Yöntem makalesi

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

DOI:

10.3791/65874

⸱

10 Kasım 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Cancer Institute, and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlarda hematopoietik hücre transplantasyonunun karmaşıklığına rağmen, araştırmacılar farelerde yaygın olarak intravenöz veya intrafemoral (IF) enjeksiyonlar gerçekleştirirler. Fare modellerinde bu teknik, nakledilen hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) tohumlama verimliliğini artırmak için uyarlanmıştır. Bu makale, farelerde IF enjeksiyonunun ayrıntılı bir adım adım teknik prosedürünü ve BM'de bulunan hücrelerin seri karakterizasyonuna izin veren farelerde aşağıdaki kemik iliği (BM) aspirasyonunu açıklamaktadır. Bu yöntem, intravenöz enjeksiyonla aşılanması özellikle zor olan düşük hücre sayılarına sahip değerli örneklerin nakledilmesini sağlar. Bu prosedür, patolojik analiz için kritik olan ksenogreftlerin oluşturulmasını kolaylaştırır. Periferik kana (PB) erişmek daha kolay olsa da, PB'nin hücresel bileşimi, HSPC'ler için niş olan BM'yi yansıtmaz. Bu nedenle, hematopoezi incelemek için BM bölmesine erişim sağlayan prosedürler gereklidir. IF enjeksiyonu ve seri BM aspirasyonu, burada tarif edildiği gibi, farelerden ödün vermeden HSPC'ler gibi BM'de zenginleştirilmiş hücrelerin prospektif olarak alınmasına ve karakterizasyonuna izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan sistemi, kemik iliğinde (BM) bulunan hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) tarafından yaşam boyunca korunur1,2. BM ortamındaki dinamik değişiklikleri incelemek için hem normal hem de malign hematopoezinbiyolojisini anlamak önemlidir 3,4. HSC'lerin doğrudan insan BM'sine transplantasyonu, periferik kan (PB) infüzyonundan daha yüksek engraftman sağlar, ancak yüksek prosedür karmaşıklığı ve artan enfeksiyon riski, bu yöntemin standart uygulamanın bir parçası olmasını engeller5. Farelerde, hayvanları feda etmeden BM erişimini kolaylaştıran prosedürler, hematopoezi seri olarak izlemek için bir kaynak sağlar. Tarif edilen prosedür, nakledilen hücrelerin yüksek oranda aşılanmasına sahip fareler üretmeyi ve canlı farelerin BM'sinin seri örneklemesine izin vermeyi amaçlamaktadır. Bu makale, fare-fare allotransplantasyon modellerine göre üretilmesi daha zor olan, insan hücreleri ile aşılanmış immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft modellerinin üretilmesine odaklanacaktır. Hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) kuyruk veya retroorbital ven yoluyla konvansiyonel transplantasyonu ile karşılaştırıldığında, bu prosedürün avantajları düşük miktarda başlangıç materyali ile yüksek hücresel engraftmandır.

Farelerin BM boşluğuna intrafemoral (IF) hücresel enjeksiyon, insan HSPC'lerini in vivo 6,7,8 incelemek için yaygın olarak kullanılsa da, bu tekniği gösteren/filme alan resmi bir adım adım prosedür daha önce yayınlanmamıştır. Bu protokol, az sayıda nakledilen hücreden yüksek aşılama ve BM'yi seri olarak örneklemek için bir mekanizma sağlar. Ayrıca, ilaçların doğrudan BM boşluğuna enjekte edilmesinin kan hastalıklarının tedavisi üzerindeki etkilerini analiz etmek için bu yöntemi kullanmak mümkündür. Burada açıklanan prosedür, fareleri feda etmeden hematopoetik hücrelerin bulunduğu BM'ye erişim sağlanmasına yardımcı olur.

