Method Article

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

DOI:

10.3791/65772

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  , 
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle fotometrisi, biyomoleküler etkileşimlerin ve etiketsiz çözelti içinde karmaşık oluşumun incelenmesini sağlayan çok yönlü bir kütle ölçüm teknolojisidir. Kütle fotometrisi genellikle 100 pM-100 nM konsantrasyon aralığındaki numuneleri analiz etmek için uygundur. Bununla birlikte, birçok biyolojik sistemde, düşük afiniteli veya geçici etkileşimleri incelemek için daha konsantre numunelerin ölçülmesi gerekir. Burada, kütle fotometrisi ile nanomolar dan onlarca mikromolar kısma kadar analiz edilebilen numune konsantrasyonları aralığını etkili bir şekilde genişleten bir yöntem gösteriyoruz.

Bu protokolde, kütle fotometrisi, mikromolar konsantrasyon aralığında çözelti içinde protein komplekslerinin oluşumunu araştırmak için yeni bir mikroakışkan sistem ile birleştirilir. Mikroakışkan sistem ile kullanıcılar, kütle fotometrisi ölçümünden birkaç milisaniye önce nanomolar aralığa seyreltme ve ardından istenen daha yüksek bir konsantrasyonda bir numuneyi tutabilir. Seyreltme hızı nedeniyle, numunenin dengesi değişmeden önce veriler elde edilir (yani, kompleksin ayrışması).

Teknik, bir immünoglobulin G (IgG) antikoru ile yenidoğan Fc reseptörü arasındaki etkileşimleri ölçmek için uygulanır ve statik kütle fotometrisi ölçümleri ile ölçülemeyen yüksek dereceli komplekslerin oluşumunu gösterir.

Sonuç olarak, kütle fotometrisi ve mikroakışkanların kombinasyonu, mikromolar konsantrasyon aralığındaki numuneleri karakterize etmeyi mümkün kılar ve daha zayıf afinitelere sahip biyomoleküler etkileşimleri ölçmede uzmandır. Bu yetenekler, biyoterapötiklerin geliştirilmesi ve tasarımı da dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda uygulanabilir ve çeşitli protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde karakterizasyonunu sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri, bağışıklık regülasyonundan DNA replikasyonuna ve translasyonuna kadar çoğu hücresel fonksiyonun altını çizer. Sonuç olarak, yaşam bilimleri boyunca, yaygın olarak oluşan çeşitli heterojen kompleksler arasında çok çeşitli etkileşimleri araştırmak için temel bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bunların tespiti, karakterizasyonu ve nicelleştirilmesi, özellikle düşük afiniteli etkileşimler için genellikle zordur1.

İmmünopresipitasyon testleri genellikle yüksek afiniteli etkileşimleri tespit etmek için kullanılır, ancak düşük afiniteli ve geçici etkileşimler için tespit büyük ölçüde mümkün değildir2. Floresan teknikleri de kullanılabilir, ancak floresan etiketlerin potansiyel olarak rahatsız edici bir şekilde eklenmesini gerektirir2. Cryo-EM, yüksek uzamsal çözünürlükle oluşturulan protein komplekslerinin yapısal bir anlık görüntüsünü ve bir topluluk okumasını sağlayabilir, ancak aynı zamanda tipik olarak düşük afiniteli etkileşimleri görüntülemek için çok düşük konsantrasyonlarda çalışmayı gerektirir. Cryo-EM ayrıca maliyet, erişilebilirlik, numune hazırlama ve analiz süresi ile ilgili zorlukları da beraberinde getirir3.

Ek olarak, yüzey plazmon rezonansı (SPR), protein-protein etkileşimlerini ölçmenin popüler bir yolu haline gelmiştir, ancak bağlanma dengesini etkileyebilen ve değişken açılma oranlarına neden olabilen protein immobilizasyonu gerektirmesine rağmen, böylece ölçüm doğruluğunu azaltır 4,5. Ayrıca, veri toplama ve analizinden önce birkaç tahlil adımını içerir6.

Kütle fotometrisi, protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan tek moleküllü bir tekniktir 5,6,7. Tek moleküllerin veya komplekslerin kütlesini, bir cam lamel8'in yüzeyine indiklerinde saçtıkları ışığa dayalı olarak ölçerek çalışır. Kütle fotometrisi ölçümleri, bağlanma ortaklarının nispi bolluğundan ve oluşturdukları komplekslerden bağlanma afinitelerini ölçmek için kullanılmıştır5. Bununla birlikte, diğer tek moleküllü teknikler gibi, ölçülecek numunenin konsantrasyonu tipik olarak 100 nM'den az olmalıdır. Konsantrasyon daha yüksekse, cam yüzeye inen moleküller uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır7. Sonuç olarak, bu düşük konsantrasyonlarda ayrışan daha zayıf etkileşimler(KD ~ mikro azı dişleri), bağlanmamış ve bağlı türlerin gerekli karışımını gözlemlemek mümkün olmadığı için güvenilir bir şekilde ölçülemez5.

