Method Article

İnsan Eksfoliye Edilmiş Yaprak Döken Dişlerden İmmünfenotipli Mezenkimal Kök Hücrelerin Tek Hücreli Sınıflandırılması

DOI:

10.3791/65723

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir organizmanın mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler), vücuttaki birden fazla yetişkin hücre soyuna farklılaşmak için olağanüstü bir kapasiteye sahiptir ve immünomodülatör ve antienflamatuar özellikleri ile bilinir. Bu kök hücrelerin kullanımı, rejeneratif biyoloji alanı için bir nimettir, ancak aynı zamanda, bunlarla ilişkili çoklu hücresel belirsizlikler nedeniyle rejeneratif tıp ve terapötikler için bir felakettir. Bu belirsizlikler, bu kök hücrelerin kaynağındaki çeşitlilikten ve her ikisi de fonksiyonel heterojenliklerini yansıtan in vitro büyüme koşullarından kaynaklanabilir.

Bu, terapötik uygulamalar için saflaştırılmış, homojen MSC popülasyonları sağlamak için metodolojileri garanti eder. Akış sitometrisi alanındaki gelişmeler, multiparametrik bir yaklaşım kullanılarak tek hücreli popülasyonların saptanmasını sağlamıştır. Bu protokol, floresan destekli tek hücreli sıralama yoluyla insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED'ler) kök hücreleri tanımlamanın ve saflaştırmanın bir yolunu ana hatlarıyla belirtir. CD90-floresein izotiyosiyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofil proteini (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikosiyanin (APC) ve CD44-V450 gibi yüzey belirteçlerinin eşzamanlı ekspresyonu, multiparametrik akış sitometrisi kullanarak MSC'lerin "parlak", pozitif ekspresörlerini tanımladı. Bununla birlikte, bu pozitif belirteçlerin dörtlü ekspresyonörlerinin yüzdelerinde 7. pasajdan sonraki pasajlara kadar önemli bir düşüş gözlendi.

İmmünfenotipli alt popülasyonlar, sadece iki pozitif ve bir negatif markörün dahil etme kriterlerini oluşturduğu tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandı. Bu metodoloji, tasnif edilen popülasyonların hücre canlılığını sağladı ve tasnif sonrası hücre proliferasyonunu sürdürdü. Bu tür bir sıralama için aşağı akış uygulaması, kapılı alt popülasyonlar için soya özgü farklılaşmayı değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izolasyon koşullarını iyileştirmek ve çoklu hücre yüzeyi işaretleyici bilgisi elde etmek için diğer tek hücreli sistemlere uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), hücre bazlı tedaviler için uygun, ölçeklenebilir bir hücre kaynağı olarak kabul edilebilir ve rejeneratif tıpta altın standart bir sistem olarak kabul edilebilir. Bu hücreler, vücutta farklı doku kökenlerine sahip çeşitli kaynaklardan izole edilebilir1. Kaynak dokularına bağlı olarak, her MSC tipi belirsiz bir in vitro davranış sergiler2. Bu, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinde iyi gözlenir3. Çok sayıda çalışma, yetişkin doku farklılaşması, genomik durum ve MSC'lerin metabolik ve hücresel mimarisi dahil olmak üzere boyutlarda klonal varyasyon göstermiştir 2,4.

Hücrelerin immünofenotiplemesi, kök hücrelerin tanımlanması için akış sitometrisinin yaygın bir uygulaması olmuştur ve bu, 2006 yılında Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT) tarafından hücreleri MSC'ler olarak tanımlamak için minimal kriterlerin bir listesini reçete etmek için kullanılmıştır. Plastik yapışma ve in vitro olarak üç soya (osteojenik, kondrojenik ve adipojenik) farklılaşma yeteneği ile birlikte, hücre popülasyonunun %≥95'inin CD105, CD73, CD90 eksprese etmesi gerektiğini ve bu hücrelerin akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi CD34, CD45, CD11b, CD14 ve HLA-DR ekspresyonundan (%≤2 pozitif) yoksun olması gerektiğini belirtmiştir5. MSC'ler, ISCT'nin minimal kriterleri altında bir dizi biyobelirteç tarafından tanımlanmış olsa da, bağışıklık özellikleri bu biyobelirteçlerle kıyaslanamamıştır ve çapraz çalışma karşılaştırmalarını ve klonal varyasyonları ölçmeyi kolaylaştırmak için bu kriterlerin ötesinde daha fazlasına ihtiyaç vardır2.