Bu protokol, BM aspirasyonları için kullanılan tekniğebenzer 9. Temel fark, bu makalenin ve beraberindeki video protokolünün, hücrelerin iliğe enjekte edilmesi için güvenli bir prosedürü detaylandırmasıdır, oysa önceki makaleler hücreleri damar yoluyla nakletti ve daha sonra seri BM aspirasyonu gerçekleştirdi. Bu protokol, az sayıda hücre hattı (Şekil 1), normal kordon kanı (CB) kaynaklı HSPC'ler (CD34+) (Şekil 2) ve HSC'ler (CD34+CD38-CD45RA-CD90+) (Şekil 3), normal BM kaynaklı HSPC'ler (CD34+CD38-) (Şekil 4), hasta kaynaklı lösemik kök hücreler (CD34+CD38-) (Şekil 5), CRISPR/Cas9 gen düzenlemeli normal CB türevli HSPC'ler (CD34) ile başarılı bir şekilde aşılanmayı mümkün kılar+) (Şekil 6) ve akut miyeloid lösemi (AML)-iPSC'ler (Şekil 7). Özellikle normal kordon kanı türevli HSC'lerde sadece 10 hücre ile başarılı bir şekilde engraftman yapabilmekteyiz. Bu yöntem, değiştirilmemiş veya gen düzenlemeli birincil insan akut miyeloid lösemi veya CB hücreleri gibi nadir veya üretilmesi zor hücre popülasyonları ile gerçekleştirilen deneyler için özellikle değerlidir. Ayrıca, bu prosedür, aşılanmış hücrelerin seri analizi için etkili bir yöntemi tanımlar ve bu, sonraki deneylerde hemen kullanılabilir. Değerli numunelerin boşa harcanmasını önlemek ve IF enjeksiyonunu sağlamak için, bu tekniği sağlamlaştırmaya yardımcı olmak için burada Akaluc tabanlı prosedür10 uygulamasını da kısaca açıkladık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Altı ila on haftalık erkek veya kadın NOD. Bu protokolde Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri kullanılmıştır, ancak tüm fare türlerine uygulanabilir. Işınlama, deneysel içeriğe ve farelerin türüne bağlıdır, farelerin ışınlanıp ışınlanmayacağı araştırma hedeflerine bağlıdır. Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak yürütülmüştür ve Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvanları Bakımı Yönetim Paneli (APLAC #22264) tarafından onaylanmıştır. Tüm normal kan hücresi popülasyonları taze olarak ayıklandı. İnsan AML örnekleri, kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı protokollere (Stanford IRB, 33818) göre, Stanford Tıp Merkezi'ndeki hastalardan bilgilendirilmiş onam ile elde edildi.

1. Hücre hatlarının, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) veya lösemik kök hücrelerin (LSC'ler) intrafemoral enjeksiyonu

NOT: Enjekte edilen hücreleri bir görüntüleme cihazı ile kolayca analiz etmek için bir Akaluc/tdTomato-pozitif K562 hücre hattı oluşturuldu ve substrat olarak AkaLumine-HCl/Akaluc kullanıldı10. Görüntüleme ekipmanı mevcut değilse, hücreler lentivirus veya PiggyBac ile bir floresan boya ile etiketlenebilir ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Hücre hazırlığının ayrıntılarından bağımsız olarak, kemik iliğine uygulanan hücrelerin BM'ye güvenilir bir şekilde girdiğini kanıtlamanın bir yolunun olması, bu tekniğin geliştirilmesi için önemlidir (Şekil 1).