Burada, yeni bir birleştirilmiş mikroakışkan kütle fotometri cihazına dayalı olarak bu sınırlamanın üstesinden gelen bir yaklaşımı açıklıyoruz. Spesifik olarak, kütle fotometrisi ile ölçülebilen etkileşim aralığını etkili bir şekilde genişletmek için kütle fotometresi ile birlikte bir mikroakışkan sistem kullanılır. Mikroakışkanların, zayıf etkileşimleri tespit etmek için hızlı seyreltme de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini araştırmak için bir dizi olasılık sunduğu gösterilmiştir 1,9. Burada açıklanan sistem, numuneyi bir mikroakışkan çip üzerinde 10.000 kata kadar hızlı bir şekilde seyrelterek ve hemen çipin gözlem alanı boyunca akıtarak çalışır, bu da kütle fotometrisi ölçümünün, moleküllerin seyreltme işlemine başladığı andan itibaren 50 ms içinde başlamasını sağlar10. Seyreltme, numune ve tampon, çip üzerindeki bir ters Tesla valf karıştırıcısında birleştirildiğinde meydana gelir ve iki çözeltinin nispi akış hızları, meydana gelen seyreltme miktarını belirler (bkz. Protokol adımı 8). Akış hızı, mikroakışkan kontrol yazılımı ile kontrol edilebilir. Akış hızının değiştirilmesi, kütle fotometresi tarafından ölçülen camın yüzeyindeki iniş olaylarının sayısını etkileyebileceğinden, türün göreceli popülasyonunu değiştirebilir.

Sürecin hızı, etkileşimin bütünlüğü bozulmadan önce ölçümün tamamlanması için yeterince hızlıdır (daha fazla ayrıntı için ayrıca Tartışmaya bakın). Bu, birinci dereceden reaksiyonlar teorisine kısa bir bakışla anlaşılabilir.figure-introduction-1 İleri (ilişkilendirme) oran sabiti kf, geri (ayrışma) oran sabiti kb ve denge ayrışma sabiti (KD) şu şekilde tanımlanır:

KD= kb/ kf

Protein bağlanması için, kfgenellikle reaktanların difüzyonu11 ile sınırlıdır ve bu nedenle 106-10 7 M-1·s-1 aralığı ile sınırlıdır. aralığı sınırlı olduğundan, düşük afiniteli (KD ~ mikro azı dişleri) bir reaksiyon kb≈ 1 s-1 olacaktır. Yani, kb= kf · KD= (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1, kompleksin yarı ömrü 0.7 s11,12 civarındadır.

Örnek sistemimiz, IgG monoklonal antikoru trastuzumab'ın, etkileşimli ortaklar olarak bilinen IgG neonatal Fc reseptörünün (FcRn) çözünür alanına bağlanmasıdır13. Tek başına konvansiyonel kütle fotometrisi kullanılarak elde edilen daha önce yayınlanmış veriler (yani, numunelerin manuel seyreltilmesiyle), proteinlerin birden fazla tür oluşturduğunu gösterdi. FcRn monomerleri, FcRn dimerleri ve bağlanmamış IgG açıkça görülürken, IgG-FcRn kompleksleri (1: 1 ve 1: 2 oranlarında) da (pH 5.0'da) tespit edildi, ancak sadece çok düşük bollukta5. Bu gözlem, daha yüksek bir konsantrasyonda ölçüldüğünde IgG-FcRn kompleks oluşumunun daha net bir şekilde tespit edilip edilemeyeceği sorusunu gündeme getirmektedir. Gerçekten de, kütle fotometrisini burada açıklanan birleştirilmiş bir hızlı seyreltme yaklaşımıyla birleştirmek, ölçülen parçacıklarındaki bir artışla karmaşık oluşumun daha sağlam kanıtlarını sağladı.

Burada tarif edilen kütle fotometrisi ve mikroakışkan protokolü, mikromolar aralığakadar bir KD ile komplekslerin oluşumunu karakterize etmeyi mümkün kılar. KD'nin ampirik bir şekilde belirlenmesi, akış sensörü doğruluğu, pompa stabilitesi, çipten çipe varyasyonlar ve gözlem penceresi içindeki ölçüm konumu üzerinde daha fazla iyileştirme gerektirecektir, çünkü tüm bu faktörler numunenin seyreltildiği andan ölçülmeye kadar geçen süreyi etkileyecektir.

