Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütle^{rezervine bağlı} olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir ^1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir⁴. Mitofaji olarak da bilinen seçici mitokondriyal otofaji, mitokondriyal kalite kontrol yolunun önemli bir bileşenidir.

Canlı hücrelerde mitofaji değerlendirmeleri genellikle mitofaji sırasında meydana gelen mitokondriyal pH'daki değişikliklere dayanır. Mitokondri hafif alkali bir pH'a sahiptir ve sağlıklı mitokondri normalde pH-nötr sitozolde bulunur. Mitofaji sırasında, hasarlı veya işlevsiz mitokondri seçici olarak otofagozomlara dahil edilir ve sonunda asidik lizozomlar⁵ içinde temizlenir. mt-Keima⁶, mitoQC⁷ ve CMMR⁸ gibi birkaç in vivo transgenik mitofaji raportör fare modelinin yanı sıra Cox8-EGFP-mCherry plazmid⁹ gibi transfekte edilebilir mitofaji probları, mitofajinin kantitatif değerlendirmelerini sağlamak için bu pH değişimini kullanır. mt-Keima pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu eksprese eden transgenik farelerin kullanımı, akış sitometrisi^10,11 yoluyla adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji değerlendirmeleri için optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı (asidik 561 nm'nin nötr 480 nm uyarıma oranı) mitofajiyi ^6,12 sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.

Bu protokol, mt-Keima transgenik farelerinden izole edilen primer adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklar^10,11. mt-Keima oldukça hassas bir prob olsa da, ya karmaşık hayvan yetiştirme şemaları ya da hücrelerin transfeksiyonunu gerektirir, bu da diğer genetik modellerle veya birincil insan adacıklarıyla birlikte çalışırken genellikle zor olabilir. Ek olarak, nötr ve asidik hücre popülasyonlarını tanımlamak için çoklu floresan lazerlerin ve dedektörlerin kullanılması, diğer floresan raportörlerin kombinatoryal kullanımını sınırlayabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol aynı zamanda izole fare adacıklarından β hücrelerinde mitofajinin sağlam tespiti için tamamlayıcı, tek floresan kanallı, boya bazlı bir yöntemi de açıklar. MtFagy yöntemi olarak adlandırılan bu yaklaşım, β hücrelerini seçmek, aktif olarak mitofaji geçiren hücre popülasyonlarını ölçmek ve aynı anda mitokondriyal membran potansiyelini (MMP veya Δψm) değerlendirmek için üç hücre geçirgen boyanın bir kombinasyonunu kullanır.

Bu boyalardan ilki, Ex/Em 494/516 nm^13'e sahip hücre geçirgen bir Zn²⁺ göstergesi olan Fluozin-3-'dir. Fare adacıkları, α, β, δ- ve PP hücreleri dahil olmak üzere işlevsel olarak farklı hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon içerir. β-Hücreleri, fare adacığı içindeki hücrelerin yaklaşık% 80'ini oluşturur ve insülin granülleri^14,15 içindeki yüksek Zn²⁺ konsantrasyonları nedeniyle diğer adacık hücre tiplerinden ayırt edilebilir, bu da β hücrelerinin Fluozin-3-^yüksek popülasyonu olarak tanımlanmasına izin verir. Kimyasal bir bağ yoluyla mitokondri üzerinde hareketsiz hale getirilen ve zayıf floresan yayan pH'a duyarlı bir boya olan MtPhagy boyası da bu protokolde^{kullanılmaktadır 16}. Mitofaji indüksiyonu üzerine, hasarlı mitokondri asidik lizozoma dahil edilir ve MtFagy boyası, düşük pH ortamında (Ex/Em 561/570-700 nm) floresan yoğunluğunu arttırır.

Ek olarak, MMP'yi değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) kullanılır. TMRE, membran potansiyeli 17 tarafından desteklenen nispi negatif yük nedeniyle sağlıklı mitokondri tarafından tutulan, hücre geçirgen pozitif yüklü bir boyadır (Ex/Em^552/575 nm). Hasarlı veya sağlıksız mitokondri, membran potansiyellerini dağıtır ve bu da TMRE'yi ayırma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu boyalar birlikte kullanıldığında, mitofajiye uğrayan β hücreleri, akış sitometrisi yoluyla Fluozin^yüksekMtFaji^yüksekTMRE^düşük popülasyonu olarak tanımlanabilir. Mitofaji statik bir süreçten ziyade dinamik bir süreç olduğundan, bu protokol, MMP^18'in dağılmasını takiben mitofajiyi indükleyen bir K⁺-iyonofor olan valinomisin kullanılarak mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Valinomisin varlığında ve yokluğunda mitofajinin karşılaştırılması, farklı örneklem gruplarında mitofaji akısının değerlendirilmesine olanak tanır.

