Neovasküler Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Vasküler Morfolojisinin İndosiyanin Yeşili Anjiyografi ile Karakterizasyonu

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), yaşlı bireylerde ciddi görme kaybına yol açan yaygın bir durumdur¹. Yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde, AMD hastalarının sayısının iki katına çıkacağı ve mevcut 11 milyona kıyasla 2050 yılına kadar yaklaşık 22 milyona ulaşacağı tahmin ediliyor. Küresel olarak, tahmini AMD vaka sayısının 2040 yılına kadar şaşırtıcı bir şekilde 288 milyona ulaşması bekleniyor².

"Islak" veya neovasküler AMD olarak da bilinen koroidal neovaskülarizasyon (CNV), merkezi retinanın altında anormal kan damarlarının oluşumu nedeniyle görme üzerinde yıkıcı etkilere sahip olabilir. Bu, kanamaya, retina eksüdasyonuna ve önemli görme kaybına yol açar. Hücre dışı VEGF'yi hedef alan anti-vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) tedavilerinin kullanıma girmesi KNV tedavisinde devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, hastaların% 50'ye kadarı, sıvı birikimi ve çözülmemiş veya yeni kanamalar gibi devam eden hastalık aktivitesi ile bu tedavilere yetersiz yanıtlar sergilemektedir 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Klinik çalışmalar, CNV hastalarında anti-VEGF direncinin sıklıkla büyük kalibreli dallanan arteriyoller, vasküler döngüler ve anastomoz bağlantıları ile karakterize arteriolar CNV'nin varlığına karşılık geldiğini göstermiştir⁹. Tekrarlanan anti-VEGF tedavisi, damar anormalizasyonuna, arteriolar KNV gelişimine ve nihayetinde anti-VEGF tedavilerine dirence katkıda bulunabilir^14,15. Arteriolar KNV vakalarında, özellikle yüksek kan akımı koşulları altında, arteriyovenöz anastomoz döngülerinde yetersiz oluşturulmuş sıkı bağlantıların neden olduğu yüksek eksüdasyona bağlı kalıcı sıvı sızıntısı muhtemeldir⁹. Tersine, anti-VEGF tedavisine iyi yanıt veren bireyler kılcal CNV sergileme eğilimindedir.

Hayvan modellerini kullanarak yaptığımız çalışmalarda, yaşlı farelerde lazerle indüklenen CNV'nin arteriyolar CNV geliştirdiğini ve anti-VEGF tedavisine direnç gösterdiğini gösterdik^16,17. Tersine, genç farelerde lazere bağlı CNV, kılcal CNV gelişimine ve anti-VEGF tedavisine yüksek yanıt verilmesine yol açar. Bu nedenle, hem mekanik hem de terapötik araştırmalar için CNV vasküler tipleri arasında ayrım yapmak çok önemlidir.

Klinik ortamlarda, CNV genellikle floresein anjiyografi (FA) sızıntı modellerine (örneğin, Tip 1, Tip 2) göre sınıflandırılır, eksüdasyonu izlemek ve patolojik sızıntı alanlarını belirlemek için floresein boyası kullanır. AMD araştırmalarında, CNV ağırlıklı olarak hayvan modellerinde FA kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, FA, CNV'nin vasküler morfolojisini ortaya koyamamaktadır. Ayrıca, FA sadece görünür ışık spektrumundaki görüntüleri yakalar ve retina pigment epitelinin (RPE) altındaki koroidal vaskülatürü görselleştiremez. Buna karşılık, plazma proteinleri için güçlü afinite sergileyen indosiyanin yeşili (ICG), baskın intravasküler retansiyonu kolaylaştırır ve vasküler yapının ve kan akışının görselleştirilmesini sağlar⁹. ICG'nin yakın kızılötesi floresan özelliğinden yararlanarak, ICG anjiyografi (ICGA) kullanılarak retina ve koroid pigmentinin görüntülenmesi mümkün hale gelir. Bu bağlamda, kapiller ve arteriolar KNV'nin gözlendiği genç ve yaşlı farelerde lazerle indüklenen koroidal neovaskülarizasyonun (KNV) sızıntısını ve vasküler morfolojisini araştırmak için FA ve ICGA'yı birleştiren bir protokol sunulmuştur.