Aynı yaklaşım, bir kütle fotometresi (30 kDa ila 6 MDa) ile analiz için uygun aralığa giren farklı moleküler ağırlıklara (en az 25 kDa ile ayrılmış) sahip olmaları koşuluyla, herhangi bir çözünür protein arasındaki bağlanmayı araştırmak için de uygulanabilir. Elde edilen içgörüler, hücresel işlevlerin mekanik bir şekilde anlaşılmasından yeni biyoterapötik ilaçların tasarımına kadar çeşitli bağlamlardaki çalışmalar için yardımcı olabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Enstrümanların hazırlanması ve yazılımın başlatılması

  1. Kütle fotometresini açın ve herhangi bir ölçüme başlamadan önce en az 1 saat açık bırakın.
    NOT: Bunun nedeni, cihazın sabit bir sıcaklığa ulaşması gerektiğidir. Kütle fotometresini 1 saat boyunca açık bırakmamak, kütle kaymasına ve dolayısıyla yanlış sonuçlara neden olabilir.
  2. Gücü açarak ve izolasyon düğmesine basarak (kütle fotometresinin altında) titreşim önleyici tabloyu açın. Titreşimler, kütle fotometrisi cihazının performansını sınırlar, bu nedenle titreşim önleyici tablo, maksimum cihaz hassasiyetini sağlamak için önemlidir. Mikroakışkan kutusunu açın.
  3. Veri toplama yazılımını ve mikroakışkan kontrol yazılımını başlatın. Hava kompresörünü açın.

2. Protein örneklerinin, tamponun ve temizleme solüsyonlarının hazırlanması

  1. Temiz bir 200 mL şişeye 200 mL PBS (pH 7.4) tamponu ve ikinci bir 200 mL şişeye 200 mL PBS (pH 5.0) tamponu ekleyin.
    NOT: Sonraki adımlarda 200 mL'lik şişelerin "L" Akış Birimi Sensörüne bağlanması gerekecektir. Kalibrasyon ölçümü için pH 7.4 PBS tamponu ve numune ölçümü için pH 5.0 PBS tamponu kullanın.
  2. 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, toplam 60 μL'lik bir hacim için IgG (2 μM) ve FcRn'yi (20 μM) 1:10 oranında karıştırın.
    1. FcRn ve IgG için stok çözeltileri sırasıyla 91.9 μM ve 13.5 μM'dir. Toplam 60 μL hacim için bir santrifüj tüpünde 9 μL stok IgG + 13 μL stok FcRn + 38 μL PBS (pH 5.0, oda sıcaklığı [RT]) karıştırarak reaksiyonu hazırlayın. İki reaktan için nihai konsantrasyonlar IgG için 2 μM ve FcRn için 20 μM idi. Bu işlem boyunca tüm protein stoklarını buz üzerinde tutun.
  3. Başka bir 0.5 mL santrifüj tüpünde, 20 μM konsantrasyonda 20 μL β-Amilaz kalibranı dağıtın.
    1. Örnek olarak, burada kullanılan β-Amilaz kalibranını hazırlamak için 2.3.1.1-2.3.1.2'de açıklanan prosedürü izleyin.
      1. Şişedeki 20 mg β-Amilaz tozunu, 5.6 mg / mL'ye ve 100 μM'lik bir molar konsantrasyona (moleküler ağırlık 56 kDa olduğu için) karşılık gelen 3.57 mL PBS (% 5 gliserol) içinde yeniden süspanse edin.
      2. 20 μM'ye seyreltmek için, 100 μM'lik stoğun 200 μL'sini 1 mL'lik bir santrifüj tüpünde 800 μL PBS (pH 7.4, RT) ile birleştirin.
  4. Numuneleri RT'de en az 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Kütle fotometresini açtıktan sonra numuneyi ve kalibant seyreltmelerini hazırlamaya başlayın. Bu deney için numuneler 120 dakika inkübe edildi.
  5. Üç adet 50 mL'lik santrifüj tüpünde, alikot: 50 mL PBS (pH 7.4) - temizleme solüsyonu 1 (CS1), 50 mL 0.5 M NaOH - temizleme solüsyonu 2 (CS2) ve 50 mL %100 IPA - temizleme solüsyonu 3 (CS3).