  1. 20 μL floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS) +% 2 fetal sığır serumu (FBS) + 2 mM EDTA) veya PCR veya 1.5 mL tüplerde Çözülme ortamı (IMDM +% 20 FBS + Kalem / Strep) ile hücre süspansiyonlarını (3 ×10 6 kan hücresine kadar) hazırlayın ve enjeksiyondan önce buz üzerinde tutun.
    NOT: Hücreleri iğne ile askıya alırken hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Kabarcıklar enjeksiyondan hemen önce mümkün olduğunca uzaklaştırılmalıdır, çünkü hava kabarcıkları enjekte etmek farelerin ani ölümüne neden olabilir.
  2. Durum 6-10 haftalık yetişkin fareler, hücrelerin enjeksiyonundan 48 saat öncesine kadar 200 cGy (225 kV, 13.3 mA, toplam 2 Gy [Doz kontrol modu]).
  3. İlk olarak, fareleri bir indüksiyon odasında izofluran inhalasyonu ile uyuşturun ve sabit bir anestezi durumuna ulaşmak için bir burun konisi aracılığıyla 1-2 L / dk'lık bir akış hızında% 100 oksijende% 2 izofluranda tutun. Anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma refleksi ve yavaş, sabit nefes alma ile kontrol edin ve izofluran prosedürü boyunca bu durumu koruyun.
    NOT: Cerrahi manipülasyon ve/veya kulak, ayak parmağı ve kuyruk sıkışması ile kalp ve solunum hızlarında herhangi bir değişiklik olmadığından emin olmak için işlem boyunca her 3-5 dakikada bir anestezi derinliğini izleyin. Mukoza zarının ve derinin rengi, fareler iyi durumdaysa pembemsi olacağından oksijenasyonun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Farenin üzerine opak perdeler yerleştirildiğinde dikkatli olun, çünkü farede neler olduğunu görmek her zaman mümkün olmayabilir.
  4. İşlemden önce, ağrıyı en aza indirmek için farelere deri altından 10 mg / kg carprofen uygulayın ve destekleyici bakım için 0.5-1.0 mL% 0.9 salin ısıtın.
  5. Kornea kurumasını önlemek için farenin gözlerine oftalmik merhem sürün.
  6. İşlem sırasında hipotermiyi önlemek için fareyi bir ısı yastığı veya termostatik olarak kontrol edilen başka bir yüzey üzerinde tutun.
    NOT: İşlemden sonra sıcaklığı ayarlanabilir bir ısıtma yastığı kullanılır. Farenin vücut ısısı tipik olarak 37-39 °C'dir ve ped ideal olarak bundan biraz daha düşük olmalıdır. Uygulamada, sıcaklık genellikle 32-36 °C'ye ayarlanır.
  7. Enjekte edilecek uyluk kemiğini içeren tüm bacağı üç set alternatif fırçalama ile dezenfekte edin (povidon-iyot veya klorheksidin fırçalayın ve% 70 etanole batırılmış gazlı bez süngerleri ile dönüşümlü).
    NOT: 1) Operatör solak ise, farenin sol uyluk kemiğine enjekte etmek sağ uyluk kemiğine göre daha kolay olabilir. 2) Bu çalışmada, gereksiz cilt hasarını önlemek için kürk enjeksiyonlar için çıkarılmadı ve kürk kesilmeden iğne giriş yeri kolayca yerleştirilebilir. Bununla birlikte, koyu kürklü farelerde, delinme bölgesini bulmak zor olabilir, bu durumda, enjeksiyonu başlatmak hızlı ve kolay olduğu için kürkü kesmeyi düşünün.
  8. Bacağı stabilize etmek için uyluk kemiğini başparmak ve işaret parmaklarıyla nazikçe sıkıştırın. Tibiayı femurdan bükük tutmak için tibiayı halka veya beşinci parmağınızla itin. Başarılı enjeksiyon için konumlandırma önemlidir (Ek Şekil S1-S5).
    NOT: Parmakların yaralanmasını önlemek için kemiği sıkıştırmak için forseps kullanın; Bununla birlikte, uyluk kemiğinin şaftını hissetmek zor olabilir ve işleme zaman katacaktır.
  9. İğne femurun iki kondili arasına güvenli bir şekilde yerleştirilecek şekilde patellar tendonun hemen altına bağlı bir şırınga ile boş, steril 27 G iğne (1/2 inç) yerleştirin. İğnenin kenarını kullanın ve iğneyi yerleştirmek için en iyi yeri bulmak için uyluk kemiğinin üstündeki patellar tendonu birkaç kez hafifçe gagalayın (Ek Şekil S1-S5).
    NOT: Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce fare diz bölgesinin anatomisi hakkında bilgi sahibi olmak gereklidir. Yeni başlayanlar, bölgenin anatomisini anlamak için zaman ayırmalı ve canlı bir fare üzerinde denemeden önce prosedürü ötenazi uygulanmış bir fare üzerinde uygulamalıdır.
  10. Femur miline paralel olduğundan emin olmak için iğneyi dışa ve yukarı doğru döndürün.
    NOT: Bu manevra ilik boşluğuna güvenilir bir yol sağlar, femur şaftından ilik içeriğinin alınmasını kolaylaştırır ve prosedürden hayvanın rahatsızlığını en aza indirir.
