Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

20 yılı aşkın bir geçmişe sahip olan tiramin sinyal amplifikasyonu (TSA), hedef antijenlerin yüksek yoğunluklu in situ etiketlemesi için yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanan bir test teknikleri sınıfıdır ve enzime bağlı immünosorbent testlerinde (ELISA'lar), in situ hibridizasyon (ISH), immünohistokimya (IHC) ve biyolojik antijenlerin saptanması için diğer tekniklerde yaygın olarak uygulanır. algılanan sinyalin hassasiyetini önemli ölçüde artırmak¹. TSA teknolojisine dayalı opal polikromatik boyama yakın zamanda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır^2,3,4,5. Geleneksel immünofloresan (IF) boyama, araştırmacılara çeşitli model organizmaların hücre ve dokularındaki protein dağılımının tespiti ve karşılaştırılması için kolay bir araç sağlar. Antikor/antijene özgü bağlanmaya dayanır ve doğrudan ve dolaylı yaklaşımları içerir⁶. Doğrudan immün boyama, bir floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan floresan tespitini sağlayan, ilgilenilen antijene karşı florofor konjuge primer antikorun kullanılmasını içerir. Dolaylı immün boyama yaklaşımı, konjuge olmayan primer antikora karşı floroforla konjuge sekonder antikorun^{uygulanmasını} içerir ^6,7.

Geleneksel, tek etiketli, immünofloresan boyama yöntemleri, dokularda yalnızca bir, iki veya bazı durumlarda üç antijeni boyayabilir, bu da doku kesitlerinde bulunan zengin bilgilerin madenciliğinde önemli bir sınırlamadır. Kantitatif sonuçların yorumlanması genellikle görsel gözleme ve ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla doğru nicelemeye bağlıdır. Antikor tür kısıtlaması, zayıf floresan etiket sinyalleri ve floresan boya rengi örtüşmesi gibi teknik sınırlamalar vardır (Tablo 1). Opal multipleks IHC (mIHC) tekniği, primer antikorun orijini üzerinde herhangi bir kısıtlama olmaksızın, aynı doku kesitinde 7-9'dan fazla antijenin multipleks boyanmasına ve diferansiyel etiketlenmesine izin veren, ancak antijene karşı karşılık gelen antikorun yüksek özgüllüğünü gerektiren TSA türevine dayanır. Boyama prosedürü, iki fark dışında normal immünofloresan boyamaya benzer: her boyama turu sadece bir antikorun kullanımını içerir ve bir antikor elüsyon adımı eklenir. Antijene kovalent olmayan bağlarla bağlanan antikorlar, mikrodalga elüsyonu ile uzaklaştırılabilir, ancak antijenin yüzeyine kovalent bağlarla bağlanan TSA floresan sinyali korunur.

Boya ile etiketlenmiş aktif tiramin (T) molekülleri, hedef antijende yüksek oranda zenginleştirilir ve floresan sinyalinin verimli bir şekilde amplifikasyonuna izin verir. Bu, antikor müdahalesi olmadan antijenin doğrudan etiketlenmesine izin verir ve daha sonra çoklu boyama döngülerinden^{sonra çok} renkli etiketleme elde edilebilir ^8,9,10 (Şekil 1). Bu teknoloji, hastalığın incelenmesi için güvenilir ve doğru görüntüler üretse de, yararlı bir multipleks floresan immünohistokimya (mfIHC) boyama stratejisinin oluşturulması, kapsamlı optimizasyon ve tasarım ihtiyacı nedeniyle zaman alıcı ve titiz olabilir. Bu nedenle, bu multipleks panel protokolü, manuel protokolden daha kısa boyama süresine sahip otomatik bir IHC boyayıcıda optimize edilmiştir. Bu yaklaşım, insan formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü (FFPE) doku örnekleri üzerinde immüno-onkoloji çalışmaları için herhangi bir araştırmacı tarafından doğrudan uygulanabilir ve uyarlanabilir¹¹. Ayrıca, slayt hazırlama, antikor optimizasyonu ve multipleks tasarım yöntemleri, yerinde doğru hücresel etkileşimleri temsil eden sağlam görüntülerin elde edilmesinde ve manuel analiz için optimizasyon süresinin kısaltılmasında yardımcı olacaktır¹².

