kanserler için yeni bir hedef ve kanser hücrelerinin belirli kemoterapötik ilaçlara karşı direncinin üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesi için bir referans sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines) tarafından sağlanan yayın kılavuzlarına tamamen uygundur. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Veri kaynağı ve biyoinformatik analizi

  1. Küme analizi için Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanından (https://cancergenome.nih.gov) RNA dizileme verilerini alın. Standart bir işleme boru hattı ile aday kanser ilacı hedeflerini taramak için TCGA projelerinden alınan örneklerin ham RNA-Seq verilerini yeniden hesaplamak için web tabanlı bir araç olan GEPIA'yı (http://gepia.cancer-pku.cn/) kullanın.
    NOT: GEPIA web sitesi tüm kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir.
  2. GEPIA web sitesi ana sayfasına erişin ve Kanser Tipi Analizi'ne tıklayın, Diferansiyel gen analizi seçeneğini seçin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Kanser adı = CESE (bu web sayfasında Servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinom olarak tanımlanmıştır), |Günlük2FC| Kesme = 1, q-değeri Kesme = 0.01, Diferansiyel Yöntemler = ANOVA ve Kromozomal Dağılım = her ikisi. Ardından, tümör ve normal gruplar arasındaki diferansiyel ifadeyi gösteren bir gen listesi elde etmek için Liste'ye tıklayın.
    NOT: Diferansiyel olarak ifade edilen aday genleri tanımlamak için kapsamlı bir literatür taraması gerektirir. Bu çalışmada, mevcut literatür ışığında, ilgilenilen tümör geni olan FAM83A'ya odaklandık.
  3. Ardından, web sitesindeki Expression DIY seçeneğine ilerleyerek GEPIA kullanarak rahim ağzı kanseri ve normal dokularda FAM83A ekspresyonunu inceleyin ve grafik türü olarak Boxplot'u seçin. Gen parametresi alanına FAM83A girin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: |Günlük2FC| Kesme değeri = 1; q-değeri Kesme = 0.01. Kanser adı olarak CESE'yi seçin ve Eşleşen Normal veri alanı için TCGA normal verilerini eşleştir'i seçin ve diğer tüm ayarları varsayılan olarak bırakın. Plot'a tıklayın ve web sitesinin FAM83A geninin diferansiyel ekspresyonunu temsil eden bir kutu grafiği oluşturmasına izin verin; Kutu grafiğini ileride başvurmak ve analiz etmek üzere kaydedin.
  4. Son olarak, rahim ağzı kanserinde farklı seviyelerde FAM83A ekspresyonu olan tümörleri taşıyan hastaların genel sağkalımını analiz edin. Web sitesindeki Hayatta Kalma Grafikleri seçeneğine gidin, Gen'i FAM83A olarak ayarlayın ve analiz türü olarak Genel Hayatta Kalma'yı seçin. Tümör adı CESE'yi ekleyin, Eksen Birimleri için Aylar'ı seçin ve diğer tüm parametreleri varsayılan ayarlarında bırakın. Çizim'e tıklayın ve web sitesinin bir hayatta kalma eğrisi grafiği oluşturmasına izin verin; Bu tabloyu ileride başvurmak ve analiz etmek üzere saklayın.
  5. FAM83A'yı rahim ağzı kanserinde potansiyel bir terapötik hedef gen olarak tanımlamak için hem tümörlerde FAM83A'nın diferansiyel ekspresyonunu hem de hasta sağkalım analizi ile korelasyonunu dikkate alın.

