Burada, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim protokolünü açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Hücreli Dizileme için Fare Karotis Arterlerinden Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Karotis arterler, boyundaki beyne kan ve oksijen sağlayan ana kan damarlarıdır, ancak karotis arterleri plak tarafından tıkandığında karotis darlığı meydana gelir. Karotis arterin hücresel bileşiminin tek hücre düzeyinde ortaya çıkarılması, karotis aterosklerozunun tedavisi için esastır. Bununla birlikte, karotis arterlerden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Normal karotis arterlerin tek hücre düzeyinde hücrelere daha az zarar vererek ayrışması için uygun bir protokol elde etmek için, kollajenaz/DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre ederek iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, her karotis arter hücresinde hücre başına ortalama ~ 2500 transkript tespit edildi. Özellikle, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere normal karotis arterin çeşitli hücre tipleri aynı anda tespit edilebilirdi. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer dokulardan kan damarlarının tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için uygulanabilir.
Giriş
Ateroskleroz, yüksek tansiyon, hiperlipidemi ve hemodinamik gibi risk faktörleriyle ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır1. Karotis arter bifurkasyonları hemodinamik değişikliklere eğilimlidir ve karotis plak oluşumuna yol açar. Karotis aterosklerozunun klinik prezentasyonu inme ve geçici serebral iskemi gibi akut veya tekrarlayan geçici serebral iskemi ve vasküler demans gibi kronik olabilir2. Mekanik olarak karotis plak, patolojik koşullar altında farklı damar duvarı hücreleri ve çeşitli kan hücreleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullar altında karotis damarlarının tek hücreli atlasının ortaya çıkarılması, karotis plak gelişiminin önlenmesi ve tedavisi için özellikle önemlidir.
Tek hücreli RNA dizilimi, ultra yüksek çözünürlüğü ve aynı hücre tipi organizmalardan hücre heterojenliğinin tespiti nedeniyle biyolojik araştırmaların en güçlü teknolojilerinden biridir 3,4. Araştırmacılar, kardiyovasküler hastalık5 ve kanser6 gibi birçok alanda araştırma yapmak için tek hücreli RNA dizilimini kullandılar. Bununla birlikte, dokuları hızlı ve doğru bir şekilde tek hücrelere ayırmak hala ana zorluklardan biridir. Enzimatik ayrışma, baskın olarak kollajenaz, papain, tripsin, DNaz ve hyaluronidaz içeren yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Spesifik olarak, kollajenazlar, tek hücreli sindirim için ana enzim türleridir ve esas olarak bağ dokularındaki kollajen bileşenlerini hidrolize eder. Meme bezi7, glomerulus8, iridokorneal açı9, diz eklemi10, aort11 ve akciğer12 gibi farklı dokuların ayrışması için farklı kollajenaz tipleri uygulanabilir. Farklı dokuların benzersiz fizyolojik özellikleri nedeniyle, aynı yöntemi kullanarak ayrışma, düşük hücre canlılığı, düşük hücre sayısı ve büyük hücre kalıntıları gibi tek hücrelerin elde edilmesinde birçok soruna neden olabilir. Bu nedenle, farklı dokular için sindirim yöntemlerinin icadı, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için gereklidir.
Bu protokol, vahşi tip farelerin karotis arterinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Karotis arterin özelliklerine göre, fare karotis arterinin yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için kollajenaz / DNazı tripsin ile birleştirdik çünkü kollajenaz, tripsin tarafından daha fazla sindirilen karotis dokularının kollajenini hidrolize edebilir. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere dört hücre tipi tanımlandı. Bu protokolün avantajları şunlardır: 1) karotis arterdeki çoklu hücre tipleri tanımlanabilir, 2) hücre canlılığı iyi korunur ve 3) özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilir. Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli multiomiklerini incelemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer kan damarlarının ayrışmasında da yardımcı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktifler ve malzeme hazırlama
- Perfüzyon çözeltisini hazırlamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS ve 2.5 U / mL heparin sodyum tuzu kullanın. 4 °C'de saklayın ve kullanıldığında buz üzerinde ön soğutun.
- 1250 CDU/mL kollajenaz II ve 3000 U/mL DNaz I'i HBSS ile seyrelterek 125 CDU/mL kollajenaz II ve 60 U/mL DNaz I içeren ayrışma reaktifi A'yı hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- 1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini (fenol kırmızısı olmadan) 1 mL 1x PBS'ye seyrelterek %0.12 tripsin nihai konsantrasyonu içeren ayrışma reaktifi B'yi hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- 1x PBS'de 10 mL% 1.5 FBS ve% 10 mL% 5 FBS hazırlayın. Karotis arterleri havuzlamak için% 1.5 FBS kullanın ve kullanmadan önce buz üzerinde tutun. Sindirimi nötralize etmek ve oda sıcaklığında (RT) saklamak için% 5 FBS kullanın.
