Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), osteoblast, kondroblast ve adiposit ^1,2 gibi hücrelere farklılaşan yetişkin çok potansiyelli hücrelerdir. Bu hücreler birkaç organda bulunur ve bu nedenle kemik iliği, kas, yağ, kıl folikülü, diş kökü, plasenta, dermis, perikondriyum, göbek kordonu, akciğer, karaciğer ve dalak gibi yetişkin dokulardan çıkarılabilirler ^3,4.

MSC'lerin fizyoloji ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri bildirilmiştir ^5,6. Bu hücreler, hem insan hem de veterinerlik tıbbında çeşitli hastalıkların tedavisi için umut verici olmuştur. MSC'ler, hücre-hücre teması, çözünür faktörler ve küçük hücre dışı veziküller 7,8,9,10 gibi farklı mekanizmalar yoluyla iltihabı kontrol edebilir ve anjiyogenez ve doku homeostazını teşvik edebilir. Ayrıca, MSC'ler, immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir, çünkü bu hücreler sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonunu gösterir ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavide kullanılır^11,12. Rejeneratif potansiyel ile birleşen düşük immünojenisite, MSC'leri greft-versus-host hastalığı (GvHD)¹³, sistemik lupus ^{eritematozus14} ve multipl skleroz 15 gibi hücre tedavisi için ideal adaylar haline getirir^16,17.

MSC'lerin birkaç yetişkin dokuda bulunmasına rağmen, yağ dokusu, minimum cerrahi müdahale ile hasat için erişilebilirlik gibi diğer kaynaklara göre avantajlar sunar; yüksek genleşme oranına sahip çok sayıda kullanılabilir hücre; ve özel ekipman ve düşük maliyetli malzemelere ihtiyaç duymadan gerçekleştirmesi kolay bir protokol kullanarak kolay in vitro genişletme 18,19,20. Ekstrakte edildikten sonra, yağ dokusu kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler), Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği (ISCT)²¹ tarafından belirlendiği şekilde karakterize edilmelidir. Bu nedenle, MSC'ler morfoloji fibroblast benzeri, plastik kültüre bağlılık, endoglin (CD105), ekto-5'-nükleotidaz (CD73) ve Thy-1 (CD90) gibi mezenkimal belirteçlerin yüksek bir yüzdesini (% ≥95) ve lökosit ortak antijeni (CD45), transmembran fosfoglikoprotein (CD34), glikolipid bağlantılı membran glikoproteini (CD14), integrin alfa M (CD11b), B hücresi antijen reseptörü kompleksi ile ilişkili protein alfa zinciri (CD79α) gibi hematopoietik belirteçlerin düşük yüzdesini (% ≤2) ifade etmelidir. B-lenfosit yüzey antijeni B4 (CD19) ve sınıf II insan lökosit antijeni (HLA-II). Ayrıca, fonksiyonel bir karakterizasyon gereklidir ve hücreler osteoblast, kondroblast veya adipoblast hücrelerine farklılaşabilmelidir²¹.

Burada, in vitro çalışmalar için mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak epididimal yağ dokusundan MSC'lerin nasıl elde edileceğini ve ISCT ile önceden belirlenmiş morfolojik karakterizasyonu gösteriyoruz.

Tüm hayvan deneyleri, hayvan etiği için uluslararası yönergelere göre yürütüldü ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi'nden kurumsal bakım ve kullanım komiteleri tarafından 021/22 protokol numarası altında onaylandı. İsviçreli erkek fareler (6-8 hafta), Hayvan Yetiştirme, Bakım ve Deney Laboratuvarı - Santa Cruz Eyalet Üniversitesi (LaBIO-UESC) Hayvan Araştırma Tesisi'nden alındı, belirli patojen içermeyen koşullarda tutuldu, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüleri ile su ve yiyecek ad libitum aldı.

NOT: Diğer fare soyları kullanılabilir; Yetişkin farelerin (6-8 hafta) daha gelişmiş yağ dokusuna ve yüksek proliferatif aktiviteye sahip hücrelere sahip oldukları için kullanılmasını öneriyoruz.

1. Hazırlık

NOT: Devam etmeden önce, aşağıda açıklanan aşağıdaki reaktifleri hazırlayın. Reaktif ve malzeme tedarikçisi bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın. Tüm pratik prosedürlerde maskeler, boneler, laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.