2. Hücre tabanlı deneyler

  1. Hücre kültürü
    1. Modifiye edilmiş ortamda insan tümör hücre hatlarını 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde kültürleyin.
      NOT: Hücre hattı bilgileri ve kültür ortamı bileşenleri için Malzeme Tablosuna bakın.
  2. Hücre transfeksiyonu
    1. Hücrelerdeki FAM83A ekspresyonunu yıkmak için siRNA kullanın.
      NOT: Spesifik siRNA dizisi için Tablo 1'e bakın.
    2. 6 oyuklu plakalardaki tohum hücreleri ve 50 nM si-FAM83A veya siRNA-NC ve 8 μL transfeksiyon ajanı veya sadece 8 μL transfeksiyon ajanı karışımı ile %50-70 birleşme elde ettikten sonra 4-6 saat inkübe edin. Negatif kontrole sadece serumsuz DMEM ekleyin.
    3. İnkübasyondan sonra, transfeksiyon ajanını içeren besiyerini DMEM +% 10 fetal buzağı serumu ile değiştirin. Ayrıca, transfeksiyondan 48 saat sonra, amaçlandığı gibi 24 saat boyunca 5 μM sisplatin (DDP) ile muamele edin ve toplam RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR analizi için tüm hücreleri toplayın.

3. Hücre proliferasyon testi için EdU tespiti

NOT: Hücre proliferasyonunu üreticinin talimatlarına göre in vitro olarak değerlendirmek için EdU Hücre Proliferasyon Kitini kullanın.

  1. Hücreleri 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve 2 saat boyunca 10 μM EdU çözeltisi ile inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
  2. Geçirgenleştirme tamponunu çıkarın ve 500 μL 1x reaksiyon çözeltisi ekleyin. Ardından, nükleer boyama için karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyayın ve 200x büyütmede bir floresan mikroskobu altında görselleştirin. Çoğalan hücrelerin çekirdeklerini EdU ile boyayın ve kırmızı floresan açısından inceleyin.
  4. Son olarak, en az 10 rastgele alan sayarak sonuçları ölçmek için yazılım kullanın ve floresan pozitif hücrelerin toplam hücrelere oranını kullanarak çoğalma oranlarını hesaplayın.

4. Yara iyileşme testi

  1. Oyuk başına 2 × 105 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalardaki tohum hücreleri.
  2. Hücreler %90 birleşime ulaştığında, hücre tek tabakasında nazikçe doğrusal bir çizik oluşturmak için steril bir 10 μL mikropipet ucu kullanın. Çizilmenin neden olduğu ayrılmış hücreleri ve kalıntıları temizlemek için kuyucukları steril PBS ile nazikçe durulayın.
  3. Ayrıca, hücreleri% 1 FBS içeren ortamda inkübe edin. Daha sonra 12, 24 ve 48 saatte yaralı bölgenin iyileşmesi için ters mikroskopla gözlemleyin ve görüntü alın.

5. Gözenekli membran ekleme testi

  1. Transfekte edilmiş veya kontrol C33a hücreleri ve HeLa dahil olmak üzere istenen hücre konsantrasyonunda (4 × 104 hücre içeren) hücre kültürü ortamında bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu membran eklerinin üst bölmesine ekleyerek eşit dağılım sağlayın. Alt hazneye tam ortam ekleyin.
  2. 24 saat inkübasyondan sonra, alt odalara göç eden hücrelerin sabitlenmesi ve boyanması için sırasıyla metil alkol ve% 0.1 kristal viyole kullanın.
  3. Görüntü almak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın ve ardından ImageJ ile en az 10 rastgele alan sayarak göç eden hücrelerin sayısını analiz edin.
    1. ImageJ ile sayı analizi için, görüntüyü ImageJ yazılımında açın, araç menüsünde Görüntü sekmesine gidin, Ayarla'yı seçin ve ardından Eşik'e tıklayın. Gerekirse, beyaz bir arka planda yalnızca hücreler görünene kadar eşik ayarlarını yapın.
    2. Bu ayarları görüntüye uygulamak için Eşik penceresinde Uygula'ya tıklayın. Şimdi, araç çubuğundan (pencerenin üst kısmında bulunur) Değnek (izleme) aracını seçin.
    3. Eşikli görüntüdeki tüm hücreleri seçmek için hücrelerin bulunduğu görüntü alanına tıklayın. Hücreler vurgulandıktan sonra, Araç menüsünde Analiz Et'e gidin ve ardından Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Parçacıkları Analiz Et penceresinde, sayıma tüm hücreleri dahil etmek için deneysel gereksinimlere göre istenen boyutu (örneğin, 0 - sonsuz) ve dairesellik değerlerini (örneğin, 0,00 - 1,00) girin.
    4. Tamam'a tıklayın ve yazılımın hücreleri saymasını ve analiz sonuçlarını içeren yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin.

