Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Agrobacterium rhizogenes Bazlı Tüylü Kök Dönüşümü ile Kompozit Bitkilerin Üretilmesi İçin Verimli ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Agrobacterium rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü kullanılarak transgenik kökleri ve transgenik olmayan gövdeleri ve tomurcukları olan kompozit bitkiler üretmek, kökle ilgili biyolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır. Tüylü kök transformasyonu, çok çeşitli dikotiledonlarda ve birkaç monokotiledon türünde kurulur ve neredeyse genotipten bağımsızdır. Kompozit bitkiler elde etmek için A. rhizogenes ile geleneksel hipokotil enjeksiyonu yöntemi verimsiz, zaman alıcı, zahmetlidir ve sıklıkla hassas ve küçük hipokotil bitkilerin ölümüne neden olur. Daha önce A. rhizogenes'in aracılık ettiği yüksek verimli, tek aşamalı bir tüylü kök dönüşümü kurulmuştu, bu da tüylü kökler üretildikten sonra ekim ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Bu çalışmada, kısmi bir hipokotil ve primer kök çıkarıldı, hipokotil insizyon bölgesi A. rhizogenes ile kaplandı ve daha sonra hipokotiller steril vermikülit içine ekildi. 12 günlük ekimden sonra hipokotil insizyonu genişledi ve yeni tüylü kökler indüklendi. Bu makale, A. rhizogenes'in aracılık ettiği tek aşamalı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü ve etkinliği yabani soya fasulyesi, Solanum americanum ve balkabağının kompozit bitkilerinin üretilmesiyle gösterilmiştir.
Giriş
Agrobacterium rhizogenes, Rhizobiaceae familyasından gram negatif bir toprak bakterisidir. A. rhizogenes, hemen hemen tüm dikotiledonları, birkaç monokotiledonu ve bireysel açık tohumluları yaralar yoluyla enfekte edebilir ve enfekte bitkilerde tüylü kökler üretebilir. Bakteri, Ri (kök indükleyici) plazmidini taşır ve Ri plazmidinin T-DNA'sı, opin sentez genini ve rol genlerini (kök lokus genleri) taşır. Ri plazmidinin T-DNA'sı bir bitki hücresine girdikten ve bir konakçı kromozomuna entegre edildikten sonra, rol genlerinin ekspresyonu tüylü köklerin üretimini indükler1. Bir hedef geni taşıyan bir b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bitki büyüme koşulları ve A. rhizogenes kültürü
- Tohum ekimi
NOT: Yabani soya fasulyesi tohumları Yanggu İlçesi, Liaocheng, Çin'de toplandı; S. americanum tohumları ve yerel kabak çeşidi Yinsu bir pazardan satın alındı.- Yabani soya fasulyesi, S. americanum ve yerel balkabağı çeşidi tohumlarını toplayın, 1 cm derinlikte vermikülit içine ekin ve iyice sulayın. 8 cm x 11 cm x 9 cm plastik kutulara 20 tohum ekin. Bitkileri 24 ± 2 °C'de, yaklaşık% 70 bağıl nemde 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü ile bir büyüme odasında yetiştirin.
NOT: Yabani soya fasulyesi tohumlarının katları ekimden önce kırı....
- Yabani soya fasulyesi, S. americanum ve yerel balkabağı çeşidi tohumlarını toplayın, 1 cm derinlikte vermikülit içine ekin ve iyice sulayın. 8 cm x 11 cm x 9 cm plastik kutulara 20 tohum ekin. Bitkileri 24 ± 2 °C'de, yaklaşık% 70 bağıl nemde 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü ile bir büyüme odasında yetiştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yüksek verimli tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü
Tüylü kökler, tasarlanmış K599 ile aşılamadan 12 gün sonra hipokotil insizyon bölgesinde üretildi. Transgenik kıllı kökler, ikili vektörde bulunan raportör genin ekspresyonuna göre belirlendi. Kompozit yabani soya fasulyesi, S. americanum ve balkabağının raportör geni DsRed2 ile transforme edilen transgenik kökler, doğal (Şekil 2A, Şekil 2C ve Şekil 2E) ve yeşil uyarma ışığı (Şekil
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök yöntemi, kompozit bitkiler üretmek için hipokotil enjeksiyon yönteminden daha basit ve daha verimli bir yöntemdir. Tek adımlı ARM yöntemi, tüylü kök dönüşümünün verimliliğini önemli ölçüde artırır, tüylü kök üretme süresini kısaltır, tüylü kök sayısını artırır ve ilgili iş miktarını azaltır. Geliştirilmiş transformasyon protokolü, baklagil bitkileri ile rizobi arasındaki ve bitkiler ile arbusküler mikorizal mantarlar arasındaki simbiyozlar üzerine yapılan çalışmalar içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Liaocheng Üniversitesi Araştırma Fonu (318012028) ve Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2020MC034) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| kanamisin | Sangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd. | ||
| LB orta | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| plastik kutu | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| balkabağı | yerel çeşidi Yinsu | ||
| streptomisin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi makine | Tanon Co., Ltd., Çin | 5200Multi | kemilüminesans görüntüleme sistemi |
| domates | yerel çeşidi Zhongshu4 | ||
| yabani soya fasulyesi | , Yanggu İlçesi, Liaocheng, Çin'de toplandı |
Kaynaklar
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