3. Deney kurulumu

  1. Numuneyi ve kalibantı yüklemek için, kalibant santrifüj tüpünü 4 konumuna ve numune santrifüj tüpünü mikroakışkan kutusunun 5 konumuna yerleştirin (Şekil 1).
  2. Temizleme solüsyonlarını yüklemek için CS1, CS2 ve CS3'ü mikroakışkan kutusunun 1, 2 ve 3 konumlarına yerleştirin (Şekil 1).
    NOT: Numune, kalibant ve temizleme solüsyonları çoklu anahtara (m-anahtarı) bağlanır. M anahtarı, "S" akış birimi sensörüne bağlanır.
  3. Tampon hattına bağlanan kapağı 200 mL (pH 7.4) tampon şişesine vidalayın.
    NOT: Tampon hattı, "L" akış birimi sensörüne bağlı olan bir kapatma vanasına bağlıdır. Kapatma vanası, tampon akışı durdurulduğunda oluşabilecek herhangi bir sifonlama etkisini önler. Sifonlama, tampon rezervuarına geri dönen seyreltilmiş artık sıvıdan tamponun kirlenmesine neden olabilir.
  4. Mikroakışkan çipi bir hazırlık plakasına yerleştirin.
    "S" akış birimi sensörünün diğer boru ucunu mikroakışkan çipindeki ilk kanalın "S girişi" içine itin (Şekil 1). Örnek hat tamamlandı.
  5. "L" akış birimi sensörünün diğer boru ucunu mikroakışkan çipteki ilk kanalın "Tampon girişine" itin (Şekil 1). Tampon hattı tamamlandı.
  6. Çıkış akışını toplamak için, mikroakışkan çipindeki ilk kanalın "Çıkışına" bir tüp itin; diğer ucunu, atık olarak alınabilir bir şişeye veya behere akacak şekilde konumlandırın (Şekil 1).

4. Numune ve tampon hatlarının tampon ile astarlanması

  1. Tampon hattındaki manuel kapatma vanasını açın.
  2. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, tampon hattı akış hızını 1000 μL/dk'ya ayarlayın ve tampon hattı basıncının 110 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2). Akış, tampon hattında otomatik olarak başlayacaktır (Şekil 1).
    NOT: Tampon hattı basıncı 110 mbar'ı aşarsa, bunun nedeni akış sensöründen geçen hava olabilir. Basınç birkaç saniye içinde normale dönmezse, potansiyel olarak bir tıkanıklık vardır (genellikle bağlantılarda sıkışmış boru nedeniyle). Bu durumda, akışı durdurun ve kapatma vanasından başlayarak tampon hattındaki bağlantıları kontrol edin.
  3. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarının 1. konumunu seçin (PBS tamponuna karşılık gelir), ardından numune hattı akış hızını 8 μL/dk'ya ayarlayın ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun. Akış, numune hattında otomatik olarak başlayacaktır (Şekil 1).
  4. Hava kabarcıklarını çıkarmak ve çıkıştan çıkarıldıklarından emin olmak için çipte sıkışan kabarcıkların yakınında yukarıdan hafif bir basınç uygulamak için bir pipet ucu (veya başka bir yumuşak plastik bileşen) kullanın.
    NOT: Kullanılan kanalın 'mikser' ve 'gözlem alanı' (Şekil 1) bölümlerindeki tüm baloncukları çıkardığınızdan emin olun. Çipe zarar verebileceğinden çok fazla itmemeye dikkat edin.

5. Mikroakışkan çipin kütle fotometresine yerleştirilmesi ve odağın bulunması

  1. Kütle fotometresinin objektifine bir damla mikroskop daldırma yağı sürün.
  2. Mikroakışkanlar çipini, "Numune Girişi" yukarı bakacak şekilde kütle fotometresinin tutucusuna yerleştirin ve s'ye bağlı tutun.amps (Şekil 1). Tüm boru bağlantılarının takılı kaldığından emin olun.
  3. Veri toplama yazılımını kullanarak, kanal 1'in "Gözlem alanının" hedefle uyumlu olduğundan emin olmak için sahneyi hareket ettirin (Şekil 1).
  4. Kütle fotometresi kapağını kapatın ve veri toplama yazılımındaki Damlacık Seyreltme Odak Bul seçeneğine basın.
  5. Veri toplama yazılımının sol alt köşesindeki beyaz odak halkasını kontrol edin (Şekil 3). Halkadaki boşluklar, daldırma yağında bir hava kabarcığının varlığını gösterir; Bunu, sahne hızını maksimuma çıkararak ve sahneyi yavaşça yanal olarak hareket ettirerek kaldırın.
  6. Odaklama tamamlandıktan sonra, ilk kaydı çekmeden önce 2-3 dakika bekleyin. Ardından, 1 dakikalık bir ölçüm kaydetmek için Kaydet'e basın ve (ölçümü gözlemleyerek) hiçbir kirlilik görünmediğinden emin olun.
    NOT: Kirlilikler cam yüzeyde veya tamponda olabilir. Veri toplama yazılımındaki Keskinlik değeri %4,5'in üzerinde olmalıdır.

