Yöntem makalesi

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 Ocak 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), esas olarak bağışıklık tepkisini modüle etme potansiyelleri nedeniyle şiddetlenen inflamasyonu durdurmak için yeni bir terapötik yaklaşım olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. MSC'ler, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonuna ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavinin kullanımına dayalı olarak immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir. Bu hücreler, en yaygın olarak kullanılanı kemik iliği ve yağ dokuları olmak üzere birkaç dokudan izole edilebilir. MSC'leri farelerin epididimal yağ dokusundan izole etmek, kültürlemek ve karakterize etmek için kolay bir protokol sunuyoruz. Epididimal yağ dokusu cerrahi olarak eksize edilir, fiziksel olarak parçalanır ve %0.15'lik kollajenaz tip II solüsyon ile sindirilir. Daha sonra, primer yağ dokusu kaynaklı kök (ADSC'ler) hücreler in vitro olarak kültürlenir ve genişletilir ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon gerçekleştirilir. Ayrıca, ADSC'leri osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere ayırmak için adımlar ve ardından her hücre soyunun fonksiyonel karakterizasyonunu sağlıyoruz. Burada sağlanan protokol, in vivo ve ex vivo deneyler için kullanılabilir ve alternatif olarak, adipoz türevli kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), osteoblast, kondroblast ve adiposit 1,2 gibi hücrelere farklılaşan yetişkin çok potansiyelli hücrelerdir. Bu hücreler birkaç organda bulunur ve bu nedenle kemik iliği, kas, yağ, kıl folikülü, diş kökü, plasenta, dermis, perikondriyum, göbek kordonu, akciğer, karaciğer ve dalak gibi yetişkin dokulardan çıkarılabilirler 3,4.

MSC'lerin fizyoloji ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri bildirilmiştir 5,6. Bu hücreler, hem insan hem de veterinerlik tıbbında çeşitli hastalıkların tedavisi için umut verici olmuştur. MSC'ler, hücre-hücre teması, çözünür faktörler ve küçük hücre dışı veziküller 7,8,9,10 gibi farklı mekanizmalar yoluyla iltihabı kontrol edebilir ve anjiyogenez ve doku homeostazını teşvik edebilir. Ayrıca, MSC'ler, immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir, çünkü bu hücreler sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonunu gösterir ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavide kullanılır11,12. Rejeneratif potansiyel ile birleşen düşük immünojenisite, MSC'leri greft-versus-host hastalığı (GvHD)13, sistemik lupus eritematozus14 ve multipl skleroz 15 gibi hücre tedavisi için ideal adaylar haline getirir16,17.

MSC'lerin birkaç yetişkin dokuda bulunmasına rağmen, yağ dokusu, minimum cerrahi müdahale ile hasat için erişilebilirlik gibi diğer kaynaklara göre avantajlar sunar; yüksek genleşme oranına sahip çok sayıda kullanılabilir hücre; ve özel ekipman ve düşük maliyetli malzemelere ihtiyaç duymadan gerçekleştirmesi kolay bir protokol kullanarak kolay in vitro genişletme 18,19,20. Ekstrakte edildikten sonra, yağ dokusu kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler), Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği (ISCT)21 tarafından belirlendiği şekilde karakterize edilmelidir. Bu nedenle, MSC'ler morfoloji fibroblast benzeri, plastik kültüre bağlılık, endoglin (CD105), ekto-5'-nükleotidaz (CD73) ve Thy-1 (CD90) gibi mezenkimal belirteçlerin yüksek bir yüzdesini (% ≥95) ve lökosit ortak antijeni (CD45), transmembran fosfoglikoprotein (CD34), glikolipid bağlantılı membran glikoproteini (CD14), integrin alfa M (CD11b), B hücresi antijen reseptörü kompleksi ile ilişkili protein alfa zinciri (CD79α) gibi hematopoietik belirteçlerin düşük yüzdesini (% ≤2) ifade etmelidir. B-lenfosit yüzey antijeni B4 (CD19) ve sınıf II insan lökosit antijeni (HLA-II). Ayrıca, fonksiyonel bir karakterizasyon gereklidir ve hücreler osteoblast, kondroblast veya adipoblast hücrelerine farklılaşabilmelidir21.