Mevcut yaklaşımın boya bazlı doğası, insan adacıklarına ve diğer transfekte edilmesi zor hücre tiplerine tahmin edilmesine izin verir ve mt-Keima protokolünün aksine karmaşık hayvan yetiştirme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu protokolün genel amacı, iki bağımsız akış sitometrisi tabanlı yöntemle tek hücre düzeyinde β hücrelerde mitofajiyi ölçmektir. Birlikte ele alındığında, bu protokol, mitokondriyal kalite kontrolünün kantitatif çalışmasında hem kesinlik hem de esneklik sağlayan iki güçlü ve tamamlayıcı yöntemi açıklar.

Bu protokolde sunulan hayvan çalışmaları, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için 15 haftalık düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD) kullanan yirmi haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.

1. Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 1)

1. Fare adacığı hazırlama ve tedavi
   1. Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
      1. Daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD,% 60 kcal%^{Yağ 19}) farelerinden adacıkları izole edin ^2,10.
      2. 100 ünite/mL antimikotik-antibiyotik, 50 ünite/mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş RPMI ortamında gece boyunca 37 °C'de kültür adacık örnekleri (bkz. Bu ortam "adacık ortamı" olarak anılacaktır.
      3. Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamında 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin.
         NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: boyanmamış RFD adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış RFD adacıkları; (4) Sadece MtFaji kontrolü: MtFaji ile boyanmış RFD adacıkları; (5) Sadece TMRE kontrolü: TMRE ile boyanmış RFD adacıkları; (6) RFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (7) Valinomisine maruz kalan RFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (8) HFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları; (9) Valinomisine maruz kalan HFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları.
      4. Valinomisin'e maruz kalan (7) ve (9) koşullar için (yukarıdaki NOT'a bakınız), mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nΜ valinomisin stoğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   2. Tek hücre ayrışması gerçekleştirin.
      1. 3 saat valinomisin maruziyetinden sonra, bir pipet kullanarak her koşuldan 100 adacığı ayrı mikrosantrifüj tüplerine seçin.
      2. Adacıkları 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da döndürün ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
      3. Numuneleri 2 kez 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile, her yıkama arasında sıkma adımlarıyla (350 x g / 1 dk, 10 ° C) yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.
      4. Adacıkları tek hücrelere ayırmak için, adacıkların aşırı sindirimini önlemek için bir numunenin mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.05 tripsin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin. Adacıklar gözle görülür şekilde dağılana kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.
      5. Tripsini nötralize etmek için hemen 1 mL önceden ısıtılmış adacık ortamı ekleyin. Her numune için tripsinizasyon ve nötralizasyonu teker teker tekrarlayın.
      6. Numuneleri 500 x g'da 10 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
         NOT: Valinomisin'e maruz kalan numuneler için pelet hassas olacaktır.
      7. Numuneleri 2x RPMI ortamıyla, fenol kırmızısı olmadan, 100 birim / mL antimikotik-antibiyotik, 50 birim / mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve% 10 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş yıkayın. Bu ortam "adacık akış ortamı" olarak anılacaktır. Her yıkama arasında sıkma adımlarını (350 x g/1 dk, 10 °C) ekleyin. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.
   3. Akış sitometrisine hazırlanmak için hücreleri MtFagy, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.
      1. Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      2. MtPhagy boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM MtFaji stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (koşullar 4, 6, 7, 8 ve 9, adım 1.1.1'e NOT).
      3. TMRE boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM TMRE stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (koşullar 5, 6, 7, 8 ve 9).
      4. Fluozin-3-boyası alan tüplere (koşullar 3, 6, 7, 8 ve 9) 0.25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
      5. Vorteks tüpleri 5 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.
      6. Işıktan korumak için mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun yarısında, vorteks tüplerini 5-10 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.
      7. İnkübasyondan sonra, numuneleri 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın.
      8. Numuneleri 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. 2, 6, 7, 8 ve 9 koşullarına 0,2 μg/mL DAPI (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
      9. Numuneleri 350 x g'da 10 °C'de 1 dakika döndürün. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      10. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.
2. Akış sitometrisi
   1. Cihazı başlatın (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) MtFagy boyası için BL2: Uyarma/Emisyon - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) TMRE için YL1: Uyarma/Emisyon - 561 nm/585 nm (16 nm).
   2. Hücre popülasyonlarının dağılım grafiğinin merkezinde olduğundan emin olmak için ileri (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını ayarlayın. Bu protokol için kullanılan voltajlar, hücrelerin FSC-A vs. içinde eşit şekilde düşmesini sağlamak için FSC için 120 V ve SSC için 260 V idi. SSC-A grafiği (Şekil 1A).
   3. Tek olmayan hücreleri hariç tutmak için, FSC-H vs. FSC-W ve ardından SSC-H vs. SSC-W (Şekil 1B,C).
   4. Canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI'nin voltajlarını ve kompanzasyonunu ayarlayın. Boyanmamış RFD örneğine dayalı olarak kullanılan her florofor için floresan kapıları ayarlayın (Şekil 1D-F).
      NOT: Her kanal için kullanılan voltajlar: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
   5. Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın.
      NOT: Bu geçit yaklaşımı kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal koşullar altında ve valinomisin indüksiyonu üzerine mitofaji seviyeleri değerlendirildi (Şekil 2).
   6. Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.

2. Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 2)

1. Fare adacık hazırlığı ve tek hücreli ayrışma
   1. Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
      1. Pankreas adacıklarını vahşi tip (WT) ve mt-Keima/+ (mt-Keima) farelerinden izole edin⁶. Bu yöntemde 20 haftalık erkek WT veya mt-Keima/+ ile beslenen RFD fareler kullanıldı.
      2. Kültür adacık örnekleri, adacık ortamında 37 °C'de gece boyunca alınır.
      3. Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamı olan 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin.
         NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: Boyanmamış WT adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış WT adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış WT adacıkları; (4) mt-Keima sadece kontrol: Boyanmamış mt-Keima/+ adacıkları; (5) Tedavi edilmemiş: Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış mt-Keima/+ adacıkları; (6) Valinomisin: mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan ve Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış adacıklar.
      4. Valinomisin maruziyeti olan durum (6) için, mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nM valinomisin stoğu ekleyin.
   2. Tek hücreli ayrışma gerçekleştirin.
      1. Adım 1.1.2'de açıklandığı gibi tek hücreli ayrışma adımlarını gerçekleştirin.
   3. Hücreleri Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.
      1. Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      2. Fluozin-3-boyası alan tüplere 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ekleyin (koşullar 3, 5 ve 6).
      3. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve 1.1.3.5-1.3.10 adımlarında açıklandığı gibi DAPI tedavisine devam edin.
2. Akış sitometrisi
   1. Enstrümanı başlatın. Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır.
      NOT: Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) mt-Keima nötr için VL3: Uyarma/Emisyon - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) mt-Keima asidi için YL2: Uyarma / Emisyon - 561 nm / 620 nm (15 nm).
   2. FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın ve 1.2.2-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi tek olmayan hücreleri hariç tutun (Şekil 3A-C).
   3. Floresan pozitif hücre popülasyonlarının boyanmamış hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için boyanmamış ve tek pozitif kontroller (koşullar 1-4) kullanarak DAPI, Fluozin-3-ve mt-Keima için voltajları ve kompanzasyonları ayarlayın. Her kanala uygun kompanzasyon uygulandıktan sonra, canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI negatif kapısı ve Fluozin-3-pozitif kapıları ayarlayın (Şekil 3D-E).
   4. Asidik ve nötr hücre popülasyonlarını tanımlamak için mt-Keima pozitif örneğini (koşul 4) kullanarak bir üçgen geçit şeması oluşturun (Şekil 3F).
      NOT: CilttagHer kanal için tipik olarak kullanılır: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
   5. Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. Koşullar 5 ve 6 için geçit şemaları Şekil 3A-G'de gösterilmiştir.
   6. Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.

Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi
Bu boya bazlı yaklaşım, ölü hücreleri dışlamak için DAPI'nin yanı sıra Fluozin-3-, TMRE ve MtPhagy kullanılarak, genetik bir raportöre ihtiyaç duymadan birincil fare β hücrelerindeki mitofaji akışını analiz etmek için optimize edilmiştir. Bu protokol, mitofajiyi indüklemek için bu boyaları valinomisin ile eşleştirerek, birincil fare β hücrelerinde mitofaji akısını seçici olarak ölçmek için boya bazlı bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir18. Bu MtFagy yöntemi kullanılarak gösterilen veriler için, metabolik stresin mitofaji akısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyetten (HFD,% 60 kcal% Yağ) izole edilen adacıklarda hem bazal hem de valinomisin kaynaklı mitofaji analiz edildi. İlgilenilen popülasyonu tanımlamak için, hücreler işlenmemiş RFD adacıkları kullanılarak kapılandı. FSC ve SSC voltajları ilk olarak bir SSC-A ve FSC-A grafiği üzerinde hücrelerin eşit dağılımını elde etmek için ayarlandı (Şekil 1A). Tek hücreleri seçmek için, hem FSC-H hem de FSC-W ve SSC-H ile karşılaştırıldığında. Tek hücrelere kıyasla daha yüksek genişlik sinyal değerleri nedeniyle çoğulların hariç tutulduğu SSC-W grafikleri kullanıldı (Şekil 1B,C). Daha sonra, ölü hücreleri20 dışlamak için DAPI-negatif hücreler seçildi (Şekil 1D). Birincil kapılar kurulduktan sonra, Fluozin-3-, MtFaji ve TMRE (Şekil 1E-G) için floresan kapıları ve çok renkli floresan akış sitometrisi için kompanzasyon kontrolleri oluşturmak için tek lekeli kontroller kullanıldı.

Bu primer ve floresan kapılar kurulduktan sonra, mitofaji kullanımı yüksek olan β hücreleri, valinomisin maruziyeti olmadan RFD kullanılarak kadran 3'te (Q3) FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlandı (Şekil 1H). Bu geçit stratejisi kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal ve valinomisin ile indüklenen mitofaji seviyeleri karakterize edildi (Şekil 2). Mitofaji akısını ölçmek için, bazal vs. Valinomisin ile indüklenen mitofaji düzeyleri aşağıdaki oran kullanılarak karşılaştırıldı:

Bu oran kullanılarak, mitofaji akısı ölçüldü ve RFD ile karşılaştırıldı. Obezite ve periferik insülin direncinin indüksiyonunu takiben mitofajideki farklılıkları değerlendirmek için HFD β hücreleri. RFD'de mitofaji akısının ölçülmesi vs. HFD örnekleri Şekil 2E'de gösterilmektedir. Bu sonuç, basit bir boya bazlı yaklaşım kullanarak β hücrelerinde mitofajiyi ölçmek için bu testin fizibilitesini vurgulamaktadır. Bu yöntem aynı zamanda insan adacıklarında, transfekte edilmesi zor hücrelerde ve mt-Keima transgenik modeline geçişin hantal olacağı karmaşık genetik modellerden izole edilen adacıklarda da kullanılabilir.

Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi
Mt-Keima, iç mitokondriyal membrana hedeflenmesini sağlayan bir Cox8 lokalizasyon dizisi ile kaynaşmış bir çift uyarma floresan proteinidir. mt-Keima'nın çift modlu floresan özelliği, hücre içi bölmenin6 pH'ına bağlı olarak uyarma spektrumlarını nötrden (405 nm) asidik (561 nm) dalga boyuna geçirmesine izin verir. Bu, asidik-nötr oranındaki bir artışın mitofaji indüksiyonunu gösterdiği mitofajinin sağlam bir oransal floresan analizini sağlar. Bu protokolde, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerini seçmek için Fluozin-3-de kullanıldı. Bu temsili çalışmalarda, mitofaji akısı, RFD diyeti ile beslenen farelerden izole edilen adacıklar kullanılarak değerlendirildi10,11. FSC ve SSC voltajları ilk olarak bir SSC-A vs. FSC-A grafiği (Şekil 3A). Tek hücreleri seçmek için, hem FSC-H hem de FSC-W ve SSC-H ile karşılaştırıldığında. Tek hücrelere kıyasla daha yüksek genişlik sinyal değerleri nedeniyle multipletlerin hariç tutulduğu SSC-W grafikleri kullanıldı (Şekil 3B,C). DAPI ve Fluozin-3-için voltaj ve geçit stratejisi, tek lekeli adacıklar kullanılarak belirlendi (Şekil 3D,E). Asidik ve nötr popülasyonlar için üçgen kapılar daha sonra valinomisin maruziyeti olmadan mt-Keima pozitif numunesi kullanılarak tanımlandı (Şekil 3F).