ISCT tarafından belirlenen yönergelere rağmen, MSC'ler üzerine yapılan kapsamlı araştırmalar, bu popülasyonda, esas olarak MSC donörleri6, doku kaynakları7, klonal popülasyon8 içindeki bireysel hücreler ve kültür koşulları 2,9 arasında ortaya çıkan heterojenliğin her yerde bulunan doğası nedeniyle ortaya çıkabilecek çok sayıda faktöre bağlı olarak ortaya çıkabilecek heterojenliğin var olduğunu göstermiştir. 10. Kaliteyi ve hücre kaderini sağlamak için bu birincil hücrelerin çeşitli doku kaynaklarından karakterizasyonu ve saflaştırılması, üretimlerinde kilit adımlardır. Popülasyon arasında sergilenen varyasyonları anlama ihtiyacı, onu ayrı ayrı bölünebilen ve toplanabilen alt popülasyonlara çözmek için etkili bir yöntem gerektirir11. Tek hücre düzeyinde analizler, hücre-hücre varyasyonunun zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olur, heterojen bir popülasyondan kaynaklanan biyolojik gürültüyü azaltır ve nadir hücreleri araştırma ve karakterize etme yeteneği sunar12.

Amaca ve seçilen parametrelere bağlı olarak, seçilen popülasyonları sıralamak ve zenginleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Hücre sıralama teknikleri, hem toplu sıralama hem de tek hücreli sıralama yöntemlerini içerebilir. Toplu sıralama, Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması (MACS)13, fraksiyonlama 14 ve elütriasyon15 yoluyla hedef popülasyonları zenginleştirebilirken, tek hücreli sıralama, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS)11 yoluyla daha homojen popülasyonları zenginleştirebilir. Bu yöntemlerin her birinin kendi avantaj ve dezavantajları ile karşılaştırmalı bir analizi Tablo 1'de vurgulanmıştır.

Tablo 1: Farklı tekniklerin karşılaştırmalı analizleri: MACS, Fraksiyonlama, Elütriasyon ve FACS, prensiplerindeki farklılıkları ve belirli bir tekniği diğerine göre seçmenin avantaj ve dezavantajlarını vurgulamaktadır. Kısaltmalar: MACS = Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması; FACS = Floresanla aktive edilen hücre sıralaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tekniğin ortaya çıkışından bu yana, tek hücreli akış sitometrisi, heterojen bir örnekte17 belirli bir hücre popülasyonunun sayımında16, tespitinde ve karakterizasyonunda önemli bir rol oynamıştır. Hewitt ve ark. 2006 yılında, farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) homojen havuzlarının izolasyonunu geliştirmek için otomatik hücre sıralama metodolojisinin temelini attı18. Tek hücreli ayıklama, genetik olarak değiştirilmiş klonların izolasyonunu kolaylaştırarak GFP ile dönüştürülmüş hESC'lerin popülasyonunu zenginleştirdi ve bu da klinik araştırmalarda yeni bir boyut açtı. Sıralama verimliliğini artırmak için genellikle iki yaklaşım benimsenmiştir; Ya sıralanmış popülasyonların toplama ortamı, sıralanmış hücrelerin19 canlılığını ve çoğalmasını sürdürmek için değiştirilir ya da hücre sıralama algoritması/yazılımı uygun şekilde değiştirilir12.

