Bu protokol, oleik asit ve Cutibacterium acnes ile sıçan derisinde akne iltihabını indükleme prosedürünü özetlemektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bileşik Akne Bir Sıçan Modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Akne vulgaris, yüz, boyun ve göğüste komedon, papül ve püstüllerin varlığı ile karakterize yaygın bir kronik cilt rahatsızlığıdır. Akne vulgaris iltihabını simüle etmek için, bu protokol, oleik asit ve Cutibacterium acnes (C. acnes) kullanarak sıçan kulaklarında akne iltihabını indükleyerek bir bileşik akne kemirgen modeli oluşturma yaklaşımını detaylandırır. Sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı: normal kontrol grubu (NC), oleik asit grubu (OA) ile tedavi edilen kulaklar, C. acnes grubu ile tedavi edilen kulaklar (C. acnes), oleik asit ile tedavi edilen kulaklar ve C. acnes (OA + C. acnes). Aşırı sebum üretimini taklit etmek için, OA ve OA + C. acnes gruplarındaki sıçanların kulaklarına 25 gün boyunca oleik asit sürüldü.
21 ila 25. günler arasında, C. acnes süspansiyonu, akne iltihabını şiddetlendirmek için C. acnes ve OA + C. acnes gruplarındaki sıçanların kulaklarına intradermal olarak enjekte edildi. Kulak kalınlığı, inflamasyon şiddetinin bir göstergesi olarak haftalık olarak ölçüldü. Brüt gözlem, hematoksilen ve eozin boyaması ve immünohistokimya (IHC) yapıldı ve sonuçlar, OA grubunun ve OA + C. acnes grubunun kulaklarının kalınlaştığını ve sertleştiğini, buna eritem ve komedon varlığının eşlik ettiğini gösterdi. Ayrıca C. acnes ve OA + C. acnes gruplarında papüller gözlendi. Histopatolojide OA ve OA + C. acnes gruplarında kıl foliküllerinde hiperkeratinizasyon ve genişlemiş infundibulum izlendi. C. acnes ve OA + C. acnes gruplarının dermisinde inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu ve apseler bulundu. IHC sonuçları, C. acnes ve OA + C. acnes gruplarının dermisinde artmış tümör nekroz faktörü (TNF)-α seviyelerini doğruladı. Yukarıdaki tüm sonuçlar toplu olarak bileşik akne kemirgen modelinin başarılı bir şekilde kurulduğunu göstermiştir.
Giriş
Akne vulgaris, yüz, boyun ve göğüste komedonlar, papüller ve püstüllerin varlığı ile karakterize yaygın bir kronik cilt hastalığıdır ve ciddi vakalarda nodüllere, kistlere ve kalıcı yara izlerine ilerleyebilir1. Epidemiyolojik çalışmalar, aknenin küresel nüfusun %9,4'ünü etkilediğini ve bunun sonucunda ortaya çıkan semptomların ciddi fiziksel ve psikososyal zorluklar doğurduğunu bildirmektedir 2,3.
Akne patogenezi dört kritik süreç dahil olmak üzere çok faktörlüdür: aşırı sebum üretimi, komedon oluşumu, cilt mikrobiyotası ile foliküler kolonizasyon ve pilosebase ünite 4,5 çevresinde inflamatuar mediatörlerin salınması. Aşırı doymamış serbest yağ asitlerinin (UFFA'lar) birikmesine neden olan artan sebum salgısı, genomik çalışmalarda gösterildiği gibi biri Cutibacterium acnes olan cilt mikrobiyotasının anormal üremesine katkıda bulunur6. Bu sırada cilt mikrobiyotası sebumu ayrıştırır ve UFFA konsantrasyonunu artırarak bir kısır döngüye yol açar7. Ek olarak, aşırı UFFA'lar saç foliküllerinde hiperkeratinizasyona neden olur ve bu da akneyi tetikler8. Cilt mikrobiyotası ve artan sebum, interlökin (IL)-1 ve TNF-α 9,10 gibi çoklu proinflamatuar sitokinler üretmek için Toll benzeri reseptörleri (TLR'ler) aktive eder. Bu iltihaplanma çağlayanı, artan sebum ve mikrobiyal aşırı büyüme ile birleştiğinde, saç folikülünün belirgin hiperkeratozu ve akne11'in başlangıcı ile sonuçlanır.