6. Koloni oluşumu deneyi

  1. 24 saat boyunca 5 μM sisplatin (DDP) muamelesi olan veya olmayan 6 oyuklu bir plakada Si-NC ve Si-FAM83A gruplarının oyuklu başına 2 × 105 hücreli tohum.
  2. 24 saatlik bir ilaç tedavisinin ardından,% 0.25 tripsin kullanarak hücreleri ayırın ve% 10 FBS içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, oyuk başına 1 × 103 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve daha sonra 37 ° C sıcaklıkta% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
  3. Kolonilerin görülebildiği ~ 7-10 gün inkübasyonun ardından, hücreleri% 4 Polioksimetilen ile sabitleyin ve 20 dakika boyunca Giemsa boyama solüsyonu ile boyayın.
  4. Hücreleri hafifçe yıkayın ve plakaların kurumasını bekleyin. Mikroskopla koloni kümelerinin görüntülerini alın ve 50'den fazla hücre içeren kolonilerin sayısını sayın.

7. JC-1 boyası kullanılarak mitokondriyal membran depolarizasyonu (MMP) analizi

  1. Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir Mitokondriyal membran potansiyel test kiti kullanarak 37 ° C'de% 5 CO2 altında% 15-20 dakika boyunca 1x JC-1 boyama solüsyonu ile inkübe edin.
  3. Hücreleri yıkayın ve sırasıyla ~ 490 nm ve 590 nm'de JC-1 için uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak 200x büyütmede floresan mikroskop altında inceleyin. JC-1 floresansını görselleştirmek için, yayılan floresan sinyalini seçici olarak yakalamak için mavi uyarma filtresi (450-490 nm) ve kırmızı emisyon filtresi (uzun geçiren > 590 nm) gibi uygun filtreler kullanın.

8. mPTP'nin akış sitometrik analizi

  1. Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
  2. Kültür ortamını hücrelerden çıkarın, hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri eşit şekilde kaplamak için her biri 300 μL (1x hacim) Calcein boyama solüsyonu ve floresan söndürme çalışma solüsyonu ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ışıktan korunan bir ortamda 30-45 dakika inkübe edin ve ortamı 37 ° C'de taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. Calcein'nin hücre içi esterazlar tarafından tam hidrolizini sağlamak için hücreleri 37 ° C'de ışık korumalı bir ortamda 30 dakika daha inkübe edin, bu da hücre içi yeşil floresan Calcein oluşumuna neden olur.
  3. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile 2-3 kez yıkayın ve algılama tamponu ekleyin. Akış sitometrisi ve 488 nm'lik bir uyarma dalga boyu kullanarak hücre mPTP'sini tespit edin.

9. Akış sitometrisi

  1. Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
  2. 24 saatlik ilaç tedavisinden sonra, hücreleri 200 μL bağlayıcı tampon çözeltisinde yeniden süspanse edin ve 10 μL Annexin V-FITC ve 5 μL propidyum iyodürü (PI) hücre süspansiyonuna hafifçe karıştırın. Karışımı ışıktan kaçınarak 15 dakika inkübe edin ve hücrelere 300 μL bağlayıcı tampon çözeltisi ekleyin. 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda akış sitometrisi kullanarak hücre apoptozunu tespit edin.

