Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan hastalığı Multipl Skleroz (MS) için en yaygın fare ^modelidir1. IFN-γ (gama) ve IL-17 üreten T yardımcı hücrelerinin² infiltrasyonu, inflamatuar monositlerin³ infiltrasyonu, perivasküler ve submeningeal inflamatuar demiyelinizan lezyonların⁴ oluşumu ve merkezi sinir sisteminde (MSS) akson hasarı⁴ oluşumunu içeren klasik MS inflamatuar patolojisi de EAE ^5,6,7,8,9'da gözlenir. EAE ve MS arasındaki immün mekanizmalardaki benzerlik, EAE'yi MS için natalizumab, fingolimod, dimetil fumarat ve glatiramer asetat dahil olmak üzere bir dizi onaylanmış immün temelli tedavinin etkinliğini ve etki mekanizmalarını test etmek için uygun bir klinik öncesi model haline getirmiştir (^1,5'te gözden geçirilmiştir). Bazı EAE rejimleri, beyinde submeningeal inflamasyon, kronik demiyelinizasyon, omurilik atrofisi, sinaps ve nöron kaybı^dahil olmak üzere aksonal hasarın ötesinde ilerleyici MS patolojisinin diğer yönlerini modellemektedir 6,10,11,12. Bu nedenle, EAE, MS için nöroprotektif tedavilerin etkinliğini taramak için faydalıdır.

EAE, kemirgenlerde çeşitli şekillerde indüklenir. Aktif bağışıklama en yaygın indüksiyon yöntemidir ve kemirgenlerin ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis¹³ ile desteklenmiş CFA'da emülsifiye edilmiş miyelin antijenleri (tam proteinler veya peptitler) ile aşılanmasını içerir. Farenin türüne bağlı olarak, boğmaca toksini (PTX), hastalığın penetransını artırmak için aşılamanın 0. ve 2. gününde de uygulanır¹³. EAE ayrıca, miyelin / CFA primli farelerden elde edilen miyelin spesifik T hücrelerinin sağlıklı farelere¹⁴ evlat edinilerek aktarılmasıyla indüklenebilir veya ana miyelin antijenlerine özgü T hücresi reseptörlerini aşırı eksprese eden farelerde kendiliğinden gelişebilir⁵.

EAE hastalığının şiddeti ve ilerlemesi genellikle ayrı bir 5 puanlık klinik ölçek kullanılarak puanlanır: 1 – kuyruk gevşekliği, 2 – arka bacak veya ayak güçsüzlüğü, 3 – bir veya her iki arka bacakta tam felç, 4 – ön ayak zayıflığı, 5 – can çekişen veya ölü¹³. Bu klinik skorlama sistemi, hastalık başlangıcında ortaya çıkan artan felcin ilerlemesini belgelemede sağlamdır, ancak CNS inflamatuar ataklarından iyileşme derecesini yakalamada daha az hassastır. Örneğin, hem zorlukla yürüyen farelere hem de kolayca yürüyen ancak ayak kavrama zayıflığı sergileyen farelere EAE ölçeğinde 2 puan verilir. Kalıcı akson hasarı veya kaybının varlığına bağlı olarak, enflamatuar yanıtın çözülmesine rağmen EAE'nin akut sonrası fazında skorlar yüksek kalabilir⁹. EAE ^{9,16,17,18'de} klinik eksikliklerdeki farklılıkları daha iyi yakalamak için daha rafine skorlama sistemleri, davranış testleri, arka bacak ve kavrama gücü ölçümleri ve kızılötesi izleme sistemleri geliştirmeye yönelik çeşitli girişimlerde bulunulmuştur; Bununla birlikte, bu daha karmaşık skorlama ölçümleri, altta yatan nörolojik defisitlere karşı doku hasarına karşı inflamasyonun katkısını ayırt etmemektedir. Bu nedenle, EAE'nin şiddetini skorlamak için altın standart yaklaşım hem klinik hem de histolojik skorlama yapmaktır.

Burada, fare omuriliği ve beyin örneklerinin, EAE'de meydana gelen stokastik lezyon oluşumu sürecini yakalayacak şekilde parafine nasıl kesileceği ve gömüleceği için bir protokol açıklanmaktadır. Orijinal olarak Kluver ve Barrera¹⁹ tarafından oluşturulan ve CNS'deki miyelini tespit eden Luxol fast blue (LFB) ile bölümlerin nasıl boyanacağına dair bir protokol de sunulmaktadır. Kesitler ya tek başına LFB ile boyanır (demiyelinizasyon analizi için) ya da enflamatuar lezyonları görselleştirmeye ve skorlamaya yardımcı olmak için hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanır. Ticari olarak temin edilebilen antikorlar, immünohistokimyasal (IHC) teknikler ve halka açık yazılımlar kullanılarak omurilikteki toplam lökositlerin (CD45), miyelin kaybını ve yaralı akson sayısını (SMI-32) ölçmek için protokoller de sağlanmıştır. Omurilikteki lökositleri ölçmek için kullanılan protokol, beyindeki lökositleri ölçmek için de uygulanabilir.

Beyindeki aksonal kayıp ve hasarın histolojik değerlendirmesi, beyin beyaz cevher yolları birbirine paralel çalışmadığı için omurilikten nispeten daha zordur. Serum nörofilament ışığının (sNF-L) ölçümü, MS^20,21'de nöronal hasar için umut verici bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır. Son çalışmalar bu teknolojiyi EAE 22,23,24'e genişletmiştir. Burada, bir Küçük Molekül Testi (SIMOA) testi kullanılarak canlı farelerde serum nörofilament ışığını (sNF-L) ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem sadece az miktarda serum gerektirir ve canlı farelerde sadece yarım gün içinde yapılabilir ve test edilen bir tedavinin genel CNS hasarını nasıl etkilediğine dair hızlı geri bildirim sağlar. Burada açıklanan yöntemlerin tümü, herhangi bir cinsiyet veya suştaki farelere uygulanabilir.

Farelerle yapılan tüm deneyler, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak, Unity Health Toronto Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolleri altında gerçekleştirildi. Laboratuvar prosedürleri boyunca laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük taktığınızdan emin olun.