  11. Femur iliği boşluğuna yavaşça ilerlerken iğneyi daireler halinde çevirin. Dirençte gözle görülür bir azalma olana kadar iğneyi sokun. Şırıngayı yanal olarak hafifçe hareket ettirerek iğnenin doğru yerleştirildiğini onaylayın. Kemiğin dışına çıkan parmaklarla iğnenin kenarına dokunmak mümkünse, adım 1.9'a geri dönün ve iğneyi delmek için başka bir açı ve yer bulun.
    1. İğnenin giriş açısının kemik uç yüzüne dik olduğundan emin olun.
      NOT: Teorik olarak iğne uyluk kemiğine paralel olarak enjekte edilmeli ve kemik uçlarına 90° açıda olmalıdır. İç yüzeyden direnç varsa, iğne femur boşluğuna doğru bir şekilde yerleştirilmiştir. İğnenin kemiğe paralel olduğundan emin olmak için, kemiğin yan tarafına bir ışık yerleştirin ve iğnenin şaftına paralel olarak kemiğin gölgesini gözlemleyin. Kemik iliği boşluğuna girdikten sonra direncin azalması farenin yaşına bağlıdır: fare ne kadar gençse, dirençteki azalmayı tanımak o kadar kolay olur.
  12. İğneyi BM boşluğu içinde ileri geri hareket ettirirken iğne pistonunu nazikçe geri çekerek negatif basınç oluşturun. İğne BM boşluğundaysa, şırıngada bir miktar kan / ilik çıkacaktır.
    1. Kan/ilik görünmüyorsa, yeni bir iğneye geçin ve aynı rotayı bulmaya çalışın.
      NOT: Yeni bir iğneye geçmenin nedeni, kemik iğneyi tıkadığında, kanın/iliğin geri akışını kontrol etmenin zorlaşmasıdır. Kemik iliğine enjekte edilen hücrelerin önceki giriş noktalarından uyluk kemiğinden dışarı sızma potansiyeli olduğundan, BM boşluğuna enjeksiyon yollarının sayısını en aza indirmek çok önemlidir. Birden fazla enjeksiyon yolu gerekliyse, hücrelerin hızlı bir bolus yerine kademeli olarak enjekte edilmesiyle sızıntı riski azaltılabilir.
  13. İğneyi yavaşça çıkarın ve hücre içeren şırıngayı aynı yoldan geçirin. İğneyi durana kadar (BM boşluğunun kenarında) sokmaya çalışın ve hücreleri kolayca enjekte etmek için oradan biraz (1-2 mm) geri çekin. Pistona bastırmadan ve hücreleri serbest bırakmadan önce, hafifçe aspire edin ve iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olmak için kan/ilik olup olmadığını kontrol edin. Önce kanın / iliğin geri akışını kontrol edin ve ardından hücreleri enjekte etmek için şırıngayı yavaşça itin.
    NOTLAR: Yeni bir iğneye geçerken ilk enjeksiyonun rotasını ve açısını hatırlamak çok önemlidir. Aynı rota bulunamazsa, ilk rotayı yapmak için kullanılan orijinal iğne ile tekrar deneyin. Bu sırada yeni bir iğne kullanılabilir, ancak orijinal iğne kullanılıyorsa, sıkışan kemik kullanımdan önce bir kez dışarı itilmelidir. Enjekte etmek için yeni bir yol bulmak için iğneyi hücrelerle birlikte kullanmayın; Aksi takdirde iğneye sıkışan kemik parçaları hücre dağılmasını engelleyebilir. BM boşluğu çok küçük olmasına rağmen, ölü boşluk göz önüne alındığında enjeksiyon hacmi 30 μL'den az olmalıdır.
    1. Şırıngadaki havanın kemik iliğine girmesini önlemek ve hücrelerin delinme bölgesinden sızmasını önlemek için enjeksiyon hızının yavaş olduğundan emin olun. Şırıngayı iterken direnç hissedilirse, boşlukta daha az dirençli bir alan bulmak için iğneyi yukarı ve aşağı hareket ettirin.
  14. Hücreler uyluk kemiğine başarılı bir şekilde enjekte edildikten sonra, şırınga üzerindeki basıncı korurken iğneyi ve şırıngayı fareden çıkarın.
    NOT: Enjeksiyon tamamlanamazsa diğer uyluk kemiği ile tekrar deneyin. İşlem, anestezi altında bile fare için çok streslidir. Her zaman farenin hayati belirtilerini (kalp ve solunum hızı) izleyin ve prosedürü mümkün olan en kısa sürede bitirmeye çalışın.
  15. Fareyi burun konisinden çıkarın ve yatak takımının aspirasyonunu önlemek için temiz bir kağıt havlu üzerine koyun. Kurtarma sırasında, fareyi bir ısıtma yastığı veya termostatik olarak kontrol edilen başka bir yüzey üzerinde tutun. Fare rafına geri yerleştirmeden önce anesteziden iyileşmeyi doğrulamak için tüm fareleri izleyin.
    NOT: Düzgün yapılırsa aspirasyon sonrası herhangi bir komplikasyon veya sıkıntı olmamalıdır. Prosedür, anestezi uygulanmış fareler iyileştiğinde ve yürüyüp yiyecek ve suya ulaşabildiğinde tamamlanacaktır.
  16. Önümüzdeki 24 saat boyunca işlem sonrası fareleri sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından gözlemleyin. Sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri arasında sürekli kanama, anemi ve uyuşukluk bulunur. İşlem sonrası bu belirtilerden herhangi biri görülürse, hayvan işleme protokolüne göre CO2 inhalasyonu veya servikal çıkık ile hayvan(lar)ı ötenazi yapın.