6. Kütle fotometrisi kalibrasyonu

  1. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarını konum 4'e (kalibrete karşılık gelen) getirin ve numune hattı akış hızının 8 μL/dak olarak ayarlandığından ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2).
    1. Kalibrant, çip boyunca akışa başlayacaktır. Yaklaşık 1,5-2,5 dakika bekleyin (veya kalibrant veri toplama yazılımında tutarlı bir şekilde görünene kadar). Süre, numune hattı boru uzunluğuna bağlı olarak değişebilir.
  2. Kalibant tutarlı bir şekilde görüldüğünde (yani, olay sayısı doğru bir kütle fotometrisi ölçümü için yeterli olduğunda), mikroakışkanlar kontrol yazılımında akış hızını bu deney için hedef seyreltme seviyesi olan 0,5 μL/dk'ya düşürün.
    NOT: Daha yüksek bir akış hızıyla başlamak, kalibrantın çipe ulaşması için gereken süreyi azaltır.
  3. Ölçüm yüzeyine inen "çok az" veya "çok fazla" molekül olmadığından emin olun (Şekil 4).
    1. İniş olayı yoğunluğu "ideal" değilse (Şekil 4), mikroakışkanlar kontrol yazılımında akış hızını değiştirin. Olay yoğunluğu çok düşükse, iyi ayrılmış iniş olayları gözlemlenene kadar (ancak 8 μL/dk'yı aşmayın) numune akış hızını artırın. Çok yüksekse, numune akış hızını azaltın (ancak 0.1 μL/dk'nın altına düşmeyin).
    2. Numune tüpünde kalibant hacmi azalıyorsa, hava enjekte etmekten kaçınmak için m-anahtarı konumunu PBS pH 7.4 çizgisine (konum 1) değiştirin.
  4. Kaydet'e basın ve 60 sn ölçüm yapın. Dosyayı seçilen bir klasöre kaydedin.
    NOT: Veri toplama yazılımı, uzantısı .mp olan dosyalar üretir.

7. Numune hattının temizlenmesi ve akışın durdurulması

  1. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarının 2. konumuna geçin ve numune basıncını 800 mbar'a değiştirin (Şekil 2). Sistemi CS2 (NaOH) ile 4 dakika boyunca yıkayın.
  2. M-switch'in 3. konumuna geçin ve sistemi CS3 (IPA) ile 4 dakika boyunca yıkayın.
  3. M-switch'in 1. konumuna geçin ve sistemi 1 dakika boyunca CS4 (PBS) ile yıkayın.
  4. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, numune hattı ve tampon hattı basınçlarını 0'a ayarlayarak tüm akışı durdurun ve tampon valfini kapatın.
  5. Çipi sahneden ayırın ve tekrar hazırlama plakasına yerleştirin. Tüm boruları ayırın ve numune boru ucunu bir atık şişesine yerleştirin. Hedefi izopropanol ve mendillerle temizleyin.

8. Kütle fotometrisi örneğinin ölçülmesi

  1. 200 mL (pH 7.4) tampon şişesine bağlı kapağı sökün ve 200 mL (pH 5.0) tampon şişesine vidalayın.
  2. 3.4-5.6 adımlarını tekrarlayın, ancak çipin ilk kanalı yerine ikinci kanalını kullanın.
  3. Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarını konum 5'e (örneğe karşılık gelen) getirin, numune hattı akış hızını 8 μL/dk'ya ayarlayın ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2).
  4. Numuneyi ölçmek için 6.2-6.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
    1. Kullanılacak akış hızlarını hesaplamak için, akış hızındaki katlama farkının istenen numune seyreltme faktörü ile eşleştiğinden emin olun. Örneğin, burada 2000x'lik seyreltmeyi elde etmek için, akış hızları 2000 faktörü ile farklılık gösterir; tampon akış hızı 1000 μL/dk ve numune akış hızı 0,5 μL/dk'dır. Bir deneyin sonunda, temizleme protokolünü takip ederek hatları daima temiz bırakın.