1. Beyin ve omuriliğin toplanması ve sabitlenmesi

1. Fareyi kurumsal politikalara göre ötenazi yapın. Fareyi yüzüstü bir diseksiyon masasına yatırın ve cerrahi makas kullanarak (aşağı doğru keserek) kafasını kesin.
2. Adson forseps kullanarak (baskın olmayan elde), farenin kafasının üstündeki cildi kavrayın. Daha sonra cerrahi makas kullanarak başın üstündeki deride 2,5 cm'lik bir kesi yapın.
3. Altta yatan kafatasını görselleştirmek için kafadaki cildi yanal olarak itmek için parmaklarınızı kullanın.
4. Standart Adson forseps ile göz yuvalarını kavrayarak farenin kafasını sabitleyin.
5. İnce makas (baskın el) kullanarak, kafatasında servikal omurgadan koku soğancıklarına kadar orta hat boyunca küçük kesikler yapın.
   NOT: Altta yatan beyne zarar vermemek için bir seferde kafatasının altına yalnızca birkaç milimetre makas ucu yerleştirin.
6. Altta yatan beyni ortaya çıkarmak için kafatasını yanal olarak yansıtmak için dişlerle Adson forseps kullanın.
7. Baskın olmayan elinizi kullanarak kafayı tutun. Makası kapalı tutarak (baskın el), omuriliği servikal omurgadan çıkarın ve beyni kafatasından nazikçe dışarı iterek kraniyal sinirleri kesin.
8. Beyni, hayvanın kimliği ile etiketlenmiş 10 mL% 10 nötr tamponlu formalin içeren konik bir tüpe yerleştirin.
9. Kürkü farenin gövdesinin orta çizgisi boyunca boynundan kuyruğa doğru kesin.
10. Omurgayı görselleştirmek için cildi yanal olarak itmek için parmaklarınızı kullanın.
11. Cerrahi makas kullanarak, femurların kalçaya bağlandığı seviyede omurgadan aşağı doğru kesin.
12. Omurganın her iki tarafındaki vücut duvarını kalçadan boyuna kesmek için cerrahi makas kullanın. Bağlı organları kesin.
13. Omuriliği içeren omurgayı, beyni içeren aynı formalin tüpüne yerleştirin. Beyin ve omuriliğin 5-7 gün boyunca sabitlenmesine izin verin.
    NOT: Fiksasyonun zamanlaması önemlidir. Doku aşırı sabitlenirse bazı antikorlar çalışmaz. Doku az sabitlenmişse, 2. adımda omuriliği omurgadan çıkarmak zordur.

2. Omurilik ve beynin brütlenmesi ve işlenmesi

NOT: Çeker ocakta aşağıdaki adımlar gerçekleşir. Başlamadan önce, 2 x 10 cm'lik temiz Petri kapları, filtre kağıdı ile kaplı bir huni ile donatılmış bir Erlenmeyer şişesi, iki neşter (biri kemik kesmek ve diğeri CNS dokularını kesmek için), lens kağıdı, bir kurşun kalem, gömme kasetleri ve %10 formalin ile önceden doldurulmuş numune kavanozları hazırlayın.

1. Makas kullanarak küçük bir parça lens kağıdı kesin (aynı genişlikte ancak kasetin iki katı uzunluğunda) ve bir Petri kabına yerleştirin.
2. Plastik bir kaseti bir kalem kullanarak numune kimliği ile etiketleyin.
3. Sabit beyni ve omurgayı içeren tüpü huniye dökün. Omurgayı ve beyni boş Petri kabına aktarın.
   NOT: Kullanılmış formalin, Erlenmeyer şişesine süzülür ve adım 2.13'te yeniden kullanılabilir.
4. Beyni bir neşter kullanarak altı koronal parçaya bölün. Beyincik için bir kaudal kesik, biri beyinciğin ortasında, biri beyincik için sadece rostral ve kalan rostral beyinde iki kesik yaparak eşit kalınlıkta 3 ek koronal dilim oluşturun.
5. Forseps kullanarak, beyin örneklerini Petri kabındaki lens kağıdının yarısına aktarın.
6. Neşter kullanarak omuriliği üç parçaya bölün: ilk kesim göğüs kafesinin alt kısmında, ikinci kesim ise servikal omurgadaki eğriliğin hemen altında yapılır.
7. Aynı neşteri kullanarak, omurilik görselleştirilene kadar sakral omurga parçasını kaudal uçta kesin.
8. Torasik omurgayı alın (baskın olmayan el). Adson forsepslerini dişleri sıkıca kapalı (baskın el) tutun ve forsepsin ucunu hafif bir bükülme hareketi kullanarak omurganın daha küçük açıklığına hafifçe itin. Kordon diğer uçtan çıkmalıdır.
   NOTLAR: Omurilik büyüklüğünde herhangi bir yuvarlak uçlu alet bu amaç için çalışacaktır. Omurilik doğal olarak dışarı çıkmazsa, zorlamayın. Bunun yerine, omurganın yan tarafındaki kemikleri kesmek için ince makas kullanın ve omuriliği ortaya çıkarmak için açık bir şekilde yansıtın. Alternatif olarak, omuriliği ve beyni formalin içinde birkaç gün daha sabitleyin; Bununla birlikte, antikor boyamasında değişkenlik oluşmasını önlemek için tüm örneklere aynı fiksasyon süresi uygulanmalıdır.
9. Standart Adson Forseps'i (baskın el) alın. Omurilik parçasını daha az baskın olan elle tutarak, ortaya çıkan kordonu kolondan nazikçe çekmek için forseps kullanın. Omurilik parçasını lens kağıdının bulunduğu Petri kabına yerleştirin.
10. Bu işlemi lomber/sakral ve servikal kolon parçaları için tekrarlayın.
11. Üç omurilik parçasını (servikal, torasik, lomber / sakral) bir neşter kullanarak daha küçük kesit parçalarına bölün. Her biri 2 mm'den daha az kalınlıkta olması gereken en az 15 parça kesin.
    NOT: Bölümlerin genişliğinden daha kısa olduğundan emin olun, bu da 3. adımdaki gömme işlemi sırasında bölümlerin enine kesitte daha kolay düşmesini sağlayacaktır.
12. Omurilik parçalarını, beyin parçalarını içeren lens kağıdının aynı yarısına yerleştirin. Doku parçalarını sandviçlemek için lens kağıdını katlayın ve bunu etiketli kasete yerleştirin.
    NOT: Lens kağıdı, işleme sırasında küçük doku parçalarının kasetten kaçmasını önler.
13. Kaseti, geri dönüştürülmüş veya taze formalin içeren bir numune kavanozuna aktarın.
14. Kalan numuneler için 2.1–2.13 arasındaki adımları tekrarlayın.
15. 5-7 günlük fiksasyondan sonra, kasetleri numune kabından otomatik doku işlemcisindeki ilk formalin banyosuna aktarın (bkz. Doku işlemcisini Ek Tablo 1'de açıklanan programa göre gece boyunca çalıştırın. Numuneler gömülene kadar ılık parafin mumu içinde tutulur.

