Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları
Bu makalede
Özet
Özet
Mısır yaprağı kılıflarını hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak patojenik mantarlarla aşılamak için bir protokolü optimize ettik. Yöntem, orijinal olarak pirinç yaprağı kılıflarına uygulanandan modifiye edilmiştir ve canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan mikroskobik gözlemine izin verir. İki adet tam yaprak boğazı ile mısır fidelerinden toplanan yaprak kılıfları, 20 μL damla 5 x 105 spor/mL mantar sporu süspansiyonu ile aşılanır ve sürekli floresan ışık altında 23 °C'de nem odalarında inkübe edilir. 24-72 saat sonra, kimyasal fiksasyon veya temizleme gerektirmeden doğrudan görüntülenebilen optik olarak berrak bir numune olan tek bir epidermal hücre tabakası bırakmak için fazla doku bir tıraş bıçağıyla çıkarılır. Bitki ve mantar hücreleri deney süresince canlı kalır ve etkileşimler gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. Kılıflar, enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında konakçı ve patojen hücrelerin gelişimsel sitolojisini ve canlılığını incelemek için boyanabilir veya plazmolize tabi tutulabilir. Floresan proteinleri eksprese etmek için dönüştürülen mantar suşları, daha fazla çözünürlük için ve rekabetçi veya sinerjik etkileşimlerin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kılıflar üzerine aşılanabilir veya birlikte aşılanabilir. Floresan füzyon proteinlerini eksprese eden mantar suşları, plantadaki bu bireysel proteinlerin üretimini ve hedeflenmesini izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Aşılanmış kılıf dokuları, nükleik asitleri, proteinleri veya metabolitleri karakterize etmek için ekstrakte edilebilir. Bu kılıf tahlillerinin kullanımı, mısırda mantar patojenitesi mekanizmalarının ve ayrıca patojeniteye katkıda bulunan mantar protein efektörlerinin ve ikincil metabolitlerin ayrıntılı çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir.
Giriş
Hücresel düzeyde mekansal ve zamansal analizler, mantar-bitki etkileşimlerinin fizyolojisini ve sitolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kimyasal olarak sabitlenmiş 1,2,3 veya temizlenmiş ve boyanmış4 yaprak dokuları ve yapay zarlar5, geçmişte yaprak patojen gelişiminin sitolojisini ve bitki-mantar etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, canlı konakçı dokulardaki enfeksiyon olaylarının fiksasyon veya temizleme olmadan gerçek zamanlı olarak araştırılması, görüntüleme için optik olarak şeffaf örne....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Yöntemin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Ayrılmış mısır yaprağı kılıfları kullanılarak optimize edilmiş aşılama protokolündeki adımlar. Spor süspansiyon hazırlama, yaprak kılıfı aşılama ve canlı hücre mikroskobu için numune hazırlama sırasıyla yeşil (A), mor (B) ve turuncu (C) kutularda vurgulanmıştır. BioRender.com ile oluşturuldu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aşağıdaki örnekler, mısır yaprağı kılıfı aşılama yönteminin kullanılmasını takiben temsili sonuçları açıklamaktadır. Bu örnekler, bu optimize edilmiş tahlil ile mısır-mantar etkileşimlerinin gözlemlenmesi ve karşılaştırılmasının gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebileceği kolaylık, hız ve hassasiyeti göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme ayrıca nicel bilgilerin çıkarılmasına izin vererek karşılaştırmalı moleküler, sitolojik ve fizyolojik çalışmalar için yararlı bir araç sağlar. Her başarılı başvuru için atıfta bulunu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan optimize edilmiş yaprak kılıfı aşılama yöntemi, pirinç yaprağı kılıfları6,8,36 için geliştirilmiş ve uygulanmış olan orijinal bir protokolden değiştirilmiştir. Geniş alan veya konfokal mikroskopi ile canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan, ayrıntılı gözlemlerine izin verir. Protokol, mısır kolonizasyonu sırasında, uyumlu ve uyumsuz etkileşimler sırasında mantar gelişimi ve konakçı tepki.