Akne araştırmaları ve ilgili klinik gereksinimler alanındaki hızlı gelişme, sıçan kulağında, sıçanların veya farelerin sırtlarında ve tavşan kulağında bir dizi akne iltihabı hayvan modelinin oluşturulmasına yol açmıştır 12,13,14,15. Yöntemler, C'nin intradermal enjeksiyonunu içerir. Akneler, yağ bezlerinin anormal salgılanmasını ve hiperkeratinleşmeyi simüle etmek için cilt üzerine yağların uygulanması veya cilt iltihabını akne oluşturmak üzere hızlandırmak için her ikisinin bir kombinasyonu 16,17,18,19. Bununla birlikte, kimyasal ajanların ve biyolojik ajanların kullanımı ve dozu, uygun bir akne modeli oluşturmak isteyen araştırmacıların kafasını karıştırabilecek önceki çalışmalar arasında farklılık göstermektedir. Bu çalışma, bileşik bir akne kemirgen modeli oluşturmak için kullanımı kolay ve etkili bir yöntem oluşturmayı ve akne vulgaris üzerinde çalışan araştırmacılar için bir model referans sağlamayı amaçlamıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nden etik onay almıştır (No.2023033103-1183). Bu protokolde on iki erkek Sprague-Dawley sıçanı (ağırlık, 208 g ± 5 g) kullanıldı ve dört gruba ayrıldı: NC grubu (n = 3), OA grubu (n = 3), C. acnes grubu (n = 3) ve OA + C. acnes grubu (n = 3).
1. Akne modelinin geliştirilmesi
- Modellemeden önce elektronik sürmeli bir kumpas (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak sıçan kulaklarının kalınlığını ölçün ve kaydedin.
- Elektronik sürmeli kumpasın dış çenesini kulağın dış kenarının orta noktasına yerleştirin ve kulak kanalına uzatın. Çizgi boyunca 2/3 noktanın kalınlığını ve 1/2 noktanın kalınlığını kaydedin. Her noktayı 3x ölçün ve kulak kalınlığı olarak kabul edilecek iki noktanın kalınlığının ortalama değerlerini hesaplayın.
- Sıçanın başını bir tarafa eğin, kulağı yukarı bakacak şekilde yapın ve 50 μL oleik asit uygulayın (Malzeme Tablosuna bakınız) kulağın ventral ve dorsal taraflarına, 25 gün boyunca günde bir kez eşit şekilde.
- 21. günden 25. güne kadar, oleik asit uygulamasından günlük olarak,% 4 izofluran kullanarak sıçanları uyuşturun ve daha sonra 50 μL 1 × 107 CFU C. acnes süspansiyonu enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu) 34 G veya 36 G iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak kulağın ventral yüzeyine intradermal olarak (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: İntradermal olarak enjekte ederken kulaktaki kan damarlarından kaçınmaya dikkat edin. 34 G veya 36 G iğneli bir mikro şırınga gereklidir (Malzeme Tablosuna bakınız). Uygun intradermal enjeksiyonu sağlamak için, iğne yaklaşık 1 mm derinlikte 10 ila 15 derecelik bir açıyla delinmelidir. - 25. günde, adım 1.1'de açıklandığı gibi kulakların kalınlığını ölçün ve kaydedin.
NOT: OA grubu, adım 1.2'de tarif edildiği gibi sadece oleik asit ile lekelendi ve 21. günden 25. güne kadar salin enjekte edildi. C. acnes grubu, adım 1.3'te tarif edildiği gibi sadece C. acnes süspansiyonu ile intradermal olarak enjekte edildi. OA + C. acnes grubu, adım 1.2 ve 1.3'te tarif edildiği gibi oleik asit ve C. acnes süspansiyonu ile tedavi edildi.
2. Doku toplama ve analizi
- 26. günde, fareler kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanılarak insancıl bir şekilde ötenazi yapıldıktan sonra, 8 mm'lik bir halka matkapla iki taraflı kulaklara sabit boyutta delin.
- Kulak dokularını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehite batırın, ardından parafin gömün ve hematoksilen ve eozin (HE) boyaması için 5 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayırın20. Kesitleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve bir patolog tarafından takip değerlendirmesi için patolojik değişiklikleri kaydedin. Patolojik değişikliklere Tablo 1'e göre skorlar atayınız (ayrıca bakınız Şekil 1).