1. Epididimal yağ dokusu ekstraksiyonu
   1. Ameliyat malzemelerini ayırın: üç set steril cımbız ve makas, beş iğne ve 200 mL p etanol içeren bir beher.
   2. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazini (10 mg / kg) karıştırarak bir terminal anestezik hazırlayın.
2. ADSC kültürü
   1. Bazal ortam: fetal sığır serumu (FBS), 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL amfoterisin B, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikoz ortamını hazırlayın.
   2. Özet çözeltisi: 0.25 μm'lik bir filtrede sterilize edilmiş PBS'de% 0.15 kollajenaz tip II hazırlayın.
      NOT: Bazal besiyerinde tarif edilen dört antibiyotiğin kullanılması gerekli değildir. Bunun gerçekleştirildiği laboratuvarın hücre kültürü koşullarına bağlı olacaktır.
3. ADSC'lerin fenotipik karakterizasyonu
   1. PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
   2. Anti-fare antikorlarını Tablo 1'de belirtildiği gibi seyreltin.
   3. PBS'de% 2 formaldehit hazırlayın.
4. ADSC'lerin osteojenik farklılaşması
   1. Osteojenik farklılaşma ortamı: 5.67 M askorbik asit, 10 nM deksametazon, 0.02 M β-gliserofosfat, FBS ve %1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM hazırlayın.
   2. Von Kossa boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: suda p etanol, suda %5 gümüş nitrat, damıtılmış su, suda %5 sodyum tiyosülfat ve suda %1 eozin B.
5. Adipojenik farklılaşma:
   1. Adipojenik farklılaşma ortamı: 0.5 mM 3-İzobutil-1-metilksantin, 200 μM indometasin, 1 μM deksametazon, 10 μM insülin,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.
   2. Yağ kırmızısı boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: deiyonize suda formalin, deiyonize suda ` izopropanol, ` izopropanol içinde lizokrom (yağda çözünen boya) diazo boya (Yağ-Kırmızı O çözeltisi) ve deiyonize suda %1 hematoksilin.
6. Kondrojenik farklılaşma:
   1. Kondrojenik farklılaşma ortamı: FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş kondrojenik ortam hazırlayın.
   2. PBS'de% 10 formaldehit hazırlayın.

Burada sunulan protokole göre yağ dokusundan ekstrakte edilen hücreler, ISCT tarafından önerilen MSC'ler için minimum kriterlere uyan morfoloji gösterdi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Fenotipik olarak, ADSC'ler hücre kültürünün ilk günlerinde plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye bağlılık göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca homojen bir şekilde büyüdüler ve koloniler oluşturdular. Ayrıca, ADSC'ler hematopoietik belirteçler olan CD34 (%2.12) ve CD45 (%1.81) ekspresyonu düşük, CD71 (B.6), CD29 (t.2) ve CD90 (U.1) ekspresyonu yüksek olarak tüm mezenkimal hücre belirteçleri olarak görüldü (Şekil 2B).

Şekil 2: Yağ dokusu kaynaklı hücrelerin fenotipik karakterizasyonu. (A) Kültürün 2, 4 ve 8. günlerinde yuvarlaktan fibroblast benzerine değişen ADSC morfolojisi; ölçek çubuğu = 22.22 μm. (B) ASC tarafından ifade edilen (CD71, CD29 ve CD90) veya ifade edilmeyen (CD34 ve CD45) belirteçler için histogramlar. Bu rakam Miranda ve ark.24'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İşlevsel olarak, ADSC'ler, 14 veya 21 gün boyunca her soy için şartlandırılmış ortamda kültürlendiğinde osteoblast, adipoblast ve kondroblasta farklılaşmak için çoklu etki gösterdi (Şekil 3). Von Kossa boyaması, osteogenez sürecinin karakteristiği olan ekstraselüler matrikste mineralize nodülleri ortaya çıkardı (Şekil 3). Yağ kırmızısı O boyaması, ADSC'lerin sitoplazmasında lipid vakuollerini kanıtladı ve Alcian Blue boyaması, hücre dışı matriste glikozaminoglikan varlığını doğruladı (Şekil 3). Birlikte, fenotipik ve fonksiyonel özellikler, epididimal yağ dokusundan ekstrakte edilen hücre popülasyonunu MSC'ler olarak doğrulamıştır.

Şekil 3: Yağ dokusu kaynaklı hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu. Kültürde 14 ve 21 gün sonra ADSC'nin osteojenik, adipojenik ve kondrojenik çok soylu potansiyeli. Ölçek çubuğu = 50 μm (üst panel), 100 μm (orta ve alt paneller). Bu rakam Miranda ve ark.24'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.