Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), esas olarak bağışıklık tepkisini modüle etme potansiyelleri nedeniyle şiddetlenen inflamasyonu durdurmak için yeni bir terapötik yaklaşım olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. MSC'ler, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonuna ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavinin kullanımına dayalı olarak immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir. Bu hücreler, en yaygın olarak kullanılanı kemik iliği ve yağ dokuları olmak üzere birkaç dokudan izole edilebilir. MSC'leri farelerin epididimal yağ dokusundan izole etmek, kültürlemek ve karakterize etmek için kolay bir protokol sunuyoruz. Epididimal yağ dokusu cerrahi olarak eksize edilir, fiziksel olarak parçalanır ve %0.15'lik kollajenaz tip II solüsyon ile sindirilir. Daha sonra, primer yağ dokusu kaynaklı kök (ADSC'ler) hücreler in vitro olarak kültürlenir ve genişletilir ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon gerçekleştirilir. Ayrıca, ADSC'leri osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere ayırmak için adımlar ve ardından her hücre soyunun fonksiyonel karakterizasyonunu sağlıyoruz. Burada sağlanan protokol, in vivo ve ex vivo deneyler için kullanılabilir ve alternatif olarak, adipoz türevli kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için kullanılabilir.
Giriş
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), osteoblast, kondroblast ve adiposit 1,2 gibi hücrelere farklılaşan yetişkin çok potansiyelli hücrelerdir. Bu hücreler birkaç organda bulunur ve bu nedenle kemik iliği, kas, yağ, kıl folikülü, diş kökü, plasenta, dermis, perikondriyum, göbek kordonu, akciğer, karaciğer ve dalak gibi yetişkin dokulardan çıkarılabilirler 3,4.
MSC'lerin fizyoloji ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri bildirilmiştir 5,6. Bu hücr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, hayvan etiği için uluslararası yönergelere göre yürütüldü ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi'nden kurumsal bakım ve kullanım komiteleri tarafından 021/22 protokol numarası altında onaylandı. İsviçreli erkek fareler (6-8 hafta), Hayvan Yetiştirme, Bakım ve Deney Laboratuvarı - Santa Cruz Eyalet Üniversitesi (LaBIO-UESC) Hayvan Araştırma Tesisi'nden alındı, belirli patojen içermeyen koşullarda tutuldu, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüleri ile su ve yiyecek ad libitum aldı.
NOT: Diğer fare soyları kullanılabilir; Yetişkin farelerin (6-8 hafta) daha gelişmiş yağ dokusuna ve yüksek proliferatif aktiviteye sahip hücrelere....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan protokole göre yağ dokusundan ekstrakte edilen hücreler, ISCT tarafından önerilen MSC'ler için minimum kriterlere uyan morfoloji gösterdi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Fenotipik olarak, ADSC'ler hücre kültürünün ilk günlerinde plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye bağlılık göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca homojen bir şekilde büyüdüler ve koloniler oluşturdular. Ayrıca, ADSC'ler hematopoietik belirteçler olan CD34 (%2.1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MSC'ler farklı dokulardan çıkarılabilir. Kemik iliği hem murinlerde hem de insanlarda ortak bir MSC kaynağını temsil etmesinerağmen 25,26, MSC'lerdeki zenginliği, vücuttaki dağılımı ve ona erişim kolaylığı nedeniyle bu çalışmada yağ dokusu ile çalışmayı seçtik. Alternatif olarak, adipoz kaynaklı kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için kullanılabilir27.
Çıkarmanın bazı noktaları, bu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) ve Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) tarafından sağlanan bir hibe ile desteklenen araştırma. Bu çalışma kısmen PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85) tarafından finanse edilmiştir. MGAG ve URS, sırasıyla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından verilen burs sayesinde.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 140 & derece; C Yüksek Isı Sterilizasyonu CO2< / sub> İnkübatörü | RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, Çin | C180 | |
| 3-İzobutil-1-metilksantin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | I7018 | |
| Asetik asit buzul | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | PHR1748 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | A9186 | BioReagent, glikoproteinlerin tespiti için uygundur. Asetik asitte %1, pH 2.5 |
| Alkol %70 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 65350-M | %70 suda |
| Amfoterisin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | PHR1662 | |
| Antikorlar anti-fare anti-CD29 FITC (Klon Ha2 / 5) | BD Biosciences, San Diego, CA, ABD | 555005 | Hücredeki fonksiyonlar: Adezyon ve aktivasyon, embriyogenez, Lökositler, DC, trombositler, mast hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri |
| Antikorlar anti-fare anti-CD34 PE (Klon RAM34) | BD Biosciences, San Diego, CA, ABD | 551387 | Hücredeki fonksiyonlar: Hücre adezyon faktörü. Hematopoetik kök hücreler |
| Antikorlar anti-fare anti-CD45 APC (Klon 30-F11) | BD Biosciences, San Diego, CA, ABD | 559864 | Hücredeki fonksiyonlar: Lökositlerin aktivasyonuna yardımcı olur |