9. Veri analizi

  1. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, veri analiz yazılımını başlatın (Şekil 5).
  2. Sol üstteki artı (+) simgesine tıklayın ve .mp calibrant dosyasını seçin. Yazılım yüklenen dosyayı analiz etmeye başlayacaktır. Ölçümün boyutuna ve sayısına bağlı olarak bu işlem birkaç dakika sürebilir
    1. Veri toplama yazılımı ile veri alırken veri analiz yazılımındaki .mp dosyalarını analiz etmeyin, çünkü bunu yapmak elde edilen verilerin kalitesini düşürebilir.
  3. Kütle kalibrasyonu oluştur düğmesine basın (sağ altta). Takılan tepe noktalarının kontrast değerleriyle doldurulmuş bir tabloyu gösteren bir iletişim kutusu açılacaktır.
  4. Değerleri, takılan tepe noktaları için bilinen kütle değerlerine değiştirin (β-amilaz için bu değerler 56 kDa, 112 kDa ve 224 kDa'dır) ve Kaydet'e basın. Yeni oluşturulan kalibrasyon dosyası (.mc uzantılı) Kütle Kalibrasyonu panelinde (veri analiz yazılımının sol alt kısmında) görünecektir (Şekil 6).
  5. Sol üstteki artı (+) simgesine tıklayın ve .mp örnek dosyasını seçin.
  6. Şekil 5'te gösterildiği gibi bir kütle histogramı oluşturmak için Analiz sekmesine gidin, Histogram modunu ve Kütle grafiği seçeneğini seçin. Kutu genişliğini, Kütle Limitlerini ve diğer parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
  7. Şekilleri dışa aktarmadan ve/veya tüm çalışma alanını bir .dmp dosyası olarak kaydetmeden önce istenirse Şekiller sekmesinde çizimi daha fazla özelleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IgG monoklonal antikoru trastuzumab ile IgG neonatal Fc reseptörünün (FcRn) çözünür alanı arasındaki etkileşimi ölçmek için kütle fotometrisi kullanıldı. İki proteinin 1:10'luk bir karışımı (IgG için 2 μM'de ve FcRn için 20 μM'de) PBS'de sırasıyla 10 nM ve 20 nM'ye manuel olarak seyreltildi.

Seyreltme adımı gereklidir çünkü tek moleküllü bir kütle ölçüm tekniği olan kütle fotometrisi yalnızca 100 pM-100 nM aralığındaki numuneleri analiz edebilir. Bu aralığın dışındaki konsantrasyonlara sahip numuneleri ölçmeye çalışmak, sonuçların doğruluğunu tehlikeye atabilir (Şekil 4). Bu deney, daha önce 5,6 olarak tanımlandığı için bu Protokole dahil edilmemiştir.

Bir kütle fotometrisi deneyinde üretilen kütle histogramlarında, her iniş olayı için saçılma sinyalinin (veya 'kontrastın') gücü x ekseni üzerinde çizilir ve kütle-kontrast kalibrasyon adımı aracılığıyla moleküler kütleye dönüştürülür. Bu arada, y ekseni belirli bir kütle (veya kontrast) ile sayılan molekül sayısını gösterir. Bu nedenle, bir tepe noktası, x ekseninde gösterilen moleküler ağırlıklar aralığında bir molekül popülasyonunun varlığını gösterir. Zirveyi oluşturan olayların (sayımların) sayısı, o popülasyonun boyutunu yansıtır.

Manuel seyreltme ile kütle fotometrisi ölçümü, proteinlerin beklenen moleküler ağırlıklarına dayanan en büyük iki tepe noktasının, bağlanmamış FcRn monomerlerine (~ 50 kDa) ve IgG antikor monomerlerine (~ 150 kDa) karşılık geldiği bir kütle histogramı ile sonuçlandı (Şekil 7). Daha önce yayınlanan kütle fotometrisi verilerine5 benzer şekilde, bağlanmamış türler belirginken, komplekslere karşılık gelen kütle aralıklarındaki zirveler çok daha az belirgindi.

Deney, kütle fotometrisi ölçümünden hemen önce karışımı gerekli konsantrasyona seyreltmek için hızlı seyreltme mikroakışkan bir sistem kullanılarak tekrarlandı. Bu yaklaşım, manuel seyreltme adımı sırasında ayrışmış olabilecek ek düşük afiniteli komplekslerin tespit edilmesini sağladı. Manuel seyreltme deneyi sırasında kullanılan aynı 2000x seyreltme faktörünü elde etmek için, 1:10 numune karışımı (IgG için 2 μM konsantrasyonda ve FcRn için 20 μM konsantrasyonda) mikroakışkan çip üzerine 0.5 μL/dk hızında akıtıldı, PBS tamponu (pH 5.0) ile birlikte 1 mL/dk'lık bir akış hızında. Ölçüm sırasında proteinlerin bozulmadığından emin olmak için, numunelerin 120 dakika inkübasyonunu takiben mikroakışkan sistem ile akış altında IgG (2 μM) ve FcRn (20 μM) ölçüldü. Bireysel kontrol ölçümleri protein bozulması göstermedi (Ek Şekil 1)