Burada, in vitro çalışmalar için mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak epididimal yağ dokusundan MSC'lerin nasıl elde edileceğini ve ISCT ile önceden belirlenmiş morfolojik karakterizasyonu gösteriyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, hayvan etiği için uluslararası yönergelere göre yürütüldü ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi'nden kurumsal bakım ve kullanım komiteleri tarafından 021/22 protokol numarası altında onaylandı. İsviçreli erkek fareler (6-8 hafta), Hayvan Yetiştirme, Bakım ve Deney Laboratuvarı - Santa Cruz Eyalet Üniversitesi (LaBIO-UESC) Hayvan Araştırma Tesisi'nden alındı, belirli patojen içermeyen koşullarda tutuldu, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüleri ile su ve yiyecek ad libitum aldı.

NOT: Diğer fare soyları kullanılabilir; Yetişkin farelerin (6-8 hafta) daha gelişmiş yağ dokusuna ve yüksek proliferatif aktiviteye sahip hücrelere sahip oldukları için kullanılmasını öneriyoruz.

1. Hazırlık

NOT: Devam etmeden önce, aşağıda açıklanan aşağıdaki reaktifleri hazırlayın. Reaktif ve malzeme tedarikçisi bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın. Tüm pratik prosedürlerde maskeler, boneler, laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.

  1. Epididimal yağ dokusu ekstraksiyonu
    1. Ameliyat malzemelerini ayırın: üç set steril cımbız ve makas, beş iğne ve 200 mL p etanol içeren bir beher.
    2. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazini (10 mg / kg) karıştırarak bir terminal anestezik hazırlayın.
  2. ADSC kültürü
    1. Bazal ortam: fetal sığır serumu (FBS), 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL amfoterisin B, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikoz ortamını hazırlayın.
    2. Özet çözeltisi: 0.25 μm'lik bir filtrede sterilize edilmiş PBS'de% 0.15 kollajenaz tip II hazırlayın.
      NOT: Bazal besiyerinde tarif edilen dört antibiyotiğin kullanılması gerekli değildir. Bunun gerçekleştirildiği laboratuvarın hücre kültürü koşullarına bağlı olacaktır.
  3. ADSC'lerin fenotipik karakterizasyonu
    1. PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
    2. Anti-fare antikorlarını Tablo 1'de belirtildiği gibi seyreltin.
    3. PBS'de% 2 formaldehit hazırlayın.
  4. ADSC'lerin osteojenik farklılaşması
    1. Osteojenik farklılaşma ortamı: 5.67 M askorbik asit, 10 nM deksametazon, 0.02 M β-gliserofosfat, FBS ve %1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM hazırlayın.
    2. Von Kossa boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: suda p etanol, suda %5 gümüş nitrat, damıtılmış su, suda %5 sodyum tiyosülfat ve suda %1 eozin B.
  5. Adipojenik farklılaşma:
    1. Adipojenik farklılaşma ortamı: 0.5 mM 3-İzobutil-1-metilksantin, 200 μM indometasin, 1 μM deksametazon, 10 μM insülin,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.
    2. Yağ kırmızısı boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: deiyonize suda formalin, deiyonize suda ` izopropanol, ` izopropanol içinde lizokrom (yağda çözünen boya) diazo boya (Yağ-Kırmızı O çözeltisi) ve deiyonize suda %1 hematoksilin.
  6. Kondrojenik farklılaşma:
    1. Kondrojenik farklılaşma ortamı: FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş kondrojenik ortam hazırlayın.
    2. PBS'de% 10 formaldehit hazırlayın.

figure-protocol-1






















Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokole göre yağ dokusundan ekstrakte edilen hücreler, ISCT tarafından önerilen MSC'ler için minimum kriterlere uyan morfoloji gösterdi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Fenotipik olarak, ADSC'ler hücre kültürünün ilk günlerinde plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye bağlılık göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca homojen bir şekilde büyüdüler ve koloniler oluşturdular. Ayrıca, ADSC'ler hematopoietik belirteçler olan CD34 (%2.12) ve CD45 (%1.81) ekspresyonu düşük, CD71 (B.6), CD29 (t.2) ve CD90 (U.1) ekspresyonu yüksek olarak tüm mezenkimal hücre belirteçleri olarak görüldü (Şekil 2B).

