Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Giriş
İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonuçevreler 1,2. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler3. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamiklerietkiler 4. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir5. Locus coeruleus'tan salınan norepinefrin de dahil olmak üzere çeşitli faktörler, kılcal damarlarda beyin perisit kasılmasına neden olabilir6. Serebral kan akışında düzenleyici bir role sahip olan perisitler, hiperoksi7 sırasında bir oksijen sensörü görevi gören 20-HETE sentezi sergiler. Beyin perisitlerinin oksidatif-nitratif stresle tetiklenen kasılması kılcal damarları zararlı bir şekilde etkiler5. Beyin perisit kasılması ile ilgili hem in vivo hem de ex vivo araştırmalara rağmen8, beyin dilimleri içinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi ile ilgili sınırlı bilgi devam etmektedir.
En önemlisi, beyin perisitlerinin doku fiksasyonu sonrası görüntülemesi, canlılıklarını ve müteakip kasılma değerlendirmesini tehlikeye atar. Ayrıca, nörolojik bozukluklar gibi senaryolarda (ör., subaraknoid kanama - SAK), beyin perisitlerinin transgenik etiketlemesi, ön SAK kaynaklı beyin perisit ölümü çalışmamız9 tarafından onaylandığı gibi, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapamaz.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, canlı perisitleri etiketlemek için TO-PRO-3'ü kullandık, ölenler ise propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Görüntüleme sırasında kesit aktivitesini korurken, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknolojileri kullandık. Bu makale, beyin perisitlerinin SAK sonrası serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkisini araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet ederek, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deney protokolü, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (kmmu20220945). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 300-350 g Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar kullanıldı.
1. SAH modelini indükleme
- Sıçanları% 2 izofluran ve% 100 oksijen kullanarak uyuşturun. İzofluran (%1-%3) ile sürekli inhalasyon anestezisi sağlayarak anesteziyi koruyun. Stereotaksik bir aparat kullanarak farenin kafasını sabitleyin (bkz.
- Aşağıdaki adımları izleyerek SAH modelini oluşturun.
- Suprasellar rezervuarın içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin. Daha sonra, sıçanın kuyruk arterinden (antikoagülan olmadan) bir şırınga pompası kullanarak suprasellar sarnıca otolog kan enjekte edin (bkz.
- Belirtilen koordinatları kullanarak sağ lateral serebral ventriküle bir mikroenjeksiyon iğnesi implante edin: bregma, −0.8 mm; yanal, 1,4 mm; derinlik, 4 mm9. SAK grupları için 0.2 mL sıçan kuyruğu arter kanı enjekte edin. Sahte gruplar için aynı hacimde izotonik salin uygulayın (Şekil 1A).
2. Beyin dilimi hazırlama ve stabilizasyon
- % 2 izofluran inhalasyonu kullanarak sıçanları derinlemesine uyuşturun. Dekapitasyondan sonra, tüm beyinleri çıkarın ve buz gibi yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) daldırın.
NOT: Aşağıdaki bileşime sahip taze hazırlanmış ACSF çözeltileri kullanın: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2 ve 10.11 mM D-Glikoz (Malzeme Tablosuna bakınız). pH'ı 7.3 ile 7.4 arasında tutun. - %5CO2 ve %95O2 ile havalandırılan buz gibi ACSF'de SD sıçanlardan 200 μm kalınlığında akut beyin dilimleri hazırlamak için bir vibratom kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).
- 200 μm kalınlığındaki akut beyin dilimlerini ACSF'ye batırılmış naylon bir ağ üzerindeki bir saklama odasına yerleştirin. ACSF çözeltisini 35-37 °C sıcaklık aralığını koruyarak %95 O2 ve %5CO2 ile dengeleyin. Beyin dilimlerinin 2 saat boyunca stabilize olmasına izin verin ve uyum sağlamaları için zaman tanıyın (Şekil 3).
3. Akut beyin dilimlerindeki perisitlerin TO-PRO-3 ile etiketlenmesi
NOT: Akut beyin dilimlerinden elde edilen perisitler, izleyici TO-PRO-310 kullanılarak floresan olarak etiketlendi.
- Floresan boya TO-PRO-3'ü ACSF'ye ekleyin ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Akut beyin dilimlerini oda sıcaklığında TO-PRO-3 içeren ACSF ile karanlık bir ortamda 20 dakika inkübe edin.
NOT: Koruma için TO-PRO-3'ü tutarken lateks eldiven giymeyi unutmayın. - Beyin dilimlerini taşıyan naylon süzgeci yükleme odasından 6 oyuklu bir plaka durulama odasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Beyin dilimlerinin durulama odasında 10 dakika kalmasına izin verin (Şekil 4D).
NOT: Bu durulama adımı, boyama işlemini sonlandırır, arka plan etiketlemesini azaltır ve spesifik olmayan lekelenmeyi önler. - Preparatları% 5 CO 2 ve% 95 O2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu kullanarak toplam 15 dakika durulayın. Bu durulama adımı, boya alımını durdurur ve arka plan etiketlemesini en aza indirir (Şekil 4C).