| Antikorlar anti-fare anti-CD71 FITC (Klon C2) | BD Biosciences, San Diego, CA, ABD | 553266 | Hücredeki fonksiyonlar: Hücre çoğalması sırasında demir alımını kontrol eder. Çoğalan hücreler, retikülositler ve öncüler |
| Antikorlar anti-fare anti-CD90 PerCP (Klon OX-7) | BD Biosciences, San Diego, CA, ABD | 557266 | Hücredeki fonksiyonlar: Sinyalleşme, yapışma. T lenfosit, NK, monosit, HSC, nöron, fibroblast |
| Askorbik asit | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | PHR1008 | |
| Otomatik pipetler | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD | 4700850N | Finnpipette F1 İyi Laboratuvar Pipetleme (GLP) Kitleri |
| Ölçek | Uygulanamaz | 1 birim | |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | A7906 | |
| Hücre kültürü plakaları (6 kuyulu) | Merck, Darmstadt, Almanya | Z707759 | 07 birim steril. TPP doku kültürü plakaları |
| Hücre kültürü plakaları (96 oyuklu. Yuvarlak veya V alt) | Merck, Darmstadt, Almanya | CLS353077 | 01 birim steril. Wells, 96, Doku Kültürü (TC) ile muamele edilmiş yüzey, yuvarlak dipli açık kuyular, steril |
| Kondrojenik ortam | Kök Pro Kondrogenez Farklılaşması– Yaşam Teknolojileri | A1007101 | TGF-β 2, TGF-β 3, deksametazon, insülin, transferrin, ITS, sodyum-l - askorbat, sodyum piruvat, askorbat-2-fosfat |
| Kollajenaz tip II | Life Technologies, California, ABD | 17101015 | |
| alüminyum kaplı mantar veya strafor levha | Uygulanamaz | 1 birim | |
| pamuk | Uygulanamaz | 50 g | |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | D4902 | |
| Diseksiyon makası | Uygulanamaz | 03 birim steril | |
| DPX Histoloji için mountant | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 6522 | |
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | D5523 | 1000 mg/L glikoz ve L-glutamin içeren, sodyum bikarbonat içermeyen, toz, hücre kültürüne uygun |
| Eosin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 861006 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | F4135 | |
| Formaldehit | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 47608 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | HT501128 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | G1397 | |
| Hematoksilen | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | H3136 | |
| Hipodermik İğne (0,3 mm x 13 mm) | Uygulanamaz | 5 adet | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | I0200000 | |
| İnsülin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | I3536 | |
| İzopropanol | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 563935 | H2O |
| Ketamin-D4 hidroklorür çözeltisinde %70 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | K-006 | Metanol içinde 1.0 mg / mL (serbest baz olarak), sertifikalı referans malzemesi, Cerilliant & reg; |
| Neubauer odası | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | BR718620 | MARKA sayma odası BLAUBRAND Neubauer deseni. Klipsli, çift çizgili |
| Nichiryo pipet uçları (0.1– 10 & mu; L) | Merck, Darmstadt, Almanya | Z645540 | Hacim aralığı 0.1– 10 & mu; L, uzun, toplu paket. Steril |
| Nichiryo pipet uçları (1– 10 mL) | Merck, Darmstadt, Almanya | Z717401 | Ses aralığı 1– 10 mL, evrensel, toplu paket. Steril |
| Nichiryo pipet uçları (200 μ L) | Merck, Darmstadt, Almanya | Z645516 | Maksimum hacim 200 μ L, mezun, mini yığın. Steril |
| Yağ-Kırmızı O çözeltisi | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | O1391 | izopropanol Parafin içinde% 0.5 |
| Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 107.151 | 46– 48, blok formunda | |
| Penisilin / Streptomisin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | P4333 | Çözelti, 10.000 ünite penisilin ve 10 mg streptomisin / mL, 0.1 & mu ile stabilize edilmiştir; m filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun |
| Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi 1x (PBS). | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | P3813 | Tozu, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için. Dengeli ve steril |
| Polipropilen konik tüpler (15 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-959-53A | Steril |
| Polipropilen konik tüpler (50 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-432-22 | 2 adet steril |
| neşter (opsiyonel) | Uygulanamaz | 1 birim | |
| Gümüş nitrat | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 85228 | |
| Sodyum tiyosülfat | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | 72049 | |
| Cerrahi cımbız (15 cm) | Uygulanamaz | 3 birim steril | |
| İsviçre erkek faresi (6– 8 hafta) | Bioterium, Santa Cruz Eyalet Üniversitesi | 021/22 | |
| şırınga (1 mL) | Uygulanamaz | 1 birim | |
| Tripan Mavi Boya | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | T8154 | %0.4, sıvı, steril filtreli, hücre kültürü için uygun |
| Tripsin/EDTA (etilendiamintetraasetik asit) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | T3924 | |
| Ksilazin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | PHR3263 | |
| β-gliserofosfat disodyum tuzu hidrat | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD | G9422 | BioUltra, hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, > %99 (titrasyon) |
Kaynaklar
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
- Lin, W., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