mfIHC temel olarak görüntü toplama ve veri analizini içerir. Görüntü elde etme açısından, çeşitli karışık renk sinyallerini tanımlamak ve doku otofloresansından etkilenmeden yüksek sinyal-gürültü görüntüleri elde etmek için çok renkli etiketli karmaşık lekeli numunelerin profesyonel spektral görüntüleme ekipmanı ile tespit edilmesi gerekir. Spektral görüntüleme için mevcut ekipman esas olarak spektral konfokal mikroskopları ve multispektral doku görüntüleme sistemlerini içerir. Multispektral doku görüntüleme sistemi, doku kesitlerinin kantitatif analizi için tasarlanmış profesyonel bir görüntüleme sistemidir ve en önemli özelliği, biyolojik doku örneklerinin hem morfolojik yapısını hem de optik haritalama bilgilerini sağlayan görüntü spektral bilgilerinin elde edilmesidir^13,14. Spektral görüntüdeki herhangi bir piksel, tam bir spektral eğri içerir ve her boya (otofloresan dahil), karışık ve üst üste binen çok etiketli sinyallerin tam olarak kaydedilmesini ve doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlayan karşılık gelen karakteristik spektruma sahiptir.

Veri analizi açısından, çok renkli etiketli numuneler, doku numunelerinin morfolojik yapısı ve kurucu hücreleri nedeniyle son derece karmaşıktır. Sıradan yazılımlar farklı doku tiplerini otomatik olarak tanımlayamaz. Bu nedenle, belirli bölgelerdeki antijen ekspresyonunun kantitatif analizi için akıllı kantitatif doku analiz yazılımı^kullanılır 15,16,17,18.

Her şeyden önce, multispektral görüntüleme ve kantitatif patoloji analiz teknolojisi ile kaynaştırılmış çok etiketli immünofloresan boyama, çok sayıda tespit hedefi, etkili boyama ve doğru analiz avantajlarına sahiptir ve bu nedenle histomorfolojik analizin doğruluğunu önemli ölçüde artırabilir, hücresel düzeyde çözünürlüğe sahip proteinler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkarabilir ve doku kesiti örneklerinden daha zengin ve daha güvenilir bilgilerin çıkarılmasına yardımcı olabilir¹⁹ (Tablo 1).

Protokol, Çin'deki Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Etik Komitesi'nin yönergeleri tarafından onaylanmıştır. Akciğer kanseri doku örnekleri, Batı Çin Hastanesi Akciğer Kanseri Merkezi'ndeki ameliyat sırasında alındı ve her hastadan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Doku kesiti hazırlığı

1. FFPE hazırlama
   1. Klinik dokuları 72 saatten fazla nötr formalin çözeltisine daldırın.
   2. Ksilen ve dereceli alkollü çözeltiler kullanarak dokuları kurutmak işlemini tamamlayın²⁰.
   3. 4 μm kesit kalınlığında manuel parafin gömme ve doku kesiti gerçekleştirin. Doku dilimlerinin düşmemesini sağlamak için yapışma mikroskobu slaytları kullanın.
   4. Slaytları 65 °C'deki fırında 2 saat pişirerek kağıt mendil ve slaytların kurumasını sağlayın. Oda sıcaklığında bir slayt kutusunda saklayın.
2. Doku kesiti ön tedavisi
   1. Doku slaytlarını 65 ° C'de 5 dakika boyunca bir fırında ön işleme tabi tutun ve ardından sırayla 2 x 15 dakika ksilen çözeltilerine, 2 x 15 dakika susuz etanol çözeltilerine, 10 dakika boyunca% 90 etanol çözeltisine, 10 dakika boyunca% 85 etanol çözeltisine, 10 dakika boyunca% 80 etanol çözeltisine ve 10 dakika boyunca% 75 etanol çözeltisine daldırın, ardından slaytları 3 x 1 dakika sterilize su ile yıkayın.
      NOT: Bu deneysel teknik, donmuş veya taze doku için değil, yalnızca FFPE dokusu için kullanılabilir, çünkü çoklu yüksek sıcaklık antijen onarım işlemi dokunun slayttan düşmesine neden olur.

2. Primer antikorun optimizasyonu

NOT: Esas olarak antikor konsantrasyonu ve antijen onarım koşulları dahil olmak üzere, bireysel antikorlar için inkübasyon koşullarını belirlemek için geleneksel IHC deneyleri kullanılmıştır. Antikor kullanım kılavuzundaki koşullara bakın.