3. Beyin ve omurilik bölümlerinin gömülmesi ve kesilmesi

1. Kasetleri işlemciden parafin gömme istasyonunun sıcak tutma odasına aktarın (bkz.
2. Her fareden omurilik ve beyin kesitlerini aşağıdaki gibi tek bir parafin bloğuna gömün (Şekil 1):
   1. İlk olarak, kalıbın altını kaplamak için parafin mumu dökün. İnce forseps kullanarak, beyin koronal ve omurilik kesit parçalarını kalıbın altındaki parafine yerleştirin.
   2. Beyin ve omurilik parçalarını yerine sabitlemek için kalıbı birkaç saniye soğutma yüzeyine aktarın. Kalıbı ısıtılmış yüzeye geri taşıyın ve üstüne sıcak parafin ile doldurun.
   3. Kaset kapağını (numune kimliği ile etiketlenmiş) kalıbın üzerine yerleştirin. Kaset kapağının üstüne daha fazla parafin dökün. Balmumunun kuruması için kalıbı soğutma istasyonuna aktarın (30-60 dakika soğutun).
      NOT: Omurilik bölümlerinin gömülmesi pratik gerektirir. Başarıyı artırmak için, daha kısa omurilik uzunlukları (<2 mm) kullanın, çünkü bunların enine kesite düşme olasılığı daha yüksektir. Omurilik parçalarının enine kesitte olup olmadığını ayırt etmeye yardımcı olmak için cerrahi göz lupları takılabilir.
   4. Parafin bloğunu döner mikrotom üzerine monte edin. Parafin bölümünde ilgilenilen dokular görünene kadar bloğu kesin.
   5. Her bloğun 5 μM şeridini kesin ve bunları 42 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
   6. Slaytlardaki bölümleri toplayın ve slaytları bir cam slayt rafına yerleştirin.
   7. Bölümleri 37 °C'de kuru fırında gece boyunca pişirin. Boyamaya geçmeden önce slaytları soğutun.

4. Boyamaya hazırlanırken bölümlerin de-parafinizasyonu ve rehidrasyonu

NOT: Adımlar çeker ocakta gerçekleştirilir. Başlamadan önce, çözücü banyoları hazırlayın. Tüm yıkama adımları için %0,05 Tween-20 (PBS-T) içeren 5 L 1x PBS (1 L ddH₂O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO₄; pH = 7,4) hazırlayın.

1. Slaytları iki ardışık ksilen banyosuna veya ksilen bazlı olmayan bir çözücüye her biri 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek parafinden arındırın.
2. Slaytları azalan etanol yüzdelerinin ardışık banyolarından geçirerek dokuları rehidre edin: 2 x %100 etanol (her biri 5 dakika), 2 x %95 etanol (her biri 3 dakika) ve 1 x %70 etanol (3 dakika). LFB boyama için% 95 etanol içinde tutun ve% 70 etanole rehidrat edin ve immünohistokimya (IHC) için PBS-T'de tutun.

5. H & E ile miyelin için LFB

1. % 0.1 LFB'lik bir çözelti hazırlayın (0.2 g LFB, Malzeme Tablosuna bakınız, 200 mL% 95 etanol, 0.5 mL buzlu asetik asit). Karıştırın ve bir Erlenmeyer şişesine süzün.  Kullanana kadar koyu renkli bir şişede saklayın.
2. %95 etanolden bölümleri, LFB içeren bir boyama kabına yerleştirilmiş bir cam sürgülü rafa aktarın. Çanağı örtün ve buharlaşmayı önlemek için parafin film ile kapatın.
3. Bölümleri gece boyunca (maksimum 16 saat) 56 °C fırında inkübe edin.
4. Ertesi sabah, slaytları bir ddH₂O banyosuna aktarın ve tutun.
5. Bu arada, (1) taze% 0.05 lityum karbonat çözeltisi (0.05 g lityum karbonat, 100 mL_ddH2O) hazırlayın; (2) Eozin Y çözeltisi (40 mL ddH20'ye 2 g eozin tuzu ekleyin veçözünene kadar karıştırın ve ardından 160 mL% 95 etanol ile karıştırın).
   1. Aşağıdaki banyoları hazırlayın: 1 x lityum karbonat, 3 x %70 etanol, 3 x %95 etanol, 2 x %100 etanol, 3 x ddH₂0. Banyoları kullanım sırasına göre yerleştirin (Ek Tablo 2'ye bakınız).
6. Ek Tablo 2'de özetlenen adımları izleyin.
7. Slaytlar kuruduktan sonra, demiyelinizan lezyonları mikroskop altında görselleştirin.

6. H & E olmadan miyelin için LFB

1. Miyelin analizi için bu boyama prosedürünü uygulayın.
   NOT: Prosedür 5. adımla aynıdır (bkz. Ek Tablo 2), ancak kısaltılmış bir iş akışına sahiptir. 4. adımdan sonra, 10. adımdan başlayarak işleme devam edin.

7. İmmünohistokimyasal (IHC) lekeler için antijen alımı ve peroksidaz söndürme

NOT: Başlamadan önce, metanol içinde 100 mL hidrojen peroksit hazırlayın (çeker ocakta 9 kısım %100 metanolde 1 kısım %30 hidrojen peroksit çözeltisi). Tween-20 ile 1 L 10 mM sitrat tamponu hazırlayın (2.94 g trisodyum sitrat, karıştırma plakasında bir beher içinde 1 L ddH₂0 içinde çözülür, pH'ı 6.0'a getirin ve 500 μl Tween-20 ekleyin). PBS-T'yi hazırlayın (bkz. adım 4). Tüm yıkamalar, aksi belirtilmedikçe PBS-T banyolarında hafif çalkalama ile (çalkalayıcı üzerinde) yapılır.

1. Slaytları 15 dakika boyunca metanol içinde% 3 hidrojen peroksit içine yerleştirerek endojen peroksidazı söndürün (çeker ocakta). Slaytları PBS-T'de iki kez yıkayın (her biri 2 dakika).
2. Slaytları metal bir sürgü tutucuya aktarın ve bir düdüklü tencerede 1 L sitrat tamponuna yerleştirin. Kapağı kapatın ve buhar tahliye deliğinin üstüne lastik bir tıpa ekleyin.
3. Düdüklü tencerenin üzerindeki maksimum basınca ulaşıldığını gösteren sarı çıkıntı görünene kadar mikrodalgada yüksek ateşte pişirin. Maksimum basınçta 5 dakika daha pişirin ve ardından koruyucu eldiven kullanarak düdüklü tencereyi mikrodalgadan çıkarın.
4. Durdurucuyu çıkararak basıncı boşaltın.  Kapağı çıkarın ve slaytları sitrat tamponunda 20 dakika soğumaya bırakın ve ardından istediğiniz boyama yöntemine geçin.
   DİKKAT: Haşlanma yaralanmasına neden olabileceğinden buharı bırakırken geri çekilin.

8. CD45 immünohistokimya

NOT: Bu IHC yöntemi, sızan lökositleri görselleştirmek için kullanılır. Avid/biotin bloke edici adımlar, blokaj ve primer antikor inkübasyon adımları ile birleştirilir.

