Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar
Bu makalede
Özet
Özet
Mitofaji, optimal mitokondriyal fonksiyonu sürdürmek için gerekli bir kalite kontrol mekanizmasıdır. Disfonksiyonel β hücreli mitofaji, yetersiz insülin salınımına neden olur. Mitofajinin gelişmiş kantitatif değerlendirmeleri genellikle genetik raportörlerin kullanılmasını gerektirir. Akış sitometrisi yoluyla mitofajiyi ölçmek için mitokondri hedefli pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu ifade eden mt-Keima fare modeli, β hücrelerde optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı, mitofajiyi sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık genetik fare modelleri veya birincil insan adacıkları gibi transfekte edilmesi zor hücrelerle çalışırken genetik mitofaji raportörlerini kullanmak zor olabilir. Bu protokol, MtFagy kullanarak birincil adacıklarda β hücreli mitofajiyi ölçmek için yeni bir tamamlayıcı boya bazlı yöntemi açıklar. MtFagy, mitokondride biriken ve mitofaji sırasında lizozomlar gibi mitokondri düşük pH'lı ortamlarda olduğunda floresan yoğunluğunu artıran, pH'a duyarlı, hücre geçirgen bir boyadır. MtFagy boyasını, β hücrelerini seçen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-ve mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) ile birleştirerek, mitofaji akısı, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerde spesifik olarak ölçülebilir. Bu iki yaklaşım oldukça tamamlayıcıdır ve çok sayıda β hücreli modelde mitokondriyal kalite kontrolünün değerlendirilmesinde esneklik ve kesinlik sağlar.
Giriş
Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütlerezervine bağlı olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir 1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde sunulan hayvan çalışmaları, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için 15 haftalık düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD) kullanan yirmi haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.
1. Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 1)
- Fare adacığı hazırlama ve tedavi
- Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
- Daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD,% 60 kcal%
- Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi
Bu boya bazlı yaklaşım, ölü hücreleri dışlamak için DAPI'nin yanı sıra Fluozin-3-, TMRE ve MtPhagy kullanılarak, genetik bir raportöre ihtiyaç duymadan birincil fare β hücrelerindeki mitofaji akışını analiz etmek için optimize edilmiştir. Bu protokol, mitofajiyi indüklemek için bu boyaları valinomisin ile eşleştirerek, birincil fare β hücrelerinde mitofaji akısını seçici olarak ölçmek için boya bazlı bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, ayrışmış primer fare adacıklarında mitofaji akısını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemi tanımladı. Mt-Keima yöntemi kullanılarak, mitofajideki bir artış, asidik (561 nm) / nötr (405 nm) hücrelerin oranının artması olarak ölçülürken, MtFaji yönteminde, artan mitofaji akısı, FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücre popülasyonunda bir artış olarak ölçüldü. Bu yöntemler, mitofaji akısının hızlı, kantitatif ve β hücreye özgü değerlendirmelerine izin verir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
SAS, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.'den hibe fonu almıştır ve Novo Nordisk'in danışmanıdır.
Teşekkürler
E.L-D. NIH'den (T32-AI007413 ve T32-AG000114) destek alır. SAS, JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Gazi İşleri Bakanlığı (I01 BX004444), Brehm ailesi ve Anthony ailesi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antibiyotik-Antimikotik | Yaşam Teknolojileri | 15240-062 | |
| Attune NxT Akış Sitometresi | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| Dimetil Sülfoksit | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Yağ Asidi Serbest ısı şoku BSA tozu | Equitech | BAH66 | |
| Fetal sığır serumu | İkizler Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Bilimsel | F24195 | 100 ve mu; g Fluozin-3AM tozu, 51 & mu'da yeniden yapılandırıldı; L DMSO ve 51 μ L Pluronic F-127 1 mM stoka ulaşacak. |
| Gibco RPMI 1640 Orta Fisher | Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Yaşam Teknolojileri | 15630-080 | |
| MtPhagy boya | Dojindo | MT02-10 | 5 μ g MtPhagy tozu 50 &mu ile sulandırıldı; L DMSO 100 &mu'ya ulaşmak için; M hissesi. |
| MtPhagy boya | Dojindo | MT02-10 | |
| Penisilin-Streptomisin (100x) | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | 1x ddH2O Fosfat tamponlu tuzlu suda 1:10 seyreltilerek prokotolde kullanılan |
| , 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | ddH2O Sodyum Pirüvat (100x)Yaşamda 1:10 seyreltilerek prokotolde kullanılan çözelti |
| Teknolojiler | 11360-070 | 5 μ g MtPhagy tozu 50 &mu ile sulandırıldı; L DMSO 100 &mu'ya ulaşmak için; M hissesi. | |
| TMRE [Tetrametilrodamin, etil ester, perklorat] | Anaspec | AS-88061 | TMRE tozu, DMSO'da 100 & mu'ya ulaşacak şekilde yeniden yapılandırıldı; M hisse senedi. |
| Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomisin | Sigma | V0627 | Valinomisin tozu, 250 nM stoğuna ulaşmak için DMSO'da yeniden yapılandırıldı. |
Kaynaklar
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility ge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