Hızlı seyreltme uygulanan numune için, FcRn monomerlerine (53 kDa), FcRn dimerlerine (97 kDa) ve IgG monomerlerine (148 kDa) karşılık gelen pikler tekrar gözlemlenebilir. Ayrıca, 196 kDa ve 251 kDa'da, 1:1 ve 1:2 stokiyometrili IgG-FcRn komplekslerine karşılık gelen iki ek tepe açıkça gözlenmiştir (Şekil 7). Bu iki kompleks için beklenen kütleler sırasıyla 200 kDa ve 250 kDa idi. Kütle ölçümündeki değişkenlik, bu çalışmada kullanılan kütle fotometresi için ölçüm hatası dahilindedir, ±5%14'tür (1:1 kompleks için %2 ve 1:2 kompleks için %0,4).

Bu komplekslerin sadece hızlı bir şekilde seyreltilmiş numunede bulunması, daha düşük konsantrasyonlarda, manuel bir seyreltme işlemine göre hızlı, ancak mikroakışkan sistem15 ile elde edilen hızlı seyreltme işlemine göre yavaş bir oranda ayrışma eğiliminde oldukları fikriyle tutarlıdır.

figure-results-1
Şekil 1: Mikroakışkanların kütle fotometrisi ile birleştirilmesi. (A,B) Bu protokolde kullanılan mikroakışkan kutusu, (A) ön ve (B) üstten görüldüğü gibi. Temizleme solüsyonları 1-3 pozisyonlarına, numuneler ve kalibrantlar ise 4-6 pozisyonlarına yerleştirilir. Tüm çözümler, "Küçük" akış birimi sensörüne bağlı olan m-switch'e bağlanır. (C) Tüm sisteme genel bakış. Bilgisayar (sol üst), mikroakışkan kutusuna (tampon ve numune tüplerinin yanında gösterilmiştir) ve mikroakışkan çipinin bulunduğu kütle fotometresine (sağ altta) bağlanır. Küçük akış hızı monitörü (FRMS) numune hattındaki akışı izlerken, büyük akış hızı monitörü (FRML) tampon akışını izler. Numune ve tampon hattı borusu, kütle fotometresinin içine yerleştirilmiş mikroakışkan çip üzerindeki bir kanala bağlanır. (D) Her çipin üç kanalı vardır. FRMS, numune girişine ve FRML tampon girişine bağlanır. Karıştırıcı alanı, hızlı numune seyreltmesinin gerçekleştiği yerdir, gözlem alanı ise kütle fotometrisi ölçümlerinin yapıldığı yerdir. Çipte sızıntı olmadığından emin olmak için çıkış, ek bir akış sensörü tarafından izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikroakışkan kontrol yazılımı. Bu yazılımla, akış hızlarını, mikroakışkan sistemin basınç hatlarını ve çoklu anahtarın (m-anahtarı) konumunu ayarlayın ve izleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Yağdaki kabarcıkların varlığının belirlenmesi. Veri toplama yazılımından alınan örnekler, daldırma yağında hava kabarcıklarının varlığını gösteren net, kesintisiz bir odak halkasını (solda) ve 'kırık' bir halkayı (sağda) göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Molekül iniş olaylarının sayısının çok az, ideal veya çok fazla olduğu numune konsantrasyonlarının temsili örnekleri. Mikroakışkanlar çipindeki gözlem alanının yüzeyine inen moleküller, kütle fotometrisi görüntüsünün oransal görünümünde karanlık noktalar olarak görünecektir. Optimal olarak, istenen konsantrasyon, veri toplama sırasında (ortada) ideal bir iniş olayı yoğunluğunun gerçekleşmesini sağlamalıdır. İniş olayı yoğunluğu çok düşükse (üstte, 'Çok az'), kütle fotometrisi verilerinin doğru istatistiksel analizi tamamlanamaz. Çok yüksekse (altta, 'Çok fazla'), iniş molekülleri uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır. Bu görüntüler, bir kütle fotometresi kullanılarak veri toplama yazılımı ile yakalandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Kütle fotometrisi için veri analiz yazılımının ekran görüntüsü. Burada, veri toplama yazılımından dışa aktarılan .mp dosyaları, verileri analiz etmek için yüklenebilir. İşlenen verilerden rakamlar oluşturulabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Bu deney için kütle kontrast kalibrasyonunun ekran görüntüsü. Kullanılan kalibrant, üç tür oluşturduğu bilinen β-Amilaz idi: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) ve tetramer (224 kDa). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Kütle histogramları, yalnızca hızlı numune seyreltmesinden sonra karmaşık oluşumu ortaya çıkarır. Kütle histogramları ve karşılık gelen en uygun Gauss dağılımları, manuel seyreltme (turuncu) veya mikroakışkanlarHC sistemi (mavi) yoluyla hızlı seyreltmeyi takiben IgG ve FcRn içeren numunelerin ölçümleri için gösterilmiştir. Kütle etiketleri, Gauss eğrilerinden elde edilen ortalama değerlerin, hızlı seyreltmeden sonra ölçülen kütle histogramlarına uyduğunu gösterir. Manuel seyreltmeden sonra, FcRn monomerlerine (manuel seyreltme ile ölçüldüğü gibi 52 kDa) ve IgG monomerlerine (152 kDa) karşılık gelen pikler gözlendi. Hızlı seyreltmeden sonra, FcRn ve IgG monomerlerine ek olarak, 1: 1 ve 1: 2 stokiyometri ile FcRn dimerlerine ve IgG-FcRn komplekslerine karşılık gelen pikler de açıkça gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Veriler Şekil 1: Hızlı seyreltmeden sonra kontrol numunelerinin kütle fotometrisi ölçümleri, protein bozunması göstermez. (A) Yalnızca FcRn numunesi için kütle histogramı ve en uygun Gauss dağılımı. Hızlı seyreltmeden önceki ilk numune konsantrasyonu 20 μM idi ve akış hızı 0,5 μL/dk olarak ayarlandı. FcRn monomerlerine (53 kDa) ve FcRn dimerlerine (97 kDa) karşılık gelen kütle zirveleri gözlenebilir. (B) Sadece IgG (Herceptin) numunesi için kütle histogramı ve en uygun Gauss dağılımı. Hızlı seyreltmeden önceki ilk numune konsantrasyonu 2 μM idi ve akış hızı 1 μL/dk olarak ayarlandı. IgG monomerine (155 kDa) karşılık gelen tek bir kütle zirvesi gözlemlenebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada özetlenen protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Hızlı seyreltme mikroakışkan sistemine bağlı bir kütle fotometresi kullanır. Kütle fotometrisi, 30 kDa ila 6 MDa aralığındakiler için biyomoleküller16 çözeltisindeki moleküler kütleyi güvenilir bir şekilde ölçebilen, etiketsiz, biyoanalitik bir araçtır. Kütle fotometrisi, numuneleri tek tek analiz eden tek moleküllü bir teknik olduğundan, genellikle 100 pM-100 nM konsantrasyon aralığındaki numunelerle sınırlıdır. Bu aralığın üzerinde, cam yüzeye inen moleküller uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır; Bu aralığın altında, sağlam analiz yapmak için çok az veri elde edilir7. Önemli bir sonuç, protein etkileşimlerinin araştırılmasını, bu aralıktaki bağlı ve bağlanmamış türlerin bir karışımını oluşturanlarla sınırlayabilmesidir.