1. Önerilen konsantrasyon aralığından ve ara değerlerden biraz daha yüksek bir antikor konsantrasyonu kullanın.
2. Protein ekspresyonunun konumuna göre PH6 ve PH9 antijen alma tampon rutinlerini optimize edin. Çekirdekte eksprese edilen proteinler için PH9 kullanın ve diğer proteinler için rutin (PH6 veya PH9) kullanın.

3. mIHC boyama yöntemi

NOT: Opal mIHC boyama, mevcut mIHC yöntemlerinden biridir. Bu deneysel 5 renkli protokolde, her doku örneğinin dört antikor ile boyanması gerektiğinden, dört primer antikor inkübasyonu, sekonder antikor inkübasyonu ve TSA sinyal amplifikasyonu kromojenik inkübasyonlarının yanı sıra beş antijen restorasyonuna ihtiyaç vardır. Son olarak, 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama ve anti-floresan patlama maddesi sızdırmazlığı gerçekleştirilir.

1. Ana reaktif hazırlama
   NOT: Doku slaytlarının boyutuna göre eklenecek reaktif miktarını belirleyin. Doku bölümünü tamamen kaplayacak kadar hacim kullanın (genellikle slayt başına 50-150 μL). Deney için gerekli çalışma çözümleri şu şekilde hazırlanır:
   1. Yıkama tamponu çalışma solüsyonu: 20x Yıkama tamponunu 1:20'de çift damıtılmış suyla seyreltin ve oda sıcaklığında saklayın.
   2. PH6 tampon çalışma çözeltisi: 100x PH6 tamponunu 1:100'de çift damıtılmış su ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   3. PH9 tampon çalışma çözeltisi: 50x PH9 tamponunu 1:50'de çift damıtılmış su ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   4. Polimer HRP: Bu kullanıma hazır çözeltiyi yalnızca tavşan ve fare kökenli primer antikorlar için hazırlayın.
   5. Florofor çalışma çözeltisi: Her bir florofor tozunu (florofor 780 hariç) 75 μL DMSO içinde sulandırın. Her prosedürden önce, floroforu 1x amplifikasyon seyrelticisinde 1:100'de seyreltin. Florofor çalışma solüsyonunun kullanılmayan kısımlarını atın.
   6. Florofor 780 Çalışma Çözeltisi: TSA-DIG'yi 75 μL DMSO'da ve florofor tozu 780'i 300 μL çift damıtılmış suda sulandırın. İşlemden önce, TSA-DIG'yi 1x amplifikasyon seyrelticisinde 1:100'de seyreltin ve florofor 780'i 1:25'te Ab seyreltici ile seyreltin.
   7. DAPI çalışma solüsyonu: DAPI solüsyonunu 1:50'de çift damıtılmış su veya PBS ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve 4 °C'de 48 saatten fazla saklamayın.
      NOT. Bu çok etiketli floresan boyama deneyi boyunca slaytları yalnızca çift damıtılmış su ve yeni hazırlanmış yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile yıkayın. Doku kesitleri musluk suyu ile temas etmemelidir; Musluk suyundaki kirleticiler doku bölümlerine yapışabilir ve otofloresansa neden olabilir. Deney boyunca numuneleri ışıktan uzak tutun.
2. Antijen alımı
   1. Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna yerleştirin ve PH6 veya PH9 tampon çalışma solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın.
      NOT: Dilimlerin kurumasına neden olabilecek aşırı buharlaşmayı önlemek için ısıtma işlemi sırasında tamir kutusuna çift damıtılmış su ekleyin.
   2. Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika).
   3. Slaytları 3 x 2 dakika çift damıtılmış suyla yıkayın. Slayttaki doku bölümünü çevrelemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
3. Engelleme
   1. Doku bölümlerini yıkama tamponuna daldırın, bloke edici solüsyonla örtün ve slaytları oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 10 dakika inkübe edin.
4. Primer antikor inkübasyonu