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını ve ifşa edecek hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar mali destekleri için USDA-NIFA'ya teşekkür eder (hibe numaraları 2018-67013-28489 ve 2020-70410-32901). Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yalnızca yazarlara aittir ve ABD Tarım Bakanlığı'nın görüşlerini yansıtmayabilir. Brezilya'dan Sınır Tanımayan Bilim misafir öğrencisi Mayara de Silva'ya Şekil 6A ve Şekil 7D'de yer alan görüntüler için teşekkür ederiz. Ayrıca, Olympus konfokal mikroskoplarına erişim sağladığı için Kentucky Üniversitesi Bitki Patolojisi Bölümü'ne de teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Axiocam monokrom mikroskop kamerası | ZEISS | 426560-9010-000 | Axioplan 2 mikroskobu ile uyumludur; canlı hücre görüntüleme için düşük okuma gürültüsü ve yüksek hız sağlar |
| Axioplan 2 epifloresan mikroskobu | ZEISS | N/A | Canlı görüntüleme ve görüntü/video çekimine izin verir biyolojik örneklerin |
| Tezgah üstü santrifüj 24 X 1,5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; maksimum hız: 13.300 rpm (17.000 x g) |
| Falcon kapaklı bakteriyolojik Petri kabı | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polistiren malzeme; hidrofobik yüzey |
| Filtre kağıdı | Fisher Scientific | 09-920-115 | Petri plakası nemli odaları için Whatman grade 1 |
| FV 3000 lazer taramalı konfokal mikroskop | Olympus | N/A | Mantar dönüştürücülerinin görselleştirilmesi için' |
| Çimlenme kağıdı | Çapa Kağıt A.Ş. | SD7615L | 76 # plastik kutu nemli odalar için ağır Cam |
| Petri kapları | VWR International | 75845-542 | Tip 1 sınıf A, 33 genleşme borosilikat cam; komple set (kapak + alt), Petri plakası nemli odaları için |
| Cam yünü | Ohio Vadisi Özel Kimya | 3350 | Camyünü filtre üniteleri için |
| Hemositometre/Neubauer sayma haznesi ve kapak camı | VWR Uluslararası | 15170-172 | 0,1 mm hazne derinliği; iki adet 0,4 mm kapak camı ile birlikte gelir |
| Mikroskop lameller | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilikat cam; 100/Pk.; 22 mm uzunluk, 22 mm genişlik |
| Mısır çeşidi Golden Jubilee tohumları | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Kanada | CN361 | Olgunlaşır 95-105 gün içinde; tohum türü: F1 |
| Mikrosantrifüj tüpleri & nbsp; | ABD Bilimsel | 1415-2500 | 1.5 mL kapasiteli |
| Mikroskop lamları | Fisher Bilimsel | 12-550-123 | Superfrost beyaz şeritli slayt; 76 mm uzunluk, 25 mm genişlik |
| Yulaf Ezmesi Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Yulaf Ezmesi Agar, BD; 500 g |
| Oje | Revlon | 43671 | Mikroskop slaytlarını sızdırmaz hale getirmek için şeffaf oje; renk 771 Şeffaf |
| Eteksiz 96 oyuklu PCR plakası | ABD Sientific | 1402-9500 | 100 uL plaka hacmi |
| Mikrosantrifüj tüpleri için havaneli | ABD Bilimsel | 1415-5390 | Konik uç; polipropilen malzeme |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM su hedefi | Olympus | 1-UB933 | Olympus FV 3000 konfokal mikroskop ile uyumlu |
| Patates Dekstroz Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Patates Dekstroz Medyası, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Bahçe Bitkileri Tedarik A.Ş. | N/A | Aşağıdakileri sağlamak üzere formüle edilmiş birinci sınıf genel amaçlı yetiştirme ortamı a su tutma ve uygun drenaj dengesi |
| SC10 konik tutucular | Sera Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inç çapında, 8.25 inç derinliğinde ve 164 mL hacimli |
| SC10 konik tutucu tepsi | Sera Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inç uzunluk x 12 inç genişlik x 6,75 inç yükseklik; 98 adede kadar SC10 koni tutucu tutar |
| Tek kenarlı tıraş bıçağı | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec bıçak; çelik malzeme; 38 mm uzunlukta bıçak |
| Mandallı saklama kapları/kutuları | Hedef | 002-02-0405 | Nemli hazne için net görüşlü saklama kutuları; dış boyutlar: 23 5/8 inç x 16 3/8 inç x 6 1/2 inç; 32 qt. kapasite |
Kaynaklar
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