Teknolojinin ilerlemesiyle, ticari akış sitometreleri ve hücre ayıklayıcıları, kırılgan ve nadir hücre popülasyonlarını, özellikle de farklı kökenlerden kök hücreleri aseptik olarak ayırırken karşılaşılan zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olmuştur. Kök hücre biyologlarının en büyük zorluklarından biri, gen düzenleme çalışmalarında gerekli olan transfeksiyon protokollerini takiben insan pluripotent kök hücrelerinin klonal izolasyonu olmuştur19. Bu, tek hücrelerin, takviyeler ve ticari küçük moleküllü ROCK inhibitörleri ile birlikte Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF'ler) ile kaplanmış 96 oyuklu plakalara ayrılmasıyla ele alındı. Bununla birlikte, hücre izolasyon stratejileri, sıralanan tek tek hücrelerin immünofenotipini tanımlayan sıralama algoritmasının bir özelliği olan indeks sıralaması kullanılarak büyük ölçüde rafine edilebilir12. Tek hücreli ayıklamadaki bu rafine modalite, özellikle nadir hematopoietik kök hücre popülasyonları ile ilgili olarak, yalnızca kök hücreler için sıralama verimliliğini arttırmaya yardımcı olmakla kalmadı, aynı zamanda tek hücreli klonları aşağı akış fonksiyonel tahlillerine verimli bir şekilde bağladı20.

Bu makale, fonksiyonel farklılaşma kapasitelerini incelemek için alt popülasyonların zenginleştirilmesi için insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED'ler) immünofenotipli kök hücrelerin tek hücreli olarak sınıflandırılmasına odaklanmaktadır. İki MSC-pozitif belirteç, CD90 ve CD73 ve negatif hematopoietik belirteç CD45'in bir kombinasyonu kullanılarak, MSC'ler immünofenotiplendirildi ve loş ve boş ekspresyoncular tanımlandı. İmmünfenotiplerine göre alt popülasyonlar saf MSC'ler, tek pozitif ve çift negatif popülasyonlar olarak tanımlandı. Belirteçlerin diferansiyel ekspresyonunun in vitro kültür koşullarının bir eseri olup olmadığını veya fonksiyonel özellikler üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek için daha ileri fonksiyonel çalışmalar için saf ve zenginleştirilmiş alt popülasyonlar elde etmek için tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandılar. "Pozitif MSC belirteçlerinin" homojen ekspresörleri olmayan hücreler, fonksiyonel özelliklerini incelemek için sıralandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik onay ve katılım onayı: İnsan pul pul dökülmüş diş pulpası örnekleri, Sri Rajiv Gandhi Diş Hekimliği Koleji ve Hastanesi (SRGCDS) Ağız ve Maksillofasiyal Departmanı, Bengaluru tarafından bilgilendirilmiş onam ve tam etik onay alındıktan sonra, Hastane Etik Onay Komitesi tarafından belirlenen standartlara uygun olarak alındı. Bunu takiben, SHED'lerin izolasyonu, kültürü, bakımı ve uygulanması, MAHE - Bengaluru'daki Manipal Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ndeki Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR) tarafından önerilen kılavuzlara uygun olarak onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması

  1. Kültür bakımı için
    1. Farklılaşmamış hESC'ler için bazal besiyeri,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (Pen-strep) kullanarak MSC hücre kültürü ortamını (% 10) hazırlayın (Tablo 2).
    2. Farklılaşmamış hESC'ler, FBS, %1 L-glutamin ve %1 Pen-strep için bazal ortam kullanarak MSC hücre kültürü ortamını ( ) hazırlayın (Tablo 2).
    3. Farklılaşmamış hESC'ler, %1 L-glutamin ve %1 antibiyotik-antimikotik (Anti-Anti) için bazal ortam kullanarak nötralize edici ortam hazırlayın (Tablo 2).
  2. Akış sitometrik analizi ve sıralaması için
    1. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 FBS kullanarak boyama tamponu hazırlayın.
    2. 1 mL PBS'ye 1 μL ekleyerek 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) stok çözeltisi hazırlayın
  3. MSC'lerin kökene özgü farklılaşması için
    1. Tablo 3'te açıklanan bileşime göre ostejenik, kondrojenik ve adipojenik farklılaşma için farklılaşma ortamı hazırlayın. Hazırlanan alikotları deney süresince 4 °C'de saklayın.
    2. Farklılaşmamış hESC'ler,% 2 FBS,% 1 L-glutamin ve% 1 Pen-strep için bazal ortam kullanarak seruma aç ortam (% 2 ortam) hazırlayın (Tablo 2).
MEDYA TÜRÜMEDYANIN AMACI50 mL İÇİN KOMPOZİSYON
FBS (FBS)Kalem-StrepL-GlutaminFARKLILAŞMAMIŞ hESC'ler İÇİN BAZAL ORTAM
medyaMSC kültürü ve bakımı5 mL500 μL500 μL44 mL
medyaCFU-F testi10 mL500 μL500 μL39 mL
Serum açlığı (% 2) ortamıFarklılaştırma protokolünde Kontrol kuyuları için ortam1 mL500 μL500 μL48 mL
Nötralize edici medyaTripsinizasyondan sonra hücre süspansiyonunu nötralize etmek için ortam-500 μL500 μL49 mL