4. Akut beyin dilimlerinde serebral mikrosirkülasyonun hayati olmayan perisitlerinin boyanması
- TO-PRO-3 ile önceden yüklenmiş beyin dilimlerini 37 ° C'de Alexa Fluor 488'e (FITC-ISOB4; 5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) konjuge edilmiş izolektin B4 ile karanlık bir ortamda 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beyin dilimlerini ACSF'de 15 dakika durulayın (Şekil 4E).
- Beyin dilimlerini her zamanki gibi %5 CO2 ve% 95 O2 ile gazlanmış ACSF'de inkübe edin. 37 °C'de her iki çözeltiye de 37 μM konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ekleyin. Bu, hayati olmayan beyin perisitlerini etiketleyecektir. Preparatları bu ACSF çözeltisinde karanlıkta 60 dakika inkübe edin (Şekil 4F).
- Ardından, boya alımını durdurmak ve arka plan etiketlemesini en aza indirmek için preparatları ACSF solüsyonlarıyla 15 dakika durulayın.
5. Akut beyin dilimlerinde vital ve vital olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi
- Plastik Pasteur pipetleri kullanarak beyin dilimlerini cam tabanlı konfokal kaplara (Malzeme Tablosuna bakın) nazikçe aktarın. Bulaşıkları daha önce% 5 CO2 ve% 95 O2 ile dengelenmiş ACSF çözeltisi ile doldurun. Sıçan beyin dilimlerini yerine sabitlemek için demir bir ağ kullanın.
- Cam tabanlı konfokal tabakları konfokal mikroskop aşamasına aktarın. Akut beyin dilimini çanağın dibine yerleştirin ve konfokal mikroskopi görüntüleme sırasında %95 O2 ve %5CO2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu ileperfüze edin 9 (Şekil 5A ve Şekil 5Ab').
- Serebral kortikal mikrovaskülatürün duvar hücrelerini 40x objektif kullanarak görselleştirin. Uyumlu yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını yakalayın (bkz. IB4 (uyarma/emisyon 460 nm/520 nm), PI (uyarma/emisyon 545 nm/595 nm) ve TO-PRO-3 (uyarma/emisyon 606 nm/666 nm) için uygun filtreler kullanın (Şekil 5D).
NOT: Aşağıdaki ayrıntılara sahip görüntüler yakalayın: 40× DIC N1 objektif lens, 3 × 12 bit: 512 × 512 piksel (0,22 × 0,22 mm), kalibrasyon: 0,42 μm/piksel. - Serebral mikrovasküler sistemi ve perisitleri ağlarına ve morfolojilerine göre tanımlayın. Her beyin diliminde serebral mikrovasküler ağ içeren belirli bir bölgeyi bulun ve görüntü yakalayın.
- Sonraki çekimlerde tutarlılığı sağlamak için görüntüleme konumunu dikkatlice not edin (Şekil 5B,C). Daha fazla işleme ve analiz için görüntü analiz yazılımı (ImageJ) ve fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın (bkz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Normal fizyolojik koşullar altında, beyin perisitleri genellikle hücre ölümüne uğramazlar. Şekil 6 , hayati beyin perisitlerinin varlığını gösteren sarı ile bu fenomeni göstermektedir; beyin perisitleri, PI ile boyanma göstermez, bu da canlılıklarını gösterir. Hücre ölümünü takiben perisitlerin mikrovaskülatüre bağlı kalıp kalmadığını daha fazla araştırmak için, bir SAK sıçan modelinde yöntemler kullanıldı ve daha sonra görüntüleme yapıldı.
SAK sonrası beyin dilim...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-311 ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB412 ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekrarlanabilir ve işlevsel araştı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81960226,81760223) alınan hibelerle desteklenmiştir; Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045,202301AY070001-011)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6 oyuklu plaka | ABC biyokimya | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Alüminyum folyo | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Konfokal görüntüleme yazılımı | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gaz tankı (%5 CO2, %95 O2) | PENGYIDA | 40L | |
| RT Cam Alt Konfokal Yemekler | Beyotime | FCFC020-10 adet | RT |
| Glikoz | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Tutkal | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Buz makinesi | XUEKE | IMS-20 | |
| RT Görüntü analiz yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüleri | Resim J | RT |
| İnhalasyon anestezi sistemi | BİLİM | QAF700 | RT |
| İzolektin B 4- FITC | SIGMA | L2895 ve ndash; 2MG | Store alikotları &ndash'ta; 20 derece > C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447– 40– 7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647– 14– 5 | RT |
| NaH2PO4· H2O | Sigma-Aldrich | 10049– 21– 5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipeti | NEST Biyoteknoloji | 318314 | RT |
| Peristaltik Pompa | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (İyodür) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Alikotları &ndash'ta saklayın; 20 derece > C |
| Stereotaksik cihaz | BİLİM | QA | RT |
| Şırınga pompası | Harvard POMPA | POMPASI 11 ELITE Nanomite | RT |
| Termostatik su banyosu | OLABO | HH-2 | RT |
| Titreşimli mikrotom | Leica | VT1200 | RT |
Kaynaklar
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