2. FACS analizi için femurdan kemik iliği hücrelerinin aspirasyonu

NOT: BM hücrelerini farelerden aspire etme prosedürü, bölüm 1'de açıklanan yöntemlere çok benzer ve önceki bazı literatürdenöğrenilebilir 9,11,12. Aşağıda, BM enjeksiyonu ve aspirasyon protokolleri arasındaki bazı farklılıklara genel bir bakış yer almaktadır.

  1. BM aspirasyonunu askıya almak için numune başına 500 μL PBS + 10 mM EDTA (hücre süspansiyon ortamı: CSM) hazırlayın.
  2. BM'yi aspire etmeden önce 0,5 mL 27 G'lik bir şırıngayı CSM ile ıslatın. Şırıngayı 200-500 μL CSM ile doldurun ve hemen çıkarın. Bu işlemi 2-3 kez tekrarlayın.
  3. Şırınga üzerindeki pistonu çekerek BM'yi nazikçe aspire edin ve 20-50 μL fare BM'si elde edin. Ardından, iğneyi uyluk kemiğinden tamamen çıkarın ve aspire edilen numuneyi bir sonraki boyama adımı için CSM'de (1,5 mL'lik bir tüpte 500 μL) askıya alın. Fareyi burun konisinden çıkarın ve iyileşme sırasında yatak takımının aspirasyonunu önlemek için temiz bir kağıt havlu üzerine koyun. Fare rafına geri yerleştirmeden önce anesteziden iyileşmeyi doğrulamak için tüm fareleri izleyin.
    NOT: BM aspirasyonu/örneklemesi tekrarlanabilir, ancak aynı bacağa tekrarlanan travmayı önlemek için aynı gün tekrarlanan prosedür karşı uyluk kemiğinde yapılmalıdır. BM aspirasyonunun sıklığı hakkında çok az bilgi olmasına rağmen, deneyimlerimize dayanarak femoral BM aspirasyonunun genellikle 4 haftada bir tekrarlandığına ve herhangi bir sorun olmadan (örneğin enfeksiyon) toplamda en az 3-4 kez yapılabileceğine inanıyoruz. Bununla birlikte, nakledilen kemik iliğinin karşı tarafındaki kemik iliğinin genellikle daha düşük hücresel engraftmana sahip olduğu akılda tutulmalıdır.
  4. Kemik iliğinden elde edilen pelet hücreleri, 300 × g, 4 ° C'de 5 dakikalık bir dönüşle aspire edilir.
  5. Süpernatanı aspire edin, her tüpe 0.5-1 mL ACK lizis tamponu (150 mMNH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için girdap yapın. 5-10 dakika buzun üzerine koyun.
  6. Her tüpü naylon ağdan yeni bir tüpe süzün.
  7. Tüpü 1 mL FACS tamponu ile durulayın ve naylon ağdan yeni bir tüpe ekleyin.
  8. 300 × g, 4 °C'de 5 dakikalık bir dönüşle pelet hücreleri.
  9. Süpernatanı aspire edin ve istenen antikorları13 içeren boyama solüsyonunu ekleyin. 20 dakika buzun üzerine koyun.
  10. Hücreleri yıkayın ve deney düzeneğine göre analiz edin.
    1. Hücreleri FACS tamponu (PBS,% 2 FBS, 2 mM EDTA) ile yıkayın ve toplam 50 μL hacminde buz üzerinde 30 dakika boyunca antikorlarla boyayın. Hücreleri analizden veya sıralamadan hemen önce 1 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ile yıkayın ve boyayın. Sıralanan hücre popülasyonlarının saflığını doğrulamak için sıralama sonrası analizler gerçekleştirin.
      NOT: Akış sitometrisi için kullanılan tüm antikorlar Malzeme Tablosunda detaylandırılmıştır.
    2. Fare kemik iliğinden aşılanmış hücreleri analiz etmek için aşağıdaki FACS geçit stratejilerini (Şekil 2-7) kullanın.