Tablo 2: Kültür bakımı ve tahlilleri için hücre kültürü ortamı. Kısaltmalar: MSC = mezenkimal kök hücre; CFU-F = koloni oluşturan birim-fibroblast.

BİLEŞENOSTEOJENIK MEDYAKONDROJENIK ORTAMADIPOJENIK MEDYA
Bazal Medya90 mL90 mL90 mL
İndüksiyon ortamı10 mL10 mL10 mL
Toplam Hacim100 mL100 mL100 mL

Tablo 3: SHED'lerin üç soylu farklılaşması için farklılaşma ortamı.

2. SHED'lerin kültürü ve bakımı

  1. Hücreleri MSC kültür ortamında tutun ve her 2 günde bir veya gerektiğinde ortam değişiklikleri yapın.
  2. % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak% 95 birleşmede hücreleri tripnize edin.
  3. Nötralize edici ortam kullanarak tripsinizasyondan sonra hücreleri nötralize edin.
  4. Bir hücre peleti elde etmek için tüpü oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini MSC kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  6. Hücreleri, daha ileri deneyler veya alt kültürleme için MSC kültür ortamı içeren taze hazırlanmış hücre kültürü kaplarına tohumlayın.


    6. figure-protocol-1





Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SHED'ler, vimentin (kırmızı, tip III ara filamentler), aktin filamentleri (Alexa fluor 488 Phalloidin Probları) ve DAPI ile boyanmış çekirdeklerin ekspresyonunu gösteren standart immünofloresan testleri ile karakterize edildi (Şekil 1A). Proliferatif ve koloni oluşturma kapasitelerini tahmin etmek için standart kısa süreli hücre büyüme testleri yapıldı. Şekil 1B'de 2. günden 8. güne kadar proliferasyon hızında 14,3 kat artış gösterilmiştir. SHED'lerin klonojenik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında, doğum sonrası kaynaklar arasında, oral doku kaynaklı MSC'ler, asgari etik yükümlülükleri ve dikkate değer çok soylu farklılaşma potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi çekmiştir21. Gömülü üçüncü azı dişinden ve SHED'lerden elde edilen diş pulpası kök hücreleri (DPSC'ler), nörodejeneratif ve travmatik hastalıklardaki terapötik potansiyelleri nedeniyle dental MSC'ler arasında en fazla ilgiyi görmüştür22. Bu yazıda açıklanan protokol,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hindistan'ın Bengaluru kentindeki Jawaharlal Nehru İleri Bilimsel Araştırma Merkezi'ndeki Akış Hücresi Tesisi'ne akış sitometrisi çekirdek tesisinin kullanımı için teşekkür ederiz. Farklılaşmış hücrelerin pelet kültürünün kriyo-kesiti, Hindistan'ın Bengaluru kentindeki Neuberg Anand Referans Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Bu çalışma, UC'nin Hindistan'daki Manipal Yüksek Öğrenim Akademisi'nden (MAHE) okul içi finansmanı ile desteklenmiştir. AG, MAHE'den Dr. T. M. A. Pai Bursu'nun desteği için minnettardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alcian Blue StainHiMediaCCK029-1KT
Antibiyotik-Antimikotik (100x) Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negatif Kontrol (BSA) Kompanzasyon Plus (7.5 & mikro; m) Parçacık SetiBD Biosciences560497
BD FACS Accudrop Boncukları BD Biosciences345249Sıralama modülü açıldığında Lazer gecikmesini ayarlamak için kullanılır.
BD FACS Aria Füzyon Akış sitometresiBD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS Kılıf SıvısıBD Biosciences342003BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& T AraştırmaBoncukları BD Biosciences655050Nozul boyutuna bağlı olarak Cihaz konfigürasyonu için kullanılır.
BD Horizon V450 Fare Anti-İnsan CD44BD Biosciences561292
BD Horizon V450 Fare IgG2b, & İzotip KontrolüBD Biosciences560374CD44-V450 izotip
BD Pharmingen APC Fare Anti-İnsan CD105BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC Fare IgG1, & kappa; İzotip KontrolüBD Biosciences555751CD105-APC izotip
BD Pharmingen DAPI ÇözeltisiBD Biosciences564907DAPI 1 mg / mL stok çözeltisi
BD Pharmingen FITC Fare Anti-İnsan CD90BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC Fare IgG1, κ İzotip KontrolüBD Biosciences555748CD90-FITC izotip