Bu primer ve floresan kapılar kurulduktan sonra, mt-Keima floresansında bazal ve valinomisin kaynaklı değişiklikler kullanılarak mitofaji akısı değerlendirildi (Şekil 3F, G). Mitofaji akısını ölçmek için, bazal mitofaji vs. Valinomisin ile indüklenen seviyeler aşağıdaki oran kullanılarak karşılaştırıldı:

Bu oran kullanılarak, RFD hücrelerinde mitofaji akısı ölçüldü. Bu sonucun niceliği Şekil 3H'de gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu sonuçlar MtPhagy yaklaşımı kullanılarak oluşturulan RFD adacıklarındaki sonuçlarla karşılaştırılabilir (Şekil 3H).

Şekil 1: MtPhagy yöntemi için geçit şeması. (A) Tüm hücreler için seçilecek geçit şemasını gösteren akış grafiği. (B) FSC-H vs. FSC-W ve (C) SSC-H ve SSC-W'yi seçin. (D) Ölü hücreleri dışlamak için DAPI negatif hücreler için geçit. (E) β hücreli için seçilecek Fluozin-3-yüksek hücreleri için geçit. (F) MtPhagyyüksek ve MtPhagydüşük hücre popülasyonlarını tanımlamak için MtPhagy boyası için geçit şeması. (G) TMREyüksek ve TMREdüşük hücre popülasyonlarını tanımlamak için TMRE için geçit şeması. (H) Çeyrek 3'teki (Q3) FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücrelerini mitofajiye uğrayan β hücreler olarak tanımlamak için işlenmemiş RFD adacıkları ile oluşturulan çeyrek geçit şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MtPhagy geçit şeması kullanılarak metabolik stresi takiben fare β hücrelerindeki mitofaji akı farklılıklarının değerlendirilmesi. (A) tedavi edilmemiş RFD β hücreleri, (B) işlenmemiş HFD β hücreleri, (C) valinomisine maruz RFD β hücreleri ve (D) valinomisine maruz kalan HFD β hücrelerinin temsili akış sitometrisi grafikleri. (E) Hem RFD hem de HFD numuneleri için valinomisine maruz kalan MtFajiyüksekTMREdüşük hücrelerinin, valinomisine maruz kalmayan MtPhagyyüksekTMREdüşük hücrelerine oranı kullanılarak hesaplanan β hücrelerinde mitofaji akısının miktarının belirlenmesi. *p < 0.05 Student'ın eşleştirilmemiş t-testi ile. n = 3/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: mt-Keima yöntemi için geçit şeması ve her iki yöntem arasındaki karşılaştırma. (A) Tüm hücreler için seçilecek geçit şemasını gösteren akış grafiği. (B) FSC-H vs. FSC-W ve (C) SSC-H ve SSC-W'yi seçin. (D) Ölü hücreleri dışlamak için DAPI negatif hücreler için geçit. (E) β hücreli için seçilecek Fluozin-3-yüksek hücreleri için geçit. (F) mt-Keima/+ işlenmemiş hücrelerin ve (G) mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan hücrelerin temsili akış sitometrisi grafikleri. (H) RFD ile beslenen farelerden alınan β hücrelerinde mitofaji akısının miktarının belirlenmesi, valinomisine maruz kalan asidik / nötr hücrelerin mt-Keima yöntemi kullanılarak valinomisine maruz kalmayan asidik / nötr hücrelerin oranı kullanılarak hesaplanır ve MtPhagy yöntemiyle karşılaştırılır (orijinal olarak Şekil 2E'de gösterilen MtPhagy protokolü verileri). n = 3/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SAS, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.'den hibe fonu almıştır ve Novo Nordisk'in danışmanıdır.