Bu çalışmada yapılan hayvan deneyleri, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri'nden (IACUC) onay almıştır. Tüm prosedürler, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirisi'nde belirtilen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışma için genç (7-9 hafta) ve yaşlı (12-16 ay) C57BL / 6J erkek ve dişi fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Görüntüleme sisteminin hazırlanması

1. Görüntüleme sırasında farenin vücut sıcaklığının korunmasını sağlamak için görüntüleme platformuna bir ısıtma yastığı yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Isıtma yastığını etkinleştirin ve sıcaklığı 35 °C'ye ayarlayın.
2. Toz kapağını çıkarın ve lazer taramalı oftalmoskopu açın. Makineye 55°'lik bir lens yerleştirin.
3. Görüntüleme yazılımını kurun (Malzeme Tablosuna bakın) ve genotip, cinsiyet, yaş vb. dahil olmak üzere temel bilgileri girin. Görüntüleme oturumu başladığında, ICGA görüntülerini yakalamak için IR'yi (Kızılötesi kanal) seçin.

2. ICGA ve FA öncesi hayvan hazırlığı

1. Gerekli anestezi miktarını (Ketamin / Ksilazin 70-100 / 2.5-10 mg / kg, Malzeme Tablosuna bakınız) belirlemek için fareyi tartın.
   NOT: Metabolik profil farklı fare suşları arasında değiştiğinden dozajı optimize etmek çok önemlidir. Görüntülemeyi tamamlamadan önce farenin uyanmasını veya aşırı doz ve potansiyel hayvan ölümü riskini önlemek için uygun dozu belirlemek önemlidir.
2. İntraperitoneal enjeksiyon ile anestezi vermek için 30-32 G iğneli 1 mL steril şırınga kullanın. Farenin yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol etmek için farenin pençelerinden birini hafifçe sıkıştırın. Hayvan herhangi bir tepki veya hareket gösterirse, bir sonraki adıma geçmeden önce ek süre beklemeniz önerilir. Bu, hayvanın yerleşmesine izin verir ve sonraki prosedürler için en uygun koşulları sağlar.
3. Farenin her iki gözünü genişletmek için% 1 tropikamid oftalmik solüsyon damlası uygulayın. Göz hareketini ve göz kırpmayı azaltmak için her iki gözde% 0.5 proparakain hidroklorür damlaları ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanmadan önce en az 30 saniye bekleyin. Bunu kayganlaştırıcı göz jeli damlaları ile takip edin.
   NOT: Tüm anestezi süresi boyunca, farenin gözlerinde kornea opaklığına yol açabilecek aşırı kuruluk sorununu ele almak önemlidir. Bu opaklık, engellenen görüş nedeniyle sonraki görüntülemeyi zorlaştırır. Bunu önlemek için, farenin gözlerini nemli tutmak için sürekli olarak kayganlaştırıcı göz jeli damlaları uygulamak çok önemlidir.
4. Fareyi bir ısıtma suyu yastığına yerleştirin.
   NOT: Fareler, yüksek bir yüzey alanı/hacim oranına sahiptir ve bu da çevreye ısı kaybının artmasına neden olur. Anestezinin neden olduğu sıcaklık düşüşü ile birleştiğinde, bu fare için önemli bir risk oluşturabilir ve potansiyel olarak hipotermi nedeniyle ölüme yol açabilir. İşlem sırasında hipotermiyi önlemek ve farenin sağlığını sağlamak için gerekli önlemleri almak çok önemlidir.
5. 2 mg/mL ICG ve 20 mg/mL Floresein boyadan oluşan 1:1 hacimlik bir karışım hazırlayın (bkz. 1 mL'lik bir şırınga ve 32 G'lik bir iğne kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla karışımın 250 μL'sini uygulayın.
   1. Herhangi bir organın delinmesini önlemek için iğneyi farenin karnının sol alt çeyreğine, arka bacakların yakınında, farenin derisine paralel bir açıyla sokun.
   2. Pistonu dikkatlice geri çekin ve şırınga kapağına kan girmediğini doğrulayın. Tutarlı bir tempoyu koruyarak boyayı yavaş ve istikrarlı bir şekilde enjekte etmeye devam edin.
      NOT: ICG boyası kullanımdan önce 0.22 μm şırınga filtresi ile filtrelenmelidir.