1. Bloke edici tampon hazırlayın (1x PBS'de% 2 BSA,% 2 tavşan serumu).
2. Slaytları cam slayt tepsisine aktarın ve PBS-T ile iki kez yıkayın (her biri 2 dakika). Avidin / bloke edici çözelti hazırlayın (1 x PBS'de% 2 BSA /% 2 tavşan serumunda 4 damla / mL avidin, Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Bir laboratuvar kağıt mendili kullanarak doku etrafındaki fazla PBS-T'yi kurutun. Hidrofobik bir kalem kullanarak, dokunun etrafına bir daire çizin ve slaytı nemli odaya yerleştirin.
4. Her bölüme avidin/blokaj solüsyonu uygulayın (400 μL/slayt).
5. Nemli odayı kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.  Bu adım sırasında, biyotin içeren bloke edici tamponda anti-CD45 antikoru (Ek Tablo 3) hazırlayın (1x PBS'de 4 damla / mL biyotin,% 2 BSA /% 2 tavşan serumu).
6. Engelleme solüsyonunun tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili üzerine kaydırılmasına dokunun. Fazla sıvıyı çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanarak dokunun etrafına sürün.
7. Slaytı nemli bir odaya geri yerleştirin. Bölüme 400 μL CD45 antikor çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Kapalı nemli bir odada gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
8. Ertesi gün, primer antikoru boşaltın ve slaytları PBS-T'de 3 kez yıkayın (her biri 5 dakika).
9. Tüy bırakmayan bir laboratuvar kullanarak bölümün etrafındaki alanı kurutun ve ardından her bölüme 400 μL ikincil antikor (bloke edici tamponda 1:200 seyreltme) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
10. Bu arada, 5 mL 1x PBS'ye 2 damla A reaktifi ekleyerek ABC reaktifini hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karıştırın. Aynı çözeltiye 2 damla B reaktifi ekleyin ve karıştırın (kullanmadan ~ 30 dakika önce hazırlayın).
11. Slaytları 3x PBS-T'de (her biri 5 dakika) 1 değişiklikle yıkayın ve slaytları nemli bir odaya yerleştirin.
12. Bölümlere 400 μL ABC reaktifi ekleyin. Nemli odayı kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
13. Slaytları 3x PBS-T'lik 1 değişiklikle (her biri 5 dakika) yıkayın. Bu arada, üreticinin talimatlarına göre folyo kaplı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde uygun miktarda DAB çözeltisi hazırlayın (bkz.
14. Bir slayt alın ve mikroskop altında omurilik bölümüne odaklanın. Slayta 400 μL DAB ekleyin ve laboratuvar zamanlayıcısını başlatın.
15. Gelişirken bölümü görselleştirin ve lökositler kahverengi olduğunda zamanlayıcıyı durdurun. Reaksiyonu durdurmak için slaytı bir ddH₂0 banyosuna aktarın. 5 dakika suda tutun. Kalan slaytlar için aynı geliştirme süresi kullanılır.
    DİKKAT: DAB kanserojendir. DAB atıklarını ve DAB sonrası ddH₂O'yu tehlikeli atık olarak atın.
16. Mayer'in Hematoksilen ile ~ 4-10 dakika boyunca karşı boyama slaytları (Ek Tablo 2'ye bakınız). Slaytları akan musluk suyu altında 10 dakika durulayın.
17. % 95 etanol (1 x 3 dakika) içinde dehidrat, ardından mutlak% 100 etanol (her biri 2 x 3 dakika).
18. Çeker ocak içine geçerken, slaytları 5 dakika boyunca ksilen veya ksilen ikameli bir çözücüye aktarın. Lamel montaj ortamı ile lamel ve sürgülerin çeker ocakta 1-2 gün kurumasını bekleyin.
    DİKKAT: Ksilen kullanıyorsanız, toksik olduğundan ve eldivenleri çözebileceğinden, kapak kayma sırasında slaytları tutmak için çift eldiven ve forseps kullanın.
19. Slaytları ksilen kullanarak temizleyin ve 20 x büyütmede bir slayt tarayıcı kullanarak tarayın.

9. Aksonal hasar için SMI-32 IHC

NOT: Bu protokol, yaralı aksonlarda^{birikebilen fosforile} olmayan nörofilament ağırlığa karşı reaksiyona giren bir fare SMI-32 antikoru kullanır 25. Bu antikor farede yükseltildiğinden ve bir fare antijeni tespit ettiğinden, bir Fare Üzerinde Fare (MOM) kitinin kullanılması önerilir. Bu prosedürde, avidin/biotin bloke etme adımı, primer antikor inkübasyonundan ayrı bir adım olarak yapılır. Bu protokole başlamadan önce, parafinizi de-parafinize edin, rehidre edin, endojen peroksidaz aktivitesini söndürün ve adım 4 ve adım 7'de açıklandığı gibi antijen alımını gerçekleştirin.

1. Bölümleri 2 x PBS-T (her biri 2 dakika) ile iki kez yıkayın. Bir laboratuvar mendili kullanarak bölümlerin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarın ve hidrofobik bir kalem kullanarak dokuların etrafına bir daire çizin.
2. Bölümlere avidin (4 damla / mL) ile 400 μL bloke edici tampon (1x PBS-T'de% 2 (a / h) keçi serumu) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. Slaytları 1x PBS-T'ye iki kez batırın. Slayta biyotin (4 damla / mL) içeren 400 μL bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
4. Slaytları 1 x PBS-T banyosunda 2 dakika yıkayın. Bu arada, 2.5 mL 1x PBS'ye 2 damla stok çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek MOM bloke edici reaktifi hazırlayın.
5. Bölüme 400 μL MOM reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
6. Slaytları 1x PBS-T banyosunda 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. Bu arada, 3.75 mL 1x PBS'ye 300 μL protein konsantresi stok çözeltisi ekleyerek MOM seyreltici hazırlayın.
7. 400 μL MOM seyreltici ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bu arada, MOM seyrelticisindeki SMI-32 antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin.
8. Slaytlardaki seyrelticiyi hafifçe vurun ve bölüme 400 μL SMI-32 antikor çözeltisi ekleyin. Nemli odayı kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
9. Slaytları 1x PBS-T banyosunda 2 dakika boyunca her biri hafif çalkalama ile iki kez yıkayın. Bu arada, MOM anti-fare IgG çalışma reaktifini seyreltici içinde seyreltin (2.5 mL seyreltici içinde 10 μL stok).
10. Slayt başına 400 μL anti-fare IgG çalışma reaktifi ekleyin. 10 dakika inkübe edin.
11. Slaytları 1x PBS-T banyosunda her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. CD45 boyama protokolünde belirtilen adımları izleyerek boyamaya devam edin (adım 8.11 – 8.19).

10. Demiyelinizan lezyonların varlığı için LFB ve H&E skorlaması

NOT: Aşağıdakiler, inflamatuar demiyelinizasyonun ciddiyeti hakkında hızlı bilgi edinmek için uygulanabilecek bir analiz yaklaşımıdır. Bu analiz, farklı seviyelerde örneklenen kord bölümlerinde (servikal, torasik ve lomber, seviye başına en az 3 bölüm) gerçekleştirilir. Omuriliğin anatomik seviyesini belirlemeye yardımcı olması için Fare omuriliği²⁶ için Allen Beyin Atlası'na bakın. Bu analiz TIFF dosyaları gerektirir. Taranan görüntüler .czi biçimindeyse, czi dosyalarını TIFF dosyalarına dönüştürmek için Ek Tablo 4'teki talimatları izleyin.