      1. Hücre popülasyonlarını ileri (boyut) ve yan saçılma (taneciklik) özelliklerine göre ayırt edin.
      2. SSC-H ve SSC-W'yi takip ederek FSC-H ile FSC-W'yi çizerek çift ayrımı gerçekleştirin.
      3. Ölü hücreleri hariç tutun.
      4. Hücre popülasyonlarını insan CD45 ve fare CD45 ile ayırt edin. Bu antikor boyama kombinasyonları, insan CD3, CD19 ve CD33'ün yanı sıra insan CD45 fraksiyonu içinde de tespit edilmesini sağlar.
        NOT: Numuneleri boyamadan önce, spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için fare ve insan Fc bloklarını kullanmayı unutmayın. Genellikle Fc blokları (fare + insan) ile buz üzerinde 10 dakika boyunca boyama yaparız ve ardından hücreleri yıkamadan antikorları ekleriz. Fc blok antikorlarının nasıl kullanılacağına ilişkin her şirketin talimatlarına bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoller 1,14,15,16,17,18,19,20 takiben her bir örnek nakledildi ve ksenogreft fare modeli kuruldu. Buradaki deneylerin amacı, canlı farelerde çeşitli insan hücresi türleri ile IF enjeksiyonunu ve ardından kemik iliği aspirasyonunu/analizini göstermek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin ksenogreft modelleri hem normal hem de patolojik insan hematopoezini incelemek için önemlidir. BM, hematopoez3'ün kaynağıdır; bu nedenle, hematolojik hastalıkların incelenmesi, nadir insan kök hücrelerinin murin BM'sine başarılı bir şekilde aşılanmasını gerektirir. Şimdiye kadar kuyruk damarı, retroorbital ven ve IF enjeksiyonu gibi transplantasyon yöntemleri bildirilmiştir ve bu yöntemlerden herhangi birinin nakledilen hücreleri aşılayabileceği bilinmektedi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.M., Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics ve 858 Therapeutics'in Danışma Kurullarında yer almaktadır ve Gilead Sciences'a lisanslı CD47 kanser immünoterapisi ile ilgili bir dizi patentin mucididir. RM, Pheast Therapeutics, MyeloGene ve Orbital Therapeutics'in kurucu ortağı ve hisse sahibidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Majeti laboratuvarının tüm üyelerine yıllar boyunca yardımları, destekleri, teşvikleri ve ilhamları için teşekkür ederiz. Stanford Kök Hücre Enstitüsü'nün Akış Sitometrisi Çekirdeğine, Binns Kordon Kanı Araştırmaları Programına ve hastalarına örneklerini bağışladıkları için teşekkür ederiz. İnsan örnekleri için, normal donör insan kemik iliği ve periferik kan hücreleri, AllCells veya Stanford Kan Merkezi'nden taze olarak elde edildi. Stanford Üniversitesi'ndeki Nakauchi laboratuvarına pBac-AkaLuc-tdTomato plazmidini bağışladıkları için teşekkür ederiz. Her şeyden önce, farelerimizle ilgilenen Stanford'daki Veteriner Hizmet Merkezi'ndeki veteriner hekimlere ve hayvan kontrol personeline teşekkür etmek istiyoruz. Özellikle, hayvan merkezinin süpervizörü Mike Alvares, farelerin yönetiminde o kadar titiz davrandı ki, o olmasaydı araştırmamızın mümkün olmayacağını söylemek abartı olmazdı.

