Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak diatom DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Su Örneklerinden ve Dokulardan Diatom DNA'nın Ekstraksiyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Diatom testi, adli tıp pratiğinde cesedin suda boğulup boğulmadığını belirlemek ve boğulma yerini belirlemek için önemli bir yardımcı araçtır. Diatom testi aynı zamanda çevre ve plankton alanında da önemli bir araştırma içeriğidir. Birincil araştırma nesnesi olarak diatom DNA'ya odaklanan diatom moleküler biyoloji test teknolojisi, yeni bir diatom testi yöntemidir. Diatom DNA ekstraksiyonu, diatom moleküler testinin temelidir. Şu anda, diatom DNA ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan kitler pahalıdır ve bu da ilgili araştırmaları yürütme maliyetini artırmaktadır. Laboratuvarımız genel tam kan genomik DNA hızlı ekstraksiyon kitini geliştirdi ve tatmin edici bir diatom DNA ekstraksiyon etkisi elde etti, böylece ilgili araştırmalar için cam boncuklara dayalı alternatif, ekonomik ve uygun fiyatlı bir DNA ekstraksiyon çözümü sağladı. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen diatom DNA, PCR ve dizileme gibi birçok aşağı akış uygulamasını karşılayabilir.
Giriş
Adli tıp uygulamasında, suda bulunan bir cesedin boğularak mı yoksa öldükten sonra mı suya atıldığının belirlenmesi, davanın doğru çözümlenmesi için esastır1. Aynı zamanda adli tıp uygulamasında acilen çözülmesi gereken zor konulardan biridir2. Diatomlar doğal ortamda (özellikle suda) bol miktarda bulunur3,4. Boğulma sürecinde, hipoksi ve stres tepkisi nedeniyle, insanlar yoğun solunum hareketlerine sahip olacak ve çok miktarda boğulma sıvısını soluyacaklardır. Bu nedenle sudaki diatomlar boğulma sıvısı ile akciğere girer ve bazı diatomlar alveolar-kılcal damar b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Hainan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan doku örnekleri, insan denekleri içeren çalışmalar olarak kabul edilmemektedir. Bu örnekler adli patolojik tanı amacıyla elde edildi ve geri kalanı bu deneyde diatom DNA'nın ekstraksiyonu için kullanıldı. Araştırmacılar, ilgili paydaşlardan bilgilendirilmiş onam almak için bireyleri kolayca tanımlayamazlar.
NOT: Bu deneyde bildirilen araştırma yönteminin genel uygulanabilirliğini sağlamak için, bu deney temel olarak kullanılan kitin kullanım talimatlarını takip etti ve sadece bazı adımlar değiştirildi. Bu deneyde kullanılan su örnekleri, laboratu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şu anda kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemiyle ekstrakte edilen DNA çözeltisi, numunedeki farklı kaynaklardan gelen tüm DNA bileşenlerini içerdiğinden, bu protokolle elde edilen DNA bir istisna değildi. Yani, DNA çözeltisi sadece diatom genomik DNA'nın bir çözeltisi değildi. Diatom 18S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen primerler, literatür 22,23,24'e danışılarak seçilmiştir. Primerler NCBI-Blast Primer tarafından d.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Diatom hücreleri, sert silisli hücre duvarları17 tarafından korunur ve diatom DNA'sını çıkarmak için bu yapının yok edilmesi gerekir. Sıradan kitler, diatomların silisli kabuğunu kolayca tahrip etmez; bu nedenle diatom DNA21'i başarılı bir şekilde çıkarmak zordur. Laboratuvarımız, diatom ekstraksiyonu işleminde farklı çaplarda ve farklı kütle oranlarında cam boncuklar ekleyerek en sık kullanılan kan DNA ekstraksiyon kitini geliştirdi. Vorteks salınımı aynı anda gerçekleştir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| parçalanan hücreleri | B010006022 | Bağlayıcı Tampon | BioTeke |
| KemoHS qPCR Karışımı | Monad | 00007547-120506 | qPCR Karışımı |
| D2000 DNA merdiveni | Gerçek Zamanlar(Pekin) Biyoteknoloji | RTM415 | Elektroforforetik bantların konumunu ölçün |
| D512 | Taihe Biyoteknoloji | TW21109196 | forword astar |
| D978 | Taihe Biyoteknoloji | TW21109197 | ters astar |
| Elüsyon tamponu | BioTeke | B010006022 | Düşük tuzlu bir elüsyon tamponu DNA'yı yıkar |
| Cam boncuk | Yingxu Chemical Machinery (Şangay) | 70181000 | Dispersiyon ve öğütme için özel cam boncuklar |
| İçe aktarma adsorpsiyon kolonu | BioTeke | B2008006022 | Silika matris membranlı adsorpsiyon kolonu |
| İnhibitör Kaldırma Tamponu | BioTeke | B010006022 | DNA Ekstraksiyonunda İnhibitörlerin Uzaklaştırılması |
| İzopropanol | BioTeke | B010006022 | DNA'yı çökeltin veya izole |
| MIX-30S Mini Mikser | Miulab | MUC881206 | etkisi |
| Proteinaz K | BioTeke | B010006022 | Hücre içi nükleazların ve diğer proteinlerin inaktivasyonu |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | gerçek zamanlı floresan miktar tayini PCR |
| Hızı Mikro Santrifüj | Scilogex | 9013001121 | santrifüj |
| Tanon 3500R Jel Görüntüleyici | Tanon | 16T5553R-455 | jel görüntüleme |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo | Cycler Zhuhai Hema | VRB020A | sıradan PCR |
| Yıkama Tamponu | BioTeke | B010006022 | Hücre metabolitleri gibi safsızlıkları giderin |
Kaynaklar
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