- Antijen alımı için bölümleri deparafinize edin, yeniden sulandırın ve ısıtın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca metanol içinde% 0.3H2O2ile inkübe ederek endojen peroksidazları inaktive edin.
- Bölümleri fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3 BSA ile inkübe edin.
- Bölümleri TNF-α monoklonal antikoru (seyreltme 1:800) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bölümleri tekrar PBS ile yıkayın ve yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikoru ile 50 dakika inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Başka bir PBS yıkamasından sonra, slaytlara 3,3'-diaminobenzidin (DAB) karışımı uygulayın ve boyama işlemini mikroskop altında izleyin, istenen yoğunluğa ulaşıldığında PBS ile reaksiyonu durdurun.
- Bölümleri 1 dakika boyunca Meyer'in hematoksilen ile boyayın, akan su ile durulayın ve bölümleri kurutun ve monte edin. Kesitleri mikroskop altında gözlemleyin ve bir patolog tarafından takip değerlendirmesi için patolojik değişiklikleri kaydedin.
3. İstatistiksel analiz
- İstatistiksel analiz yapın.
- Verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun. Shapro-Wilke testini kullanarak tüm verilerin normalliğine erişin. Normal bir dağılım izliyorsa, önemli farklılıkları değerlendirmek için tek yönlü ANOVA kullanın. Normal dağılımlı olmayan veriler için, Kruskal-Wallis testini ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırmalarını uygulayın. 0,05'ten küçük bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kalınlık ve cilt görünümü
7. günden 21. güne kadar, OA grubundaki ve OA + C. acnes grubundaki kulaklar, NC ve C. acnes gruplarından önemli ölçüde daha kalındı. 25. günde, OA grubu, C. acnes grubu ve OA + C. acnes grubundaki kulaklar, NC grubundan anlamlı olarak daha kalındı (p < 0.05). Deney sırasında kulakların ortalama kalınlığı Şekil 2 ve Tablo 2'de gösterilmiştir.
7. günden 25...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir akne modeli için metodoloji ve değerlendirme kriterleri net olmadığından, bu protokol akne üzerine çalışan araştırmacılar için bir referans sağlamayı amaçlamıştır. Fare kulağının küçük boyutu ve sırtta büyüyen tüylerin neden olduğu girişim, tüy dökücü krem ve tıraş makinesi kullanımı nedeniyle, sıçanın kulağı bir kemirgen akne modeli oluşturmak için daha iyi bir alternatif olabilir. Sıçanların arka derisinde sivilce modelini oluşturmaya çalıştık, ancak etki sıçan kulağında gözlemlene...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81974572 ve No.82274523) ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi (No.202310026002) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anaaero göstergesi | Mitsubishi, Japonya | C-22 | |
| AnaeroPack | Mitsubishi, Japonya | C-11, C-41 | |
| Columbia kan agar plakası | BeNa Cuture Koleksiyonu, Çin | BNCC330605 | |
| Sabit sıcaklık inkübatörü | SHANGCHENG, Çin | 303-0 | |
| Pamuklu çubuk | HYNAUT, China | _ | |
| Cutibacterium acnes | BeNa Cuture Koleksiyonu, Çin | BNCC330605 | |
| Dako REAL EnVision Algılama Sistemi, Peroksidaz/DAB+, Tavşan/Fare | DAKO, Danimarka | K5007 | |
| tek kullanımlık steril enjeksiyon iğnesi | Zhejiang Oujian Tıbbi Cihaz, Çin | _ | |
| Elektronik ölçek | JINXUAN, Çin | A017 | |
| Elektronik sürmeli kumpas | Şarküteri, Çin | DL90150 | |
| Oleik asit (Analitik reaktif, AR) | Fangzheng, Çin | _ | |
| Sodyum klorür enjeksiyonu | CR Çift VİNÇ, Çin | Y2212241 | |
| SPSS İstatistik | IBM, ABD | 26.0 | |
| steril hipodermik şırıngalar | Shandong weigao grubu tıbbi polimer, Çin | _ | |
| TNF Alfa Monoklonal antikor | Proteintech Grubu, int, AMERİKA BİRZE DEVLETLERİ | 60291-1-lg |
Kaynaklar
- Cooper, A. J., Harris, V. R. Modern management of acne. The Medical Journal of Australia. 206 (1), 41-45 (2017).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), London, England. 2163-2196 (2012).