10. RT-PCR analizi

  1. Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
  2. RNA ekstraksiyon reaktifini kullanarak tümör hücrelerinden toplam RNA'yı çıkarın ve ekstrakte edilen RNA'yı 42 °C'de 45 dakika ve ardından 95 °C'de 5 dakika inkübe ederek cDNA Sentez Karışımı ile tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürün.
  3. DNA polimeraz, nükleotidler, tampon ve tasarlanan gene özgü primerleri içeren PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Gerçek zamanlı PCR reaksiyonu için cDNA şablonunu reaksiyon karışımına ekleyin ve aşağıdaki termodöngü koşullarıyla gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazında PCR gerçekleştirin: 30 saniye boyunca 95 °C'de denatürasyon, ardından 5 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C'lik 40 döngü ve 15 saniye boyunca 95 °C'de erime eğrisi aşaması, 60 °C boyunca 1 dakika ve 95 °C boyunca 15 sn. Dahili kontrol olarak GAPDH kullanarak 2−ΔΔCq yöntemini kullanarak mRNA seviyelerini ölçün.
    NOT: RT-PCR reaksiyon sistemi Tablo 1'de gösterilmiştir ve primer dizileri Tablo 1'de gösterilmiştir.
    1. 2−ΔΔCq değerini hesaplamak için, örneklerdeki hedef gen ve referans gen (GAPDH) için Cq değerlerini ölçün. Her örnek için referans genin Cq değerini hedef genin Cq değerinden çıkararak ΔCq'yu hesaplayın. Bir kontrol numunesinin ΔCq'sini her bir deney numunesinin ΔCq'sinden çıkararak ΔΔCq'yi hesaplayın. Son olarak, 2'yi ΔΔCq değerinin kuvvetine yükselterek 2−ΔΔCq değerini hesaplayın.
      NOT: Cq değeri, floresan sinyalinin ayarlanan eşiğe ulaştığı döngü numarasını temsil eder.

11. Batı lekesi analizi

  1. Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
  2. Kültürlenmiş hücreleri toplayın ve kalan büyüme ortamını veya serumu çıkarmak için buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücresel proteinleri serbest bırakmak için fenilmetil sülfonil florür (PMSF) içeren RIPA Lizis Tamponu kullanarak hücreleri parçalayın. Tam lizizi sağlamak için hücreleri buz üzerinde birkaç dakika inkübe edin ve 4 ° C, 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Protein konsantrasyonunu belirlemek için süpernatanı toplayın.
  3. Üreticinin talimatlarına göre bir BCA Protein Test Kiti kullanarak hücre lizatındaki protein konsantrasyonunu belirleyin. Hücre lizatını bir yükleme tamponu ile karıştırın ve proteinleri denatüre etmek ve jel üzerinde homojen bir şekilde ayrılmayı sağlamak için karışımı 95-100 °C'de 5-10 dakika ısıtın.
  4. Her numuneden, bir SDS-PAGE jeli üzerine 30 μg toplam protein yükleyin ve SDS-PAGE'yi 80 V'luk sabit bir voltaj altında çalıştırın.
  5. Ayrılan proteinleri, 1.5 saat boyunca 200 mA akımlı bir buz banyosunda ıslak bir transfer sistemi kullanarak jelden ayrılan proteinleri bir polivinildiflorür membranına aktarın.
  6. RT'de 1 saat boyunca %0.05 Tween-20 tamponu (TBST) ile Tris tamponlu salin içinde membranı %5 yağsız sütle bloke edin ve Malzeme Tablosunda verilen ilgili antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  7. Membranı TBST ile birden çok kez yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca ikincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin, ardından TBST ile yıkayın. Gelişmiş bir kemilüminesans algılama kiti ve görüntüleyici sistemi kullanarak protein bantlarını görselleştirin.