1. Dosyayı ImageJ'ye sürükleyip bırakarak analiz edilecek bölümün TIFF görüntüsünü açın. Omurilik bölümünü 4 kadranda gözlemleyin: dorsal, sol lateral, sağ lateral ve anterior (Şekil 2A, B).
2. Şekil 2'de gösterildiği gibi her kadranda demiyelinizan lezyonların varlığı için skor.
   NOT: Bir lezyonun varlığı, bölüm başına toplam 4 olası puan için bu kadranda 1 puanla sonuçlanır. Bir kadranda birden fazla lezyon olsa bile 1 puan verilir.
3. Her fare için tüm noktaları toplayın ve submeningeal lezyonlara sahip kadranların fraksiyonunu elde etmek için örneklenen toplam kadran sayısına bölün.

11. Omurilik beyaz cevherinde LFB boyamanın alan fraksiyonunun hesaplanması

NOT: Bu analiz, LFB ile boyanan omurilik beyaz cevherinin yüzde alan fraksiyonunu ölçer.

1. Dosyayı ImageJ'ye sürükleyerek/bırakarak TIFF dosyası olarak kaydedilmiş LFB lekeli bir bölümü açın.
2. Gri tonlamalı bir görüntü oluşturmak için Görüntü > Türü > 8 bit'e tıklayın. Eşiği ayarlamak > resme > tıklayın. Kırmızı kaplamanın gözle görülen tüm karanlık bölgeleri (miyelin) yakalaması için alt kaydırıcıyı ayarlayın (Şekil 2C–E). Uygula'ya tıklayın.
3. ROI Yöneticisi'ni açmak için Analyze > Tools > ROI Manager'a tıklayın.
4. ImageJ araç çubuğunda çokgen çizim aracını seçin. Bu çizim aracı, bilgisayar faresi ile omuriliğin bir bölgesini çizmeye izin verir.
5. Omuriliğin dorsal bölgesini ana hatlarıyla belirtin ve klavyedeki t'ye tıklayarak çokgeni ROI Yöneticisine ekleyin.
6. Omurilik beyaz maddesinin ön-yan bölgesini ana hatlarıyla belirtin ve çokgeni ROI yöneticisine ekleyin.
   NOT: İzleme sırasında, normalde daha az miyelinli olan büyük kan damarlarını, dokudaki yırtıkları, artefaktları ve dorsal boynuza bitişik alanları (Şekil 2A, B oku) hariç tutun. Çok fazla beyaz arka plan eklemek sonuçları çarpıtacağından, izleme sırasında mümkün olduğunca doğru olun.
7. Analiz Et'e tıklayın > Ölçümleri Ayarlayın ve Alan Kesri'ni seçin.
8. ROI Yöneticisi'nde Ölç'e tıklayın. Bu, LFB ile boyanan ana hatlarıyla belirtilen alanın fraksiyonunu verecektir.
9. Yeni oluşturulan sonuçlar kutusundan değerleri Excel'e kopyalayın ve görüntü penceresini kapatın. Dorsal ve ventro-lateral bölgeler için boyanan ortalama % fraksiyon alanını hesaplayın. Söz konusu bölüm için bir değer elde etmek üzere bunların ortalamasını alın.
10. Servikal, torasik ve lomber bölümler için 11.1–11.9 arasındaki adımları tekrarlayın (N = 3/seviye/fare).
11. Her fare için tüm bölümler için ortalama yüzde miyelin fraksiyonunu hesaplayın. Demiyelinizasyon yüzdesi, alan boyama yüzdesinin 100'den çıkarılmasıyla tahmin edilir.

12. CD45⁺ hücre sayısının ve SMI-32⁺ akson ovallerinin analizi

1. CD45 veya SMI-32 lekeli bir TIFF görüntüsünü ImageJ'e sürükleyip bırakın. Ölçek çubuğunu tüm görüntülerde ayarlamak için Analiz Et > Ölçeği Ayarla > Global > Tamam'a tıklayın. Bunun yalnızca ilk görüntü için yapıldığını unutmayın.
2. Çokgen çizim aracını seçin ve bilgisayar faresini kullanarak gri maddenin etrafını çizin. Analiz Et > Ölç'e tıklayın ve sonuçları Excel'de "Gri Madde Alanı" olarak kaydedin.
3. Çizilen çokgen hala görüntünün üzerindeyken, Sil tuşuna (klavye) tıklayarak gri maddeyi görüntüden kaldırın. Bu eylem sadece analiz edilecek beyaz maddeyi bırakır.
4. Poligon çizim aracını kullanarak tüm omurilik bölümünün ana hatlarını çizin. Eksik veya hasarlı doku bölgelerini hariç tutun.
5. Analiz Et > Ölç'e tıklayın ve sonuçları Excel dosyasına "Toplam Doku Alanı" olarak kaydedin.
6. Renkli > Renk Evrişimi > Resim'e tıklayın. Vektörler açılır penceresinden H, DAB'yi seçin. Üç yeni pencere görünecektir – kahverengi tonlu pencereyi (DAB kanalı) koruyun ve diğer görüntü pencerelerini silin.
7. Eşiği ayarlamak > görüntüye > tıklayın. Görüntünün eşiğini çizmek için alt kaydırıcıyı ayarlayın, böylece kırmızı kaplama gözle algılanan aynı miktarda kahverengi lekeyi yakalar. Uygula'ya tıklayın.
8. İkili > Havza> İşlem'e tıklayın. Bu adımda, uyumlu olduklarından emin olmak için orijinal görüntüyü ve ikili görüntüyü karşılaştırın.
9. Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Kaplamayı Göster'i seçin ve ayarları değiştirin: Boyut = 5 - 150 μm², Dairesellik = 0,4 – 1. Tamam'a tıklayın.
   NOT: Bu ayarlar, Watershed işleviyle bölünmemiş tek tek hücrelerin ve küçük hücre gruplarının analizde hariç tutulmak yerine dahil edilmesine izin verir.
10. Sonuçlar penceresinde, toplam parçacık sayısını temsil eden Excel'in en soldaki sütununa son sayıyı kaydedin. Ardından, beyaz madde alanını hesaplayın (toplam doku alanı – mm² cinsinden gri madde alanı). Beyaz madde alanı başına toplam partikül sayısını ifade edin (sayı/mm²).
11. Kaydedilen her RGB görüntüsü için adımları tekrarlayın. Bir fare için tüm omurilik kesitleri analiz edildikten sonra, o fare için^mm2 doku başına partikül sayısının ortalamasını alın.
    NOT: Omurilik lökositlerini analiz etmek için kullanılan iş akışı beyin bölgelerine de uygulanabilir.