   1. Blokaj solüsyonunu slaytlardan çıkarın ve doku bölümlerini birincil antikor çalışma solüsyonu ile örtün. Slaytları nemlendirilmiş bir odada inkübatörde 37 °C'de 1 saat veya buzdolabında 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Slaytların kurumasına izin vermeyin.
5. Polimer HRP'nin Tanıtımı
   1. Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonunda 3 x 2 dakika yıkayın. Polimer HRP'yi doğrudan doku bölümlerine damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Buzdolabında saklanan slaytlar için, birincil antikoru çıkarmak için yıkamadan önce yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
6. Tiramin sinyal amplifikasyonu (TSA) üretimi
   1. Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın, florofor çalışma solüsyonunu doğrudan doku bölümlerine damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın.
7. Florofor 780 için özel prosedür
   NOT: Fluorophore 780 zayıftır ve tüm deneyin renk eşleştirme şemasında rutin olarak en son sıraya yerleştirilir. Fluorophore 780 normalde bu deneysel protokolde kullanılmaz, ancak özgüllüğü nedeniyle deneysel adımları listelenmiştir.
   1. TSA-DIG'nin Tanıtımı
      1. Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın, doku bölümlerine damla damla TSA-Drg çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   2. Mikrodalga tedavisi
      1. Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın.
      2. Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna yerleştirin, tamir solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın. Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika).
      3. Slaytları 3 x 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
   3. Fluorophore 780 sinyal üretimi
      1. Bölümleri yıkama tamponuna daldırın, florofor 780 çalışma solüsyonu ile kaplayın ve slaytları oda sıcaklığında 1 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
      2. Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın.
         NOT: Bu adımdan sonra mikrodalga tedavisi YAPMAYIN.
   4. Tüm iş akışının son adımı olarak florofor 780'i kullanın ve ardından çekirdekleri doğrudan DAPI çalışma çözümü ile boyayın.
      NOT: Florofor 780 kullanmıyorsanız adım 3.7'yi atlayın.
8. Mikrodalga tedavisi
   NOT: Bu mikrodalga adımı, birincil-ikincil HRP kompleksini sıyırır ve antijenleri yeniden açığa çıkararak bir sonraki birincil antikorun eklenmesine izin verir.
   1. Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna koyun, PH6 veya PH9 tampon çalışma solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın.
   2. Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika). Slaytları 3 x 1 dakika çift damıtılmış suyla yıkayın.
   3. Slaytları 2 dakika boyunca yıkama tamponu çalışma solüsyonuna batırın. Bir sonraki antikor inkübasyonunu gerçekleştirin.
9. Sonraki antikor inkübasyonu
   1. 3.2-3.8 adımlarını tekrarlayın (adım 3.7 hariç).
10. Hücre nükleer boyama ve doku sızdırmazlığı
    1. Doku bölümlerini DAPI çalışma solüsyonu ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Slaytları 3 x 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    2. Slaytlardan su damlacıklarını çıkarın, her slayta 10-20 μL anti-floresan söndürücü ekleyin ve slaytları bir mikroskop kapak camı ile kapatın.
    3. Bitmiş slaytları 4 °C'de, ışıktan koruyarak 1 aydan fazla saklayın.
       NOT: Hava kabarcıklarından kaçınmaya dikkat edin.