BD Pharmingen PE Fare Anti-İnsan CD45BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE Fare IgG1, κ İzotip KontrolüBD Biosciences555749CD45-PE izotip
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Fare Anti-İnsan CD73BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Fare IgG1, & kappa; İzotip KontrolüBD Biosciences550795CD73-PerCP-Cy 5.5 izotip
BD Pharmingen Saflaştırılmış Fare Anti-VimentinBD Biosciences550513
Sığır serum albüminiHi-Media TC548-5G
Kristal menekşeGüzel kimyasal pvt ltd & nbsp;C33809
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluSigma-aldrich   çalışmaları ve bakımı için kullanılanD5652-50L
Etanol ------Genel sterilizasyon için kullanılır.
Fetal Sığır Serumu ThermoFisher tarafından Gibco 10270-106
Keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco ThermoFisher tarafından 10829018Metanol kültür ortamının hazırlanmasında kullanılan, farklılaşmamış hESC'ler için bazal ortam
Hi-Medya MB113
Yağ kırmızısı OHiMedia CCK013-1KT
Paraformaldehit ve nbsp;loba chemie30525-89-4
Penisilin Streptomisin (100x)Gibco by ThermoFisher 15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reaktifi)İnvitrojen ve nbsp;R37110
Gümüş NitratHiMedia MB156-25G
Sodyum Tiyosülfat pentahidratChemport10102-17-7
Sphero Gökkuşağı Floresan Parçacıkları, 3.0 - 3.4 & mikro; mBD Biosciences556291
Boyama tamponu MIRM'de hazırlanan ----PBS'de %2 FBS kullanılarak hazırlandı.
StemPro Adipogenesis Farklılaşması Bazal Besiyeri ThermoFisher tarafından Gibco A10410-01Adipojenik medya için bazal medya
StemPro Adipogenez TakviyesiGibco by ThermoFisher A10065-01Adipojenik medya için indüksiyon ortamı
StemPro Kondrogenez TakviyesiGibco by ThermoFisher A10064-01Kondrojenik medya için indüksiyon ortamı
StemPro Osteogenez TakviyesiGibco by ThermoFisher A10066-01Osteojenik medya için indüksiyon ortamı
StemPro Osteogenez / Kondrogenez Farklılaşması Bazal Medya ThermoFisher tarafından Gibco A10069-01Hem Osteojenik hem de Kondrojenik ortamlar için bazal ortam
Triton-X-100Hi-Media MB031
Tripan Mavi Gibco by yaşam teknolojileri 15250-061
Tripsin - EDTA Çözeltisi 1xHi-media TCL049
Ara-20 MERCK 9005-64-5
Kültür dPBS. Moleküler Biyoloji için L-Glutamin 200mM (100x)Gibco by ThermoFisher 25030-081  

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112(2019).
  3. Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
  4. McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
  5. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  6. Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
  7. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  8. Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
  9. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  10. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
  11. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
  12. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
  13. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
  15. Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
  16. Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
  17. Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
  18. Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
  19. Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11(2019).
  20. Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  21. Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405(2020).
  22. Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
  23. Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
  24. FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsSingle Cell SortingFlow CytometryImmunophenotypingHuman Deciduous TeethStem Cell DifferentiationCell Surface MarkersColony Forming AssayAdipogenic DifferentiationOsteogenic Differentiation

Related Articles