figure-discussion-1

figure-discussion-2

figure-discussion-3figure-discussion-4

figure-discussion-5

figure-discussion-6

figure-discussion-7

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myndert Claasen ve Zornitsa Kofinova, bu makalede kullanılan kütle fotometresi ve mikroakışkan sistemini üreten Refeyn Ltd'nin çalışanlarıdır. Weston Struwe, Refeyn Ltd.'nin hissedarı ve danışmanıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WS, UKRI Geleceğin Liderleri Bursu [MR / V02213X/1] tarafından desteklenmektedir. El yazması metin ve grafikler, Refeyn'in bilimsel iletişim ekibinin (Panagiota Paganopoulou, Neus Torres Tamarit ve Catherine Lichten) desteğiyle hazırlandı. Ayrıca Camille Hetez, Sofia Ferreira ve Matthias Langhorst'tan gelen değerli geri bildirimlere de teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-Propanol (İzopropanol)VWR International LLC20880.320
Veri toplama yazılımıRefeynAcquireMP (v2022 R1)
Veri analiz yazılımıRefeynDiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-TagSigmaSRP0624
Herceptin (IgG) Cambridge BioscienceHY-P9907-1mg
Kütle fotometresiRefeynTwoMP
Mikroakışkanlar kutusuRefeynMassFluidix HC sistemi
Mikroakışkanlar çipiRefeynMassFluidix HC çipi
Mikroakışkanlar kontrol yazılımıFluigentOxyGEN
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1x Ultra SafVWR International LLCK812
Sodyum Hidroksit (NaOH) SigmaS2770
ve beta; -Amilaz, tatlı patatesSigmaA8781'den

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386(2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784(2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575(2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264(2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39(2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288(2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935(2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521(2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass PhotometryProtein Complex FormationMicrofluidics SystemProtein InteractionsLow Affinity InteractionsSample DilutionImmunoglobulin GFc ReceptorMass HistogramBiomolecular Interactions

Related Articles