4. Negatif kontrolü ayarlayın

1. Negatif kontrol slaytlarını, doku içeren slaytlar gibi, ancak filmi tararken doku otofloresansını gidermek için kullanılan birincil antikorlar, ikincil antikorlar, TSA reaktifleri ve DAPI gibi reaktifler eklenmeden işleyin.

5. Doku slaytlarının tam otomatik taranması

NOT: Spektral görüntüleme için kullanılan ekipman, tam otomatik bir multispektral doku miktar tayin analizörüdür ve 5 renkli slaytların görüntüleme ve analiz görselleştirmesi, referans verilen sistem kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz. Sistem, çoklu floroforların ve doku otofloresansının kantitatif olarak karıştırılması için multispektral görüntüleme kullanır.

1. Her floresan kanalı için pozlama süresini ve tarama programını manuel olarak ayarlayın ve cihazın doku slaytlarının tam otomatik pozlamasını ve taramasını tamamladığını onaylayın.
   NOT: Slayt yüzeyi temiz ve su filmi içermemelidir. Kapatıcı miktarına dikkat edin: çok fazla lamel kaymasına ve cihazın bir hata bildirmesine neden olur.

6. Floresan analizi

1. Yazılıma çift tıklayın (Malzeme Tablosuna bakın), orijinal taramadan elde edilen çok renkli floresan görüntü dosyasını yazılıma sürükleyin ve görüntü türünü floresan olarak ayarlayın.
2. Parlaklık ve kontrast düğmesini tıklatın ve paneldeki kanalları kontrol edin. İlgilendiğiniz floresan kanalını seçmek için dışını ve ardından kanalı tıklatın. Her kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için Minimum ekran ve Maks ekranı sürükleyin.
3. Analizden sonra, kaydedilecek görünümü belirleyin, bu iki içeriği kaldırmak için Slayta genel bakışı göster ve İmleç konumunu göster'e tıklayın, ölçek çubuğunu tutun ve Dosya | Anlık görüntüyü dışa aktar | Bir png dosyasını dışa aktarmak için geçerli görüntüleyici içeriği.
   NOT: Her floresan kanalı ve birleştirilmiş bir şekil, gelecekteki analizler için dışa aktarılmalıdır.
4. Hedef hücre pozitifliğinin daha fazla analizi için, hücre tanımlama ve segmentasyon yazılımı^21'i kullanın (bkz.

CD8 primer antikoru ve floroforların eşleşme şemasını optimize ettik. Her iki floresan sonucu seti, antikor uyumlu florofordaki değişiklik dışında, deney grubundaki tam olarak aynı antikor inkübasyon koşullarına karşılık geldi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CD8+ T hücrelerinin florofor 480 ve florofor 690 ile kanal eşleşmesinde önemli bir fark vardı. Florofor 690 içeren kanal son derece güçlü bir floresan arka plan gösterir - sarı daire içindeki geniş kırmızı düzensiz floresan alanı renk gösterir, bu da CD8 + T hücrelerinin lokalizasyon analizinde büyük parazite neden olur (Şekil 2C, D). Bununla birlikte, florofor 480'li kanal çok spesifik bir CD8 hücre zarı pozitifliği gösterir ve floresan arka planı yoktur. Bu nedenle, sarı daireler çok net bir pozitif hücre zarı gösterir (Şekil 2A), bu protokolde antikor ve floresan kanal eşleşmesinin önemini tam olarak gösterir.

Küçük hücreli dışı akciğer skuamöz karsinom dokularında makrofajların ve sitotoksik T hücrelerinin dağılımı incelendi ve tümör hücrelerinde ve immün hücrelerde karakteristik protein HMGCS1'in ekspresyonu doğrulandı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, görüntüler QuPath 0.3.2'den türetilmiştir. mIHC paneli floroforlar 480, 520, 620, 690 ve DAPI idi ve karşılık gelen antikor belirteçleri, akciğer skuamöz karsinom hücreleri için bir belirteç olan CK5 / 6 idi; T hücreleri için bir belirteç olan CD8; Makrofajlar için bir belirteç olan CD68; ve plazma pozitif tümör hücrelerine özgü HMGCS1. Makrofajlar ve CD8+ T hücreleri ağır infiltrasyon gösterdi ve skuamöz karsinom odakları etrafında ve içinde dağılırken, HMGCS1 skuamöz karsinom hücre plazmasında yaygın olarak eksprese edildi ve güçlü tümör hücresi pozitifliği gösterdi.

Şekil 1: FFPE dokusu için multipleks immünohistokimyasal boyamanın iş akışı. Kısaltma: FFPE = formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CD8 ve floroforlar için eşleştirme protokollerinin optimizasyonu. CD8+ T hücrelerinin florofor 480 ve florofor 690 ile kanal eşleşmesinde anlamlı bir fark vardı. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Akciğer skuamöz karsinomunda çoğullanmış immünohistokimyasal boyama. Küçük hücreli dışı akciğer skuamöz karsinom dokularında makrofajların ve sitotoksik T hücrelerinin dağılımı ve karakteristik protein HMGCS1'in tümör hücrelerinde ve immün hücrelerde ekspresyonu. CK5/6, akciğer skuamöz karsinom hücreleri için bir belirteçtir; CD8, T hücreleri için bir belirteçtir; CD68 makrofajlar için bir belirteçtir; ve HMGCS1, tümör hücresi plazma pozitif hücrelere özgüdür. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Opal çok etiketli immünofloresan teknolojisi ile geleneksel immünofloresan teknolojisi arasındaki karşılaştırma.

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.