13. SIMOA testi kullanılarak sNF-L ölçümü

1. Canlı farelerden 100-200 μL kanı, kılcal mikrotainer tüpler kullanılarak safen kanaması veya bir şırınga ve 25 G iğne (terminal prosedürü) kullanılarak kardiyak ponksiyon yoluyla toplayın. İkincisi için, kanı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. Kanın oda sıcaklığında 30-60 dakika pıhtılaşmasına izin verin.
3. Numuneleri 2660 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve üst fraksiyonu (serum) yeni bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Serumu kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
4. Hazırlık: Kullanmadan önce kalibratörlerin ve kontrollerin (NF-ışık tahlil kiti, Malzeme Tablosuna bakın) 1 saat oda sıcaklığına ısınmasını bekleyin.  Enzim substratını (RGP) buzdolabından çıkarın ve her 10 dakikada bir girdap yaparak en az 30 dakika boyunca 30 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
5. Serum örneklerini buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, numuneleri nazikçe girdaplayın ve herhangi bir kalıntıyı pelet haline getirmek için 5 dakika boyunca 10000 x g'de santrifüjleyin.
6. Plakayı yükleyin: Kalibratörleri ve kontrolleri girindeleyin. Kalibratörleri çift olarak, kontrolleri iki kopya halinde ve serum numunelerini kit ile birlikte verilen 96 oyuklu plakaya çift olarak yükleyin. Serum numuneleri, kitte sağlanan seyreltici ile 1:3 oranında seyreltilir.  Plakayı kapatın.
7. SIMOA makinesini (Malzeme Tablosuna bakın) bilgisayar, program ve ardından makine sırasına göre açın. Makinenin Gün Başlangıcı bakımını başlatmasına ve çalıştırmasına izin verin.
8. Manyetik boncukları 30 saniye boyunca vorteksleyin.
9. Ekrandaki Reaktifleri Yükle sekmesi, reaktif şişesinin yerleştirileceği raf konumuna çift tıklayın ve ardından şişenin barkodunu tarayın.
10. Manyetik boncukları raftaki sallama konumuna yerleştirin (konum 1–3).
11. Dedektörü, SBG reaktifini ve RGP reaktifini makineye yükleyerek devam edin.
12. Yazılımdaki ayarlara tıklayın. Numune modunun plaka üzerinde olduğundan emin olun. Kurulum çalıştırması sekmesinde denemeyi adlandırın.
13. Kalibratörler için plakadaki kuyucukları aşağıdaki gibi atayın: Kuyuya tıklayın, ardından tahlili seçin. A'yı kalibre et'i seçin ve ardından artan'a tıklayın. A1-8 kuyularını vurgulayın, ardından kalibratörlerin çift olarak çalıştırılacağı koordinatları atamak için kopyalara (2) tıklayın. Düzgün protokolü kullanarak çalıştırın.
    NOT: Her bir lot numarası için her bir kalibratörün konsantrasyonlarını almak için analiz sertifikasına (üretici web sitesi) bakın. Kuyular atandıktan sonra, plaka yerine kilitlenene kadar işi kaybetmeden bu ekrandan uzaklaşmak mümkün değildir.
14. Aşağıdaki adımları izleyerek örnekleri atayın:
    1. Örnekleri atamak için ekranın sağ alt köşesinden düğmesine tıklayın. Numunelerin yerleştirileceği kuyuları vurgulayın.
    2. Listeden çalıştırılacak tahlili işaretleyin, çoğaltma sayısını seçin ve yerleşik 4x seyreltmeyi belirtin.
    3. Kuyucuklar hala vurgulanmış durumdayken, numune kimliği ve başlangıç numarası için bir önek girin ve ardından numuneler için sıralı kimlikler oluşturmak için oluştur'a tıklayın. Kontrol numuneleri için adımları tekrarlayın.
15. Plakayı plaka tutucuya yükleyin (A1 - A12).
16. Ekran arayüzünde, bitmiş programlama örneklerine tıklayın ve sistem kaynakları sekmesine ilerleyin. Tüm reaktif kaplarının dolu olduğunu ve atık kaplarının boş olduğunu kontrol edin.
17. Çalıştır'a tıklayın.
18. Çalışma tamamlandığında, tahlil ve plaka adını seçerek "Veri Azaltma" sekmesi altındaki kalibrasyon eğrisini kontrol edin.
19. "Çalıştırma Geçmişi"ne gidin ve en son çalıştırmayı bulmak için filtreleri kullanın. Çalıştır'ı ve ardından tüm sonuçlar'ı seçin. Dışa aktar'a tıklayın ve .csv dosyasını kaydedin. Rapora tıklayın ve ardından toplu kalibrasyon raporunu seçin ve son çalıştırmayı seçin. Raporu önizleyin ve dışa aktarın.
20. Üretici tarafından önerilen gün sonu bakımını çalıştırın. Programı, makineyi ve ardından bilgisayarı kapatın.

Şekil 3, hem akut (solda) hem de daha eski EAE lezyonlarının (sağda) örnekleriyle temsili IHC ve histokimyasal boyamayı göstermektedir. Hematoksilen karşı boyama ile temsili CD45 boyaması Şekil 3A, B'de gösterilmiştir.  Şekil 3C-F, H&E karşı boyası ile (Şekil 3C,D) veya H&E karşı boyası olmadan (Şekil 3E,F) LFB boyama örneklerini göstermektedir. Hematoksilen bağışıklık hücrelerine özgü olmasa da, bağışıklık hücrelerinin çekirdekleri daha koyu renkte boyanır ve CNS yerleşik hücrelerinden ayırt edilebilir. Şekil 3G, H, hematoksilen ile karşı boyanmış SMI-32+ aksonlarının temsili boyanmasını göstermektedir. Eski EAE lezyonlarında bu lekenin artmış görünümüne dikkat edin.

Miyelinli izlerin hasarı, aktif murin EAE'de omurilikte en sık görülür ve bu, bu hastalıkta felcin ana itici gücüdür 7,9. Bu nedenle, histolojik analizlerde omurilikte inflamasyon ve doku hasarı varlığına yönelik skorlama önceliklendirilir. EAE lezyonları sporadik olarak omuriliğin farklı bölgelerinde (anterior, lateral veya dorsal) (Şekil 2A,B) ve farklı seviyelerde (sakral, lomber, torasik, servikal) ortaya çıkar. Tarif edilen gömme yöntemi, kord boyunca lezyonların iyi örneklenmesini sağlar. Analiz edilenden daha fazla bölüm gömülür, çünkü bazı bölümler işleme veya bölümleme sürecinde zarar görebilir. Temsili örneklemeyi sağlamak için, her fare için omuriliğin servikal, torasik ve lomber seviyelerinde en az 3 temsili bölüm analiz edilir. Analizi yapan kişinin analiz için temsili bölümleri seçerken önyargılı olmaması için her numunenin kimliği kör edilir.