figure-results-1
Şekil 2: Yağ dokusu kaynaklı hücrelerin fenotipik karakterizasyonu. (A) Kültürün 2, 4 ve 8. günlerinde yuvarlaktan fibroblast benzerine değişen ADSC morfolojisi; ölçek çubuğu = 22.22 μm. (B) ASC tarafından ifade edilen (CD71, CD29 ve CD90) veya ifade edilmeyen (CD34 ve CD45) belirteçler için histogramlar. Bu rakam Miranda ve ark.24'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İşlevsel olarak, ADSC'ler, 14 veya 21 gün boyunca her soy için şartlandırılmış ortamda kültürlendiğinde osteoblast, adipoblast ve kondroblasta farklılaşmak için çoklu etki gösterdi (Şekil 3). Von Kossa boyaması, osteogenez sürecinin karakteristiği olan ekstraselüler matrikste mineralize nodülleri ortaya çıkardı (Şekil 3). Yağ kırmızısı O boyaması, ADSC'lerin sitoplazmasında lipid vakuollerini kanıtladı ve Alcian Blue boyaması, hücre dışı matriste glikozaminoglikan varlığını doğruladı (Şekil 3). Birlikte, fenotipik ve fonksiyonel özellikler, epididimal yağ dokusundan ekstrakte edilen hücre popülasyonunu MSC'ler olarak doğrulamıştır.

figure-results-2
Şekil 3: Yağ dokusu kaynaklı hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu. Kültürde 14 ve 21 gün sonra ADSC'nin osteojenik, adipojenik ve kondrojenik çok soylu potansiyeli. Ölçek çubuğu = 50 μm (üst panel), 100 μm (orta ve alt paneller). Bu rakam Miranda ve ark.24'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC'ler farklı dokulardan çıkarılabilir. Kemik iliği hem murinlerde hem de insanlarda ortak bir MSC kaynağını temsil etmesinerağmen 25,26, MSC'lerdeki zenginliği, vücuttaki dağılımı ve ona erişim kolaylığı nedeniyle bu çalışmada yağ dokusu ile çalışmayı seçtik. Alternatif olarak, adipoz kaynaklı kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için kullanılabilir27.

Çıkarmanın bazı noktaları, burada paylaşılan protokollerin başarısı için özel ilgiyi hak ediyor. İlk olarak, aseptik koşullarda yapılması gereken dokuyu toplama bakımını vurguluyoruz. Bu nedenle, ameliyata başlamadan önce farelerin %70 alkolle uygun şekilde dezenfekte edildiğinden emin olun. Bir diğer önemli nokta ise epididimal yağ dokusunu almak için aynı cımbız ve makas setini kullanmamak ve böylece herhangi bir kontaminasyon kaynağından kaçınmaktır.

İkinci bir endişe, dokunun işlenmesidir. Konik tüpteki parçalar, 37 ° C'de 10 dakikalık inkübasyon ile düzgün ve kuvvetli bir şekilde çalkalanmalıdır. Ertesi gün ve daha sonra 2-3 günde bir besiyerini değiştirmek çok önemlidir. Kültürün günlük olarak gözlemlenmesi, orta rengin, hücre şeklinin ve kültürün ortamındaki herhangi bir girişimin kontrol edilmesi önerilir.