3. ICGA ve FA

1. Görüntülemeye başlamak için fareyi görüntüleme platformunun ısıtma yastığına yerleştirin.
2. Farenin gövdesini kameraya 45 derecelik bir açıyla konumlandırın ve başını hafifçe aşağı doğru döndürün. Bu, optik sinirin kameranın odağının merkezinde olmasını sağlar.
3. Bir pamuklu çubuk kullanarak, ilk önce görüntülenen göz üzerindeki kayganlaştırıcı göz damlası veya jel tabakasını çıkarmak için gözü nazikçe silin. Görüntüleme prosedürünü tamamladıktan hemen sonra kayganlaştırıcı jel damlalarını uyguladığınızdan emin olun.
   NOT: Anestezi altındayken gözün 1 dakikadan fazla yağlanmadan bırakılması önerilmez.
4. Kamerayı farenin gözüne doğru hareket ettirin. Alım modülünden FA kanalını seçin. FA kanalından yayılan lüminesans, daha hızlı yerleştirme için fare korneasının ortasına konumlandırmak için kullanılabilir.
5. Farenin kafasını, optik sinir ekranda ortalanacak şekilde konumlandırın ve lazer tarama oftalmoskopunu belirli bir açıyla eğme ihtiyacını ortadan kaldırın. İstenen hizalamayı elde etmek için farenin kafa konumunda küçük ayarlamalar yapın.
6. Alım modülünde ICGA kanalını seçin. Lazer yoğunluğunun %100 olarak ayarlandığından emin olun ve uygun lensle eşleşmesi için 55° seçeneğini seçin. Bu, lazer taramalı oftalmoskop için en uygun ayarları sağlar.
   NOT: Aşırı doygunluğu önlemek için, erken evreyi görüntülerken tipik olarak %25-50 civarında daha düşük bir lazer yoğunluğu kullanmak gerekebilir. Lazer yoğunluğunun bu aralıkta ayarlanması, aşırı doygunluğa neden olmadan net ve doğru görüntüler yakalamaya yardımcı olabilir.
7. Göz, görüntüleme yazılımında tüm ekranı kapladığında, CNV membranının en net görüntüsünü elde etmek için hassasiyet ve odak ayarlarında ayarlamalar yapın.
   1. Görüntünün hassasiyetini ayarlamak için çekim modülündeki yuvarlak siyah düğmeyi döndürün.
   2. Odağı ayarlamak için oftalmoskop üzerindeki düğmeyi çevirin. FA kullanarak retina damar sistemini görselleştirmek için en uygun odak tipik olarak 35-45 D (diyoptri) aralığındadır. Öte yandan, ICGA kullanarak koroidi görselleştirmek için ideal odak genellikle 10-15 D arasındadır.
      NOT: CNV membranının farklı boyutları nedeniyle, vasküler morfolojinin optimal görüntülenmesini sağlamak için odağı 10-30 D'de ayarlamak gerekebilir.
8. Odak ve hassasiyet mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek için ayarlandıktan sonra, görüntüyü normalleştirmek için çekim modülündeki yuvarlak siyah düğmeye basın. Normalleştirme tamamlandığında (tüm kareler yakalandığında), görüntüyü kaydetmek için dokunmatik ekran panelindeki edin düğmesine tıklayın. CNV'yi farklı açılardan görüntülemek için kamerayı hareket ettirmek gerekebilir. Fare, CNV lezyonunun en iyi görüntüsünü sağlamak için farklı pozisyonlarda da yönlendirilebilir.
   NOT: Optik sinirden daha uzaktaki damar sistemini görüntülerken lazer taramalı oftalmoskopun odağını veya konumunu yeniden ayarlamak gerekebilir.
9. Toplama modülünü kullanarak FA kanalına geri dönün. CNV lezyonunun sızıntısını yakalamak için her görüntünün hassasiyetini ve odağını ayarlamak için 3.6-3.7 adımlarında listelenen adımları tamamlayın.
   NOT: CNV sızıntısının aşırı doygunluğunu önlemek ve sızıntı alanını yapay olarak artırmak için doğru hassasiyetin seçildiğinden emin olun.
10. Enjeksiyondan 3-4 dakika sonra ICGA ve FA'nın "erken fazını" görüntüleyin.
    NOT: "Erken evre", koroid damar sisteminin açık ve belirgin bir şekilde görülebildiği zamandır. Tipik olarak 4-8 dakika arasında meydana gelen orta fazda, retina ve koroid damarları çok daha soluk ve dağınıktır. Geç faz (>8-10 dakika) başladığında, hem koroid hem de retina damarları ayırt edilemez hale gelir. Bununla birlikte, hiperfloresan KNV lezyonları, azalmış arka plana karşı maksimum kontrast sergiler. Bahsedilen bu zamanlamalar değişkendir ve enjekte edilen ICG boyasının konsantrasyonuna ve miktarına bağlıdır. Daha fazla miktarda ICG boyası, her fazın zaman çizelgesini artırma ve daha belirgin damarlar sağlama eğilimindedir. Bir aşama, mutlak bir zamandan ziyade yukarıda listelenen temel özelliklere göre tanımlanmalıdır.
11. Tüm görüntüler elde edildikten sonra, farenin gözüne bir jel yağlayıcı veya merhem sürün ve kurtarma için fareyi ısıtma yastığı üzerinde dikkatlice izleyin. Farenin tamamen iyileşmesi genellikle 1,5 saat sürer.
12. Fareleri, anesteziden tamamen kurtulduktan ve uyandıktan sonra kafeslerine ve belirlenen tutma alanına geri yerleştirin.
13. Görüntüleme sistemini ve lazeri kapatmadan önce, sonraki analizler için görüntüleri TIFF veya JPEG dosyaları olarak dışa aktarın.