- 1 mL şırıngalar, 26-G iğneli 20 mL şırıngalar, altı oyuklu hücre kültürü plakaları, 1.5 mL santrifüj tüpleri, 40 μm steril hücre süzgeçleri ve buz kapları dahil olmak üzere deneysel materyalleri edinin.
2. Ekipman hazırlığı
- Stereoskopik mikroskop, diseksiyon makası, mikro diseksiyon makası ve ince uçlu forseps dahil tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.
- Otomatik hücre sayacını açın ve RT'de tutun.
- Su banyosunu önceden 37 °C'ye getirin.
- Kullanmadan önce mikrosantrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.
3. Fare karotis arterinin izolasyonu
- İntraperitoneal enjeksiyonla (vücut ağırlığının her 10 g'ı için 0,24 mL) %1,25 tribromoetanol kullanarak fareyi uyuşturun ve 3 dakika sonra düzeltme refleksi olup olmadığını kontrol etmek için fareyi çevirin. Ardından, fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve sırt üstü yatırın. Farenin cildine %75 alkol püskürtün.
- Cildi açmak ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için sterilize diseksiyon makası kullanın. Diyaframı keserek açın.
- Alt çeneye doğru yukarı doğru kesmeye devam edin ve karotis arteri açığa çıkararak fazla bağ dokularını ve yağı dikkatlice çıkarın.
- Kapalı dolaşımdan kan akışını sağlamak için farenin inferior vena kavasını kesin.
- Sol ventriküle 20 mL önceden soğutulmuş perfüzyon solüsyonunu bir şırınga ile yavaşça ve sürekli olarak enjekte edin.
NOT: Perfüzyon başarılı olursa, karaciğer, dalak ve böbrekler gibi kandan zengin organlar gri-beyaza döner. - Karotis arter çevresindeki tüm yağ ve bağ dokularını stereoskopik mikroskop altında mikro diseksiyon makası ile soyun.
NOT: Karotis arterin zarar görmesini önlemek için bu adım yavaş ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. - Karotis arteri fareden izole edin, kanı tekrar yıkamak için 1x PBS ile yıkayın ve buz üzerinde% 1.5 FBS içeren altı oyuklu plakalara aktarın.
4. Karotis arterin tek hücreli süspansiyona sindirilmesi
- Karotis arteri uzunlamasına incelemek için mikro diseksiyon makası kullanın ve buz üzerinde 1 mL% 1.5 FBS içeren başka bir 6 oyuklu hücre kültürü plakasına düz bir şekilde koyun.
- Kalan kanı çıkarmak için intimayı %1,5 FBS ile dikkatlice yıkayın.
NOT: Endotel hücrelerine zarar vermemek için yıkama nazik ve yavaş olmalıdır. - Her karotis arteri %1.5 FBS'de mikrodiseksiyon makası kullanarak yaklaşık 2mm'lik 2 doku parçalarına kesin.
- Bu doku parçalarını 1 mL genişliğinde delikli uçlara sahip 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, dokuları dibe batırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve dokuları 500 μL ayrışma reaktifi A içinde yeniden süspanse edin.
- Tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Her 10 dakikada bir 1 mL'lik bir pipetle nazikçe pipetleyin.
- Tüpe 500 μL %5 FBS ekleyin ve 1 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir steril hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne süzün ve 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 200 μL ayrışma reaktifi B içinde yeniden süspanse edin.
- 37 °C'lik bir su banyosuna koyun ve 5 dakika daha sindirin. Tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışmak için sindirim sırasında her 2 dakikada bir hafifçe pipetleyin.
- Sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için 200 μL %5 FBS kullanın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini buz üzerinde 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyon muayenesi ve tek hücreli RNA dizilimi
- 10 μL tek hücreli süspansiyona 10 μL AO / PI çözeltisi ekleyin ve 20 μL'lik bir pipetle hafifçe karıştırın.
- Karışımdan 20 μL'yi hazneye pipetleyin ve 1 dakika bekleyin.
- Slaytı otomatik hücre sayacı cihazına yükleyin.
- AO/PI Canlılık testini seçin, ardından kalite raporunu bekleyin.
- Tek hücreli bir kontrolörde emülsiyonda tek hücreli jel boncuklar oluşturmak için tek hücreli bir 3ʹ reaktif kiti kullanın ve barkodlu cDNA'yı üreticinin protokolüne göre bir termal döngüleyicide çoğaltın.
NOT: Burada Chromium Single Cell 3ʹReaktif Kitleri v3 kullanılmıştır. - Eşleştirilmiş uçlu 150 bp (PE150) okuma stratejisine sahip bir sıralayıcıda sıralama gerçekleştirin. Ham temel çağrı dosyalarını mkfastq ardışık düzenini kullanarak fastq dosyalarına dönüştürmek için bir yazılım uygulaması (Cell Ranger) kullanın. Ardından, özellik barkod matrisleri13 oluşturmak için hizalama, filtreleme, barkod sayımı ve benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayımı gerçekleştirmek için Cell Ranger'ın Sayım İşlem Hattını kullanın.