Üçüncü bir endişe, MSC karakterizasyonu için en iyi zaman/geçiş ile ilgilidir. Burada, hücrelerin üçüncü geçişinde yapmanızı öneririz, ancak bu zorunlu değildir. Çalışmanın amacına bağlıdır. Üçüncü bölümde, MSC olarak nitelendirilen hücrelerin yaklaşık% 80'ine sahibiz, bu da örneğin bu çalışmanın hedefleri için yeterlidir. Fenotipik karakterizasyon, hematopoietik belirteçlerin (örneğin CD34 ve CD45) ve mezenkimal belirteçlerin (örneğin CD29, CD73, CD90 ve CD105) ekspresyonunun analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca, Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT)21 , ADSC'lerin fibroblast benzeri morfolojiye sahip olması ve kültür platformunun plastiğine yapışması gerektiğini vurgulamaktadır. Morfoloji, büyüyen kültür sırasında mikroskop altında gözlemlenebilir. Fonksiyonel karakterizasyon, ADSC'lerin osteoblast, adipoblast ve kondroblast hücrelerine farklılaşma potansiyelinin analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Fenotipik karakterizasyonda, mezenkimal ve hematopoietik belirteçlerin yüzdesi, ISCT tarafından önerilen sayıları tam olarak karşılamayarak hayvan türüne ve hücre kaynağına göre değişebilir. Örneğin, ISCT insan MSC'leri için ≥CD105, CD73, CD90'ın% 95'i ve CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79a veya CD19'un% ≤2'si, İnsan lökosit antijeni - DR İzotipi (HLA-DR)21. Ayrıca, fonksiyonel karakterizasyonun yapılması ve osteoblastlara, kondrositlere ve adiposit soylarına farklılaşan hücrelerin çok potansiyelliliğinin doğrulanması önemlidir. Bu soylardan en az ikisi, çok potansiyelli olduğunu kanıtlamak için önerilir.

Vurgulanan bu noktalara ek olarak, burada önerilen bazı tahliller, örneğin Von Kossa boyaması yerine Alizarin Red S, Alcian Blue yerine Periyodik Asit Shiff ve akış sitometrisi yerine polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ikame edilebilir.

İnsanlarda tanımlanan üç tip yağ dokusu (beyaz, kahverengi ve bej) arasında, beyaz yağ dokusu en yüksek MSC28 kaynağına sahiptir. Bu doku, burada bildirilen epididimin üzerindeki yağ gibi deri altı, karın ve kasık bölgelerinden elde edilebilir. Burada paylaşılan protokolde kullanılan kollajenaz ile fiziksel parçalanma ve enzimatik sindirim, işleme sırasında tükenen adipositler dışında birçok hücre tipinden oluşan stromal vasküler fraksiyonu (SVF) türetir.