EAE'nin histolojik şiddetindeki farklılıklar hakkında hızlı bir fikir edinmek için, seçilmiş kesitlerde spinal kord kadranlarında submeningeal demiyelinizan lezyonların varlığı için skorlama yapılabilir (Şekil 2A,B). Bu, taranan görüntüler üzerinde veya ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilebilen hızlı bir yöntemdir. Bu analiz, EAE bir grupta şiddetli ve diğerinde hafif olduğunda, gruplar arasındaki histolojik EAE şiddetindeki farklılıkları tespit edecek kadar duyarlıdır. Örneğin, Şekil 4'teki deneyde, EAE, MOG p35-55 / CFA artı PTX kullanılarak dişi vahşi tipte (WT) ve OGR1'de (OGR1 KO) bir delesyona sahip farelerde indüklendi. WT grubundaki fareler tam felçli şiddetli EAE geliştirirken, OGR1 nakavt grubu hafif hastalık geliştirdi. Klinik skordaki bu fark, submeningeal lezyonları olan kadranların fraksiyonundaki bir farka karşılık geldi (Şekil 4C).

Otoimmün atak sırasında miyelin ve/veya miyelinli akson kaybının derecesini yakalamak için demiyelinizan lezyonların skorlamasını miyelin boyamanın yüzde alan fraksiyonu ile tamamlamak önemlidir. Şekil 4'teki örnekte, yüzde miyelin fraksiyonu da OGR1 ve WT fareleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermiştir (Şekil 4D). Yüzde miyelin fraksiyonu, EAE'li farelerde kümülatif EAE skoru ile de önemli ölçüde ilişkilidir (Şekil 4E) ve bu nedenle bu hastalıkta genel doku hasarının iyi bir ölçüsü olarak hizmet eder. Bu protokolün miyelin lekesinin yoğunluğunu ayırt etmediğini unutmayın. İstenen sonuç buysa, proteolipid proteini veya miyelin bazik proteini gibi miyelin proteinleri için immünofloresan boyama yapılmalı ve bu boyamanın yoğunluğu ölçülmelidir.

EAE'nin her iki karşılaştırıcı grupta da şiddetli olduğu durumlarda, omurilik kadranlarının daha yüksek bir fraksiyonu inflamatuar/demiyelinizan lezyonlar içerecektir. Bu durumda, inflamasyonu puanlamak için daha hassas bir yaklaşım,mm2 beyaz cevher başına CD45+ lökosit sayısını saymaktır (bkz. Şekil 3A'daki temsili boyama). Burada tarif edilen CD45 antikor klonu, sızan tüm lökositleri tespit eder ve sadece EAE'de CD45 ekspresyonunu yukarı regüle eden ara sıra mikrogliaları boyar (Şekil 3B'deki açık oka bakınız) ve bu nedenle periferik immün hücre infiltrasyonunu yakalamada yararlıdır.

Daha uzun süreli EAE çalışmalarında (>20 gün), akson yaralanması analizinin de yapılması önerilir. Omurilik kesitlerinde SMI-32 boyama, hasarlı aksonları tespit etmek için hassas bir yöntemdir. Omurilikteki inflamasyon zamanla azalsa ve korunan aksonlar yeniden miyelin yapabilse de, hayatta kalan aksonlar diferansiyel bir rezidüel yaralanmaderecesi sergiler 9 (Şekil 3G, H). Örneğin, C57BL6 / J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE modelinde, aksonal yaralanma ve kaybın derecesi, enflamatuar süreç azaldıktan sonra klinik puanların bir itici gücüdür9. Şekil 5 , erkek ve dişi farelerde, WT farelerinde ve miyeloid bölmede (LysMCre: Ppardfl/fl) peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör-delta (PPAR-delta) adı verilen bir gende eksik olan farelerde yapılan bir EAE deneyinde bunun bir örneğini göstermektedir. Erkeklerde, WT fareleri arka bacak fonksiyonunu geri kazandı, ancak klinik puanlar erkek LysMCre: Ppardfl / fl grubunda yüksek kaldı. Buna karşılık, kadınlarda yapılan deneyde, her iki deney grubu da yüksek puanlara sahipti. İlk bakışta, bu sonuç PPAR-delta'nın EAE'de cinsiyete özgü bir etkiye sahip olduğunu düşündürdü; bununla birlikte, omuriliğin patolojik skorlaması, LysMCre: Ppardfl / fl grubundaki her iki cinsiyetten farelerin WT muadillerine kıyasla aksonal yaralanmayı artırdığını ortaya koydu (Şekil 5B). Kadınlarda klinik skorlar üzerinde bir genotip etkisi gözlenmemiştir, çünkü WT dişi fareler, kronik nörolojik defisitlere dönüşen artmış aksonal hasar sergileme eğilimindeydi.

Aynı deneyde, dişi LysMCre: Ppardfl / fl dişi farelerin beyincikte daha kapsamlı T hücresi infiltrasyonuna sahip olduğu bulundu ve bu da beyin iltihabının EAE'de nasıl yararlı olabileceğine dair bir örnek sağladı. EAE'de, beyindeki inflamasyon ağırlıklı olarak beyincik ve beyin sapında bulunur (Şekil 6A, D, G), ancak aynı zamanda meninkslerde ( Şekil 6C'de hipokampus altında görülür), ventriküllerin yakınında (Şekil 6F) ve optik sinir ve korpus kollozum dahil olmak üzere diğer beyaz cevher yollarında da bulunabilir (Şekil 6B, E). Beyin iltihabının skorlanması, omurilik protokolü için ana hatlarıyla belirtilen aynı metodolojiyi kullanarakmm2 doku bölgesi başına CD45 hücrelerinin sayısını sayarak belirli bir beyin bölgesinde (örneğin, serebellar beyaz cevher) yapılır. Burada özetlenen brütleştirme yönteminde, beyinciğin ortasında, Şekil 6A'da gösterildiği gibi beyincik ve beyin sapının perspektifini sağlayan bir kesik vardır.

Bir SIMOA testi kullanılarak sNF-L'nin ölçülmesi, devam eden aksonal yaralanmayı ve relapsing-remitting MS20,21,27,28'de tedaviye yanıtları değerlendirmek için yararlı bir biyobelirteç haline gelmiştir. sNF-L insanlarını ölçmek için kullanılan aynı SIMOA test kiti, fare sNFL 22,23,24'ü ölçmek için uygulanabilir. Bu testin EAE'de aksonal hasarı tespit etmede ne kadar iyi performans gösterdiğini araştırmak için, bir EAE deneyinin son noktasında dişi C57BL6 / J farelerinde sNF-L ölçüldü ve seviyeler, EAE'si olmayan cinsiyet uyumlu sağlıklı kontrol farelerindekilerle karşılaştırıldı. EAE'li farelerin sağlıklı farelere göre çok daha yüksek sNF-L seviyelerine sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 7A) ve bu seviyeler omurilikteki SMI-32+ aksonlarının yoğunluğu ile ilişkilidir (Şekil 7B). Aksonal hasarın histolojik skorlaması ile karşılaştırıldığında, SIMOA testi daha hızlıdır (kanamalı farelerden sonuçlara yarım günden biraz fazla bir sürede ulaşılabilir) ve bu nedenle canlı farelerde bir tedavinin nasıl çalıştığına dair hızlı geri bildirim sağlar. Bu tahlil aynı zamanda hem omurilikte hem de beyinde aksonal hasarı yansıtma avantajına sahiptir.