- R paketi Seurat14 ile veri boyutsallığını azaltma ve görselleştirme gerçekleştirin.
- İlk olarak, Seurat'ın Read10X() işlevi, Cell Ranger ardışık düzeninin çıktısını okur ve ardından bir Seurat nesnesi oluşturmak için sayı matrisini kullanır. Ardından, <200 veya >4000 gen ekspresyonu veya Seurat'ın subset() fonksiyonu ile %10'dan fazla mitokondriyal gen oranı olan hücreleri filtreleyin.
- Verileri normalleştirmek ve sırasıyla 2000 yüksek değişkenli özelliği tanımlamak için NormalizeData () ve FindVariableFeatures() kullanın .
- Ölçeklendirilmiş veriler üzerinde temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin ve hücreleri karartma = 30 ve çözünürlük = 0,5 ile kümeleyin. Son olarak, tek hücreli veri kümelerini görselleştirmek için RunUMAP () işlevini ve her bir küme biyobelirtecini bulmak için FindAllMarkers() işlevini kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemini açıklar (Şekil 1). Bu iki aşamalı hücre sindirim yöntemi, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek üzere fare karotis vasküler duvarını etkili bir şekilde ayırmak için kollajenaz/DNazı tripsin ile birleştirir. Ayrışmadan sonra, hücre konsantrasyonu ve hücre canlılığı otomatik bir hücre sayacı tarafından hesaplandı. Parlak alan, ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, kollajenaz / DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre eden iki aşamalı bir sindirim yönteminin oluşturulduğu vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tek hücreli süspansiyonun kalite kontrolünden sonra, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığını gördük. Ayrıca, tek hücreli veri işlemeden sonra VSMC'ler, fibroblastlar, EC'ler ve Mφ/DC'le...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (82070450'den CT'ye ve 82170466'dan NZ'ye) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'nın (7121102223'den FL'ye) burslarıyla desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 EDTA içermeyen tripsin | Beyotime | C0205 | 1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini 1 mL 1x PBS'ye seyreltin. |
| % 0.9 NaCl salin çözeltisi | Beyotime | ST341 | Heparin sodyum çözeltisini 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin |
| 1 mL şırınga& | nbsp; SKJYLEAN | sk-r009 | Kardiyak perfüzyon yapmak için |
| 1.5 mL santrifüj tüpleri | KIRGEN | KG2211W | Doku parçasını ve hücre süspansiyonunu santrifüjlemek için |
| 20 mL şırınga | SKJYLEAN | sk-r013 | Kardiyak perfüzyon |
| yapmak için 40 & m hücre süzgeci | JETBIOFIL | css010040 | Sindirilmemiş doku parçalarını filtrelemek için |
| AO/PI kiti | Hengrui Biyolojik | RE010212 | Hücrenin canlı mı yoksa ölü mü olduğunu belirlemek için |
| Otomatik hücre sayacı | Countstar | Mira FL | Sindirilmiş karotis vasküler hücrelerin hücre morfolojisini ve hücre canlılığını analiz etmek için |
| Cell Ranger yazılımı | 10 kez; Genomik | 3.0.2 | Krom tek hücreli RNA-seq çıktısını işlemek ve kümeleme ve gen ekspresyon analizi yapmak için |
| Krom Tek Hücreli 3'Reaktif Kitleri v3 | 10& kez; Genomik | 1000075 | Tek hücreli süspansiyonun tek hücreli RNA-seq kitaplıklarını hazırlamak için |
| Kollajenaz II | Sigma-Aldrich | C6885 | HBSS ile 125 CDU/mL nihai konsantrasyona seyreltin |
| Deoksiribonükleaz I | Worthington | LS002140 | HBSS ile 60 U/mL nihai konsantrasyona seyreltin |
| Fetal sığır serumu | HyClone | SH30088.03 | Sindirim reaksiyonunun sonlandırılması |
| Hank'in dengeli tuz çözeltisi | Gibco | 14175095 | Oda sıcaklığında saklayın |
| Heparin sodyum tuzu | Solarbio Life Science | H8060 | % 0.9 NaCl ile 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin |
| Mikrosantrifüj | Thermo Fisher Bilimsel | 75002560 | Dokuları ve hücre peletlerini küçültmek için uygulanır |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Fosfat tamponlu salin | Solarbio Life Science | P1000 | Kardiyak perfüzyon ve hücrelerin yeniden süspansiyonu için kullanılır |
| Seurat paketi- R | Satija Lab | 3.1.2 | scRNA dizileme verilerinin boyutsallığının azaltılması, görselleştirilmesi ve analizi için |
| Altı kuyulu hücre kültürü plakaları | NEST | 703002 | Vasküler dokuyu yerleştirin |
| Su banyosu | Jinghong | DK-S22 | Sindirim sıcaklığını 37 ° C'de tutun; Ç |
Kaynaklar
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