- Layton, A. M., Thiboutot, D., Tan, J. Reviewing the global burden of acne: how could we improve care to reduce the burden. The British Journal of Dermatology. 184 (2), 219-225 (2021).
- Hazarika, N. Acne vulgaris: new evidence in pathogenesis and future modalities of treatment. Journal of Dermatological Treatment. 32 (3), 277-285 (2021).
- Das, S., Reynolds, R. V. Recent advances in acne pathogenesis: implications for therapy. American Journal of Clinical Dermatology. 15 (6), 479-488 (2014).
- Dréno, B., et al. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) and acne vulgaris: a brief look at the latest updates. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV. 32, Suppl 2 5-14 (2018).
- Marples, R. R., Downing, D. T., Kligman, A. M. Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes. The Journal of Investigative Dermatology. 56 (2), 127-131 (1971).
- Katsuta, Y., Iida, T., Hasegawa, K., Inomata, S., Denda, M. Function of oleic acid on epidermal barrier and calcium influx into keratinocytes is associated with N-methyl D-aspartate-type glutamate receptors. The British Journal of Dermatology. 160 (1), 69-74 (2009).
- Kurokawa, I., et al. New developments in our understanding of acne pathogenesis and treatment. Experimental Dermatology. 18 (10), 821-832 (2009).
- Clayton, R. W., et al. Homeostasis of the sebaceous gland and mechanisms of acne pathogenesis. The British Journal of Dermatology. 181 (4), 677-690 (2019).
- Cong, T. X., et al. From pathogenesis of acne vulgaris to anti-acne agents. Archives of dermatological research. 311 (5), 337-349 (2019).
- Ji, J., et al. Analgesic and anti-inflammatory effects and mechanism of action of borneol on photodynamic therapy of acne. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103329(2020).
- Ou-Yang, X. L., et al. Nontargeted metabolomics to characterize the effects of isotretinoin on skin metabolism in rabbit with acne. Frontiers in Pharmacology. 13, 963472(2022).
- Zhu, Z., et al. Skin microbiome reconstruction and lipid metabolism profile alteration reveal the treatment mechanism of Cryptotanshinone in the acne rat. Phytomedicine. 101, 154101(2022).
- Jang, Y. H., et al. HR-1 mice: A new inflammatory acne mouse model. Annals of Dermatology. 27 (3), 257-264 (2015).
- De Young, L. M., Young, J. M., Ballaron, S. J., Spires, D. A., Puhvel, S. M. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. The Journal of Investigative Dermatology. 83 (5), 394-398 (1984).
- Chen, T., et al. A skin lipidomics study reveals the therapeutic effects of Tanshinones in a rat model of acne. Frontiers in Pharmacology. 12, 675659(2021).
- Cao, J., Xu, M., Zhu, L., Xiao, S. Viaminate ameliorates Propionibacterium acnes-induced acne via inhibition of the TLR2/NF-κB and MAPK pathways in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 396 (7), 1487-1500 (2023).
- Kolar, S. L., et al. Propionibacterium acnes-induced immunopathology correlates with health and disease association. JCI insight. 4 (5), e124687(2019).
- Zhong, C., et al. Inhibition of protein glycosylation is a novel pro-angiogenic strategy that acts via activation of stress pathways. Nature Communications. 11 (1), 6330(2020).
- O'Neill, A. M., Gallo, R. L. Host-microbiome interactions and recent progress into understanding the biology of acne vulgaris. Microbiome. 6 (1), 177(2018).
- Moradi Tuchayi, S., et al. Acne vulgaris. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15029(2015).
- American Academy of Dermatology. American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity. Journal of the American Academy of Dermatology. 20 (2), Pt 1 272-277 (1989).
- Katsambas, A. D., Cunliffe, W. J., Zoubolis, C. C. Clinical aspects of acne vulgaris. Pathogenesis and treatment of acne and rosacea. Zouboulis, C. C., Katsambas, A. D., Kligman, A. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 213-221 (2014).
- Williams, H. C., Dellavalle, R. P., Garner, S. Acne vulgaris. Lancet. 379 (9813), London, England. 361-372 (2012).
- Rocha, M. A., Bagatin, E. Skin barrier and microbiome in acne. Archives of Dermatological Research. 310 (3), 181-185 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