4. RPE / koroid düz montaj ve boyama

1. Gözleri gece boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Gözleri PBS ile üç kez yıkayın. Lensi ve korneayı çıkarın.
2. Gözleri oda sıcaklığında 1 saat bloke edici solüsyonda (% 10 sığır serum albümini,% 0.6 Triton X-100 PBS'de) inkübe edin. PBS yıkamasını üç kez tekrarlayın.
3. Gözleri izolektin GS-IB4 Alexa-un 568 konjugatı ve anti-α-düz kas aktin antikoru (bkz. Malzeme Tablosu) ile gece boyunca bloke edici solüsyonda inkübe edin.
4. PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri bir Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 2 saat.
5. Kenardan ekvatora 4 radyal kesim yapın. Retinayı^{dikkatlice çıkarın 17}.
   NOT: Neovasküler membranın kazara ayrılmamasına dikkat edilmelidir.
6. Düz monte edilmiş koroidi bir cam kızak üzerine monte edin. Konfokal mikroskopi kullanarak CNV'yi görselleştirin.

Protokolü takiben, genç (7-9 hafta) ve yaşlı (12-16 ay) C57BL / 6J farelerde lazerle indüklenen CNV'ye ICGA ve FA uygulandı. FA, KNV lezyonlarının yeri ve sızıntısı hakkında bilgi verirken (Şekil 1, sol paneller), ICGA KNV lezyonlarının vasküler morfolojisini ortaya koyar (Şekil 1, sağ paneller). Genç farelerde, kılcal CNV, CNV lezyonlarına hakimdir. Buna karşılık, yaşlı fareler, büyük kalibreli damarlar, vasküler döngüler ve anastomoz bağlantıları ile karakterize arteriolar CNV sergiler. Hem genç hem de yaşlı fareler, FA'da retina damar sisteminin net görünürlüğünü gösterir (Şekil 1, sol paneller). Genç farelerin ICGA görüntülerinde, retina damar sistemi görünmez ve koroid damarları soluk görünür, bu da koroidal vaskülatüre odaklanarak ICGA'nın orta fazını gösterir. Yaşlı farelerin ICGA görüntülerinde, koroid damarları soluk görünürken kısmi retinal vaskülatür gözlenebilir, bu da yaşlı farelerde arteriolar CNV'nin daha büyük boyutu nedeniyle retina ve koroid arasındaki odak ile orta fazı düşündürür. Yaşlı farelerde arteriolar CNV, genç farelerde kılcal CNV'ye kıyasla daha büyük CNV boyutu (Şekil 2) ve önemli ölçüde daha fazla sızıntı sergiler. Bir anti-düz kas aktin antikoru ile immün boyama, yaşlı farelerde CNV damar sistemini kapsamlı bir şekilde etiketleyerek arteriolar morfolojiyi doğrular (Şekil 3). Buna karşılık, genç farelerin lezyon bölgesi vaskülatüründe kılcal morfoloji ile tutarlı olarak α-düz kas aktini ile minimal boyama gözlenir.

Şekil 1: Genç ve yaşlı farelerde lazerle indüklenen CNV'yi gösteren FA ve ICGA görüntülerinin karşılaştırılması. FA görüntüleri, KNV lezyonlarının sızıntısını gösterirken, ICGA vasküler morfolojinin görüntülenmesini sağlar. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ICGA görüntülerine dayalı olarak genç ve yaşlı farelerde CNV lezyon boyutunun ölçülmesi. CNV alanları, genç ve yaşlı farelerde sırasıyla analiz edilen toplam 26 ve 14 lazer noktası ile ölçüldü. Hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil eder. İstatistiksel analiz, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. P < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Genç ve yaşlı farelerde CNV lezyonlarının temsili görüntüleri, RPE / koroid düz yuvalarında Alexa 568 izolektin ve anti-α-düz kas aktin antikoru ile birlikte etiketlenmiştir. Kırmızı renk Alexa 568 izolektini, yeşil renk ise α-düz kas aktinini (SMA) temsil eder. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.