Sonuç olarak, yağ dokusunu bir MSC kaynağı olarak kullanmanın temel avantajları, MSC'lerin anti-enflamatuar ve rejeneratif özellikler olarak terapötik potansiyeli ile ilişkili hücre izolasyonu için yöntemlerin bolluğu ve kolaylığını içerir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) ve Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) tarafından sağlanan bir hibe ile desteklenen araştırma. Bu çalışma kısmen PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85) tarafından finanse edilmiştir. MGAG ve URS, sırasıyla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından verilen burs sayesinde.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
140 & derece; C Yüksek Isı Sterilizasyonu CO2< / sub> İnkübatörüRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ÇinC180
3-İzobutil-1-metilksantinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDI7018
Asetik asit buzulSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDA9186BioReagent, glikoproteinlerin tespiti için uygundur. Asetik asitte %1, pH 2.5
Alkol %70Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD65350-M%70 suda
Amfoterisin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDPHR1662
Antikorlar anti-fare anti-CD29 FITC (Klon Ha2 / 5)BD Biosciences, San Diego, CA, ABD555005Hücredeki fonksiyonlar: Adezyon ve aktivasyon, embriyogenez, Lökositler, DC, trombositler, mast hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri
Antikorlar anti-fare anti-CD34 PE (Klon RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, ABD551387Hücredeki fonksiyonlar: Hücre adezyon faktörü. Hematopoetik kök hücreler
Antikorlar anti-fare anti-CD45 APC (Klon 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, ABD559864Hücredeki fonksiyonlar: Lökositlerin aktivasyonuna yardımcı olur
Antikorlar anti-fare anti-CD71 FITC (Klon C2)BD Biosciences, San Diego, CA, ABD553266Hücredeki fonksiyonlar: Hücre çoğalması sırasında demir alımını kontrol eder. Çoğalan hücreler, retikülositler ve öncüler
Antikorlar anti-fare anti-CD90 PerCP (Klon OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, ABD557266Hücredeki fonksiyonlar: Sinyalleşme, yapışma. T lenfosit, NK, monosit, HSC, nöron, fibroblast
Askorbik asitSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDPHR1008
Otomatik pipetlerThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD4700850NFinnpipette F1 İyi Laboratuvar Pipetleme (GLP) Kitleri
ÖlçekUygulanamaz1 birim
Sığır serum albüminiSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDA7906
Hücre kültürü plakaları (6 kuyulu)Merck, Darmstadt, AlmanyaZ70775907 birim steril. TPP doku kültürü plakaları
Hücre kültürü plakaları (96 oyuklu. Yuvarlak veya V alt)Merck, Darmstadt, AlmanyaCLS35307701 birim steril. Wells, 96, Doku Kültürü (TC) ile muamele edilmiş yüzey, yuvarlak dipli açık kuyular, steril
Kondrojenik ortamKök Pro Kondrogenez Farklılaşması– Yaşam TeknolojileriA1007101TGF-β 2, TGF-β 3, deksametazon, insülin, transferrin, ITS, sodyum-l - askorbat, sodyum piruvat, askorbat-2-fosfat
Kollajenaz tip IILife Technologies, California, ABD17101015
alüminyum kaplı mantar veya strafor levhaUygulanamaz1 birim
pamukUygulanamaz50 g
DeksametazonSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDD4902
Diseksiyon makasıUygulanamaz03 birim steril
DPX Histoloji için mountantSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD6522
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDD55231000 mg/L glikoz ve L-glutamin içeren, sodyum bikarbonat içermeyen, toz, hücre kültürüne uygun
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD861006
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDF4135
FormaldehitSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDG1397
HematoksilenSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDH3136
Hipodermik İğne (0,3 mm x 13 mm)Uygulanamaz5 adet
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDI0200000
İnsülinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDI3536
İzopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD563935H2O
Ketamin-D4 hidroklorür çözeltisinde %70Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDK-006Metanol içinde 1.0 mg / mL (serbest baz olarak), sertifikalı referans malzemesi, Cerilliant & reg;
Neubauer odasıSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDBR718620MARKA sayma odası BLAUBRAND Neubauer deseni. Klipsli, çift çizgili
Nichiryo pipet uçları (0.1– 10 & mu; L)Merck, Darmstadt, AlmanyaZ645540Hacim aralığı 0.1– 10 & mu; L, uzun, toplu paket. Steril
Nichiryo pipet uçları (1– 10 mL)Merck, Darmstadt, AlmanyaZ717401Ses aralığı 1– 10 mL, evrensel, toplu paket. Steril
Nichiryo pipet uçları (200 μ L)Merck, Darmstadt, AlmanyaZ645516Maksimum hacim 200 μ L, mezun, mini yığın. Steril
Yağ-Kırmızı O çözeltisiSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDO1391izopropanol Parafin içinde% 0.5
Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD107.15146– 48, blok formunda
Penisilin / StreptomisinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDP4333Çözelti, 10.000 ünite penisilin ve 10 mg streptomisin / mL, 0.1 & mu ile stabilize edilmiştir; m filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDP3813Tozu, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için. Dengeli ve steril
Polipropilen konik tüpler (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASteril
Polipropilen konik tüpler (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 adet steril
neşter (opsiyonel)Uygulanamaz1 birim
Gümüş nitratSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD85228
Sodyum tiyosülfatSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABD72049
Cerrahi cımbız (15 cm)Uygulanamaz3 birim steril
İsviçre erkek faresi (6– 8 hafta)Bioterium, Santa Cruz Eyalet Üniversitesi021/22
şırınga (1 mL)Uygulanamaz1 birim
Tripan Mavi BoyaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDT8154%0.4, sıvı, steril filtreli, hücre kültürü için uygun
Tripsin/EDTA (etilendiamintetraasetik asit)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDT3924
KsilazinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDPHR3263
β-gliserofosfat disodyum tuzu hidratSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, ABDG9422BioUltra, hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, > %99 (titrasyon)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stem Cell IsolationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

İlgili makaleler