Şekil 1: Beyin ve omurilik bölümlerinin temsili parafin bloğu. 5 koronal beyin bölümü ve omurilik kesiti (1,5-2 mm kalınlığında) tek bir bölümde kesilebilmeleri için aynı bloğa gömülür. Omuriliğin en az 15 bölümü gömülmeli ve analiz için yeterli bölüm seçimine izin verilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Torasik omurilik seviyesinde meningeal inflamasyon ve yüzde miyelin alanı puanlaması. (A,B), LFB/H&E ile boyanmış MOG p35-55 ile indüklenen EAE'li bir dişi C57BL6/J faresinden torasik omuriliğin görüntülerini gösterir. A'daki fare, birleşik demiyelinizan lezyonlara sahip 4 kadrandan 4'üne sahipken, B'deki fare, etkilenen 4 kadrandan 1'ine sahiptir. B'deki farenin diğer kadranlarda bir miktar iltihaplanma vardır, ancak bu birleşik bir lezyona dönüşmemiştir ve bu nedenle puanlanmamıştır. (C-E) LFB görüntüsü örneği ve imageJ'deki gri tonlamalı ve eşikli görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CD45, LFB H&E, LFB ve SMI-32 ile boyanmış omurilik kesitleri. Omurilikte erken (A,C,E,G) ve geç (B,D,F,H) submeningeal lezyon örnekleri, CD45 antikoru (A,B), LFB/H&E (C,D), tek başına LFB (E,F) ve SMI-32 antikoru (G,H) için boyanmıştır. Siyah oklar, her bir antikorla boyanmış hücre örneklerini gösterir. Beyaz oklar, CD45 + olarak boyanmış varsayılan mikrogliaları gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil, EAE sırasında dişi bir C57BL6 / J faresinin omuriliğindeki lezyonların temsili boyanmasını gösterir ve patolojinin farklı omurilik bölümlerinde nasıl farklı olabileceğini vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: EAE'de lezyonlar ve demiyelinizasyon yüzdesi için skorlama uygulaması. Yumurtalık kanseri G-proteinine bağlı reseptör 1 (OGR1) geninde eksik olan dişi farelerin, C57BL6 / J arka planındaki vahşi tip (WT) dişi C57BL6 / J farelerinden daha az şiddetli klinik EAE geliştirdiği bir EAE deneyi örneği gösterilmiştir. EAE, MOG p35-55 / CFA artı PTX ile aşılama ile indüklendi ve fareler aşağıdaki klinik ölçeğe göre puanlandı: 1 = kuyruk felci. 2 = arka bacak ve ayak zayıflığı, 3 = arka bacak felci, 4 = ön bacak zayıflığı, 5 = can çekişiyor. (A) Farelerin zaman içindeki ortalama + SEM klinik puanları. (B) Ventral omurilikte LFB/H&E boyamasına bir örnek gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Demiyelinizan lezyonlar içeren ortalama + SEM yüzde kadranları. (D) Her grupta ortalama + SEM yüzde demiyelinizasyonu. (E), C57BL6 / J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de yapılan başka bir deneyin sonucunu gösterir, burada bireysel farelerin EAE skorları 30 günlük gözlem boyunca toplandı ve omurilikteki demiyelinizasyon yüzdesi ile ilişkilendirildi. Korelasyonlar Spearman testi kullanılarak yapıldı. (A–D)'deki paneller Souza C ve ark.29'dan uyarlanmıştır. (E)'deki veriler orijinal verilerdir. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Bir genotipin klinik EAE fenotipi üzerindeki etkisini anlamak için SMI-32 boyamanın uygulanması. Bu şekil, C57BL6 / J arka planındaki erkek ve dişi vahşi tip ( Ppard'ın floxed alelini taşır) ve miyeloid spesifik Ppard mutant farelerinin (LysMCre: Ppardfl / fl) MOG p35-55 / CFA ve PTX ile aşılandığı ve 45 gün boyunca takip edildiği bir EAE deneyinin bir örneğini göstermektedir. (A) farelerin ortalama + SEM klinik skorlarını gösterir. (B) omurilikteki SMI-32+ akson sayısının, submeningeal lezyonlarla% kadranların, perivasküler manşetlerle yüzde kadranların ve serebellumdaki #CD3 lezyonların histolojik skorlamasının ortalama + SEM sonuçlarını mm2 doku başına gösterir. Bu deney, SMI-32 boyaması üzerinde bir genotip etkisi göstermiştir. Bu rakam Drohomyrecky'den uyarlanmıştır. vd.15. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Dişi C57BL6/J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de beyin koronal kesitlerinde CD45+/hematoksilen boyama örnekleri. CD45+ lezyonları kahverengi renkte gösterilmiştir. (A) Koronal bölümlerin beyin sapındaki CD45+ lezyonları. Ölçek çubuğu = 150 μm. (B-G) Optik sinirlerde (B), hipokampus (C) altındaki meningeal uzantılarda, beyin sapında (D), korpus kollozumda (E), ventrikül yakınında medial habenula (F) ve beyincikte (G) CD45+ lezyon örnekleri.  Ölçek çubuğu: (B–G) = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de serumdaki sNF-L seviyeleri. (A) Bir deneyin son noktasında dişi kontrol ve EAE farelerinden toplanan serum NFL seviyeleri. Veriler iki kuyruklu Mann Whitney testi kullanılarak analiz edildi. (****p değeri < 0,0001). (B) Omurilik kesitleri son noktada çıkarıldı ve SMI-32 ile boyandı. Beyaz cevher doku alanı başına pozitif hücre sayısı belirlendi ve bir Spearman testi kullanılarak sonlanımda serum NF-L ile ilişkilendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Doku işlemede kullanılan banyoların tanımı. Kasetler, otomatik bir işlemci kullanılarak bu banyo serilerinde otomatik olarak hareket ettirilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Luxol Fast Blue ve Hematoksilen ve Eozin boyama adımları. Bu tablo, Luxol Fast Blue ve Hematoksilen ve Eozin boyama protokolündeki adımların sırasını özetlemektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: İmmünohistokimyasal boyama için kullanılan antikorlar. Bu protokolde kullanılan antikorların yanı sıra inflamasyon, mikrogliozis ve astrogliozu daha fazla araştırmak için kullanılabilecek antikorlar tarif edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: .czi dosyasını TIFF dosyalarına dönüştürme. Yüksek çözünürlüklü bir görüntü kullanmanın en uygun olduğunu, ancak bilgisayarın çalışma belleği sınırlanıyorsa bunun yerine orta çözünürlüklü görüntülerin kaydedilebileceğini unutmayın. Analizlerde aynı çözünürlükte görüntülerin kullanılması zorunludur. Ayrıca, serinin son görüntüsünün slayt etiketi olduğunu unutmayın. Analizin kör olduğundan emin olmak için etiketi okumaktan kaçının. 30,31 Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Shannon Dunn, FSD Lucid Psycheceuticals'a danışmanlık yapıyor.