12. İstatistiksel analiz

  1. Tüm deneysel veri noktaları bağımsız olacağından, verileri ortalama ± SD olarak sunun. İstatistiksel analiz yapın.
  2. Çoklu karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve her grubu kontrol grubuyla karşılaştırmak için Dunnett testini kullanın. İki grubu karşılaştırmak için Student'ın t-testini (eşleştirilmemiş iki kuyruklu) kullanın; P < 0.05'in anlamlı olduğunu düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TCGA veri tabanı analizi ve PCR doğrulaması

TCGA veri tabanı analizinden, FAM83A'nın diferansiyel ekspresyonunu araştırmak için 306 rahim ağzı kanseri hücresi örneğinde ve 13 normal hücre örneğinde mRNA ekspresyon seviyelerinin karşılaştırmalı bir analizini gerçekleştirdik. FAM83A serviks kanserinde yukarı regüle iken, normal servikal dokuda ekspresyonu ihmal edilebilir düzeydeydi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin hem önlenmesi hem de tedavisi için son derece önemlidir. Rahim ağzı kanseri gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir rol oynayan spesifik genlerin anlaşılması, hastalığın altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlar. Ayrıca, bu hedef genlerin belirlenmesi, yeni terapötik stratejilerin ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. Bu çalışmada, FAM83A'yı hedef gen olarak tanımlamak ve serviks kanserinde mekanik roll...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Jingzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu Vakfı (no. 2020HC06) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler ve Ortam Formülasyonu
C33aAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu
HelaAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu
Modifiye besiyeri%10 fetal sığır serumu ve + antibiyotikler (100 U/mL penisilin ve 100 U/mL streptomisin)
Antikor Bilgisi
AKT4691, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş.' 1:1.000
Bcl2 26593-1-AP, Proteintech Grubu, Inc' 1:1.000
Spaz 319677-1-AP, Proteintech Grubu, Inc. 1:2.000
Yarık-kaspaz3ABS132005; Absin Biyobilim A.Ş.' 1:1.000
Cytc10993-1-AP; Proteintech Grubu' 1:1.000
BOŞLUK 10494-1-AP, Proteintech Grubu, Inc.' 1:8.000
mTOR2983, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş.' 1:1.000
PI3K4292, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş. 1:1.000
p-AKT 4060, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş.' 1:1.000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş.' 1:1.000
p-PI3K p85 alt birimi17366, Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi A.Ş.' 1: 1.000
İkincil antikorGB23303, Servicebio' 1: 2.000
< güçlü > Malzemeler< / güçlü >
6 oyuklu plakaCorning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
BCA Protein test kiti ve nbsp;Beyotime, Çin P0011
ChemiDoc XRS Görüntüleyici Sistemi BioRad
Gelişmiş kemilüminesans tespit kiti Servicebio, Inc., Çincat. no. G2014
Floresan mikroskobu Olympus Corporation, Tokyo, Japonya
Hifair II 1st Strand cDNA Sentezi Süper Karışımı 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., Çin
Ters mikroskop Olimpos, Tokyo, Japonya;
Millicell transwell ekleri Millipore, Bedford, MA, ABD
Mitokondriyal membran potansiyel test kiti ve nbsp;Beyotime, Çin
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, Çin#ST506
Gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazı Uygulamalı Biyosistemler, Thermo Fisher Scientific. Çin.
RIPA Lizis Tamponu Beyotime Biotech, Jiangsu, Çin
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026
TRIzol reaktifi Takara Bio Inc., Otsu, Japonya
Software
Image-Pro  artı 6.0   

Kaynaklar

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454(2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172(2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697(2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87(2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302(2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

FAM83A KnockdownTümör Hücresi ProliferasyonuHücre GöçüEdU BoyamaWestern BlotAkış SitometrisiApoptotik ProteinlerKoloni Oluşumu
Rahim Ağzı Kanseri Hücre Büyümesi ve Sisplatin Duyarlılığındaki Rolünü Doğrulamak için FAM83A'nın Yıkılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.