Bu çalışma, NIH hibeleri 1R01HL142637 ve 1R01CA251331, Stanford Ludwig Kanser Kök Hücre Araştırma ve Tıp Merkezi ve Lösemi ve Lenfoma Derneği, Mark Kanser Araştırmaları Vakfı ve Paul G. Allen Frontiers Group aracılığıyla Kan Kanseri Keşifleri Hibe programı tarafından desteklenmiştir. YN, Nakayama İnsan Bilimleri Vakfı ve Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklendi. A.E., NCI tarafından F32CA250304 ödülü, Stanford'daki İleri İkamet Eğitim Programı ve Amerikan Hematoloji Derneği Akademik Ödülü kapsamında desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1/2 mL Şırınga, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Parçalama TamponuQualoty Biyolojik118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biyolojik IşınlayıcıKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
KlorheksidinNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Etil alkol, kanıt 190Altın Kalkanhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, ABD
Fetal Sığır Serumu (FBS)Omega ScientificFB-01
https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/ Akış sitometresi, AriaIIBeckton Dickinson (BD)hücre sıralama
IMDMGibco12440053 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
İzofluran, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri Jackson Laboratuvarı, Bar Harbor, ME, ABD
Tür #:005557		Altı ila on haftalık erkek veya kadın 
Oftalmik merhem, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/
neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf OstiFen Enjeksiyonu (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Ev yapımı
Penisilin-StreptomisinGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidon-iyotBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (ABD'de)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antikor paneli (in vivo, fare kemik iliği)
Antijen Seyreltme< / güçlü
> < güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD45
Florofor< / güçlü >: V450 < br / > Klon< / güçlü >: HI30		BD Biosciences5603671:25
< güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-fare CD45.1
Florofor< / güçlü >: PE-Cy7
klon: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antijen:Anti-fare TER-119
Florofor: PE-Cy5
Klon: TER-119		eBiyobilim15-5921-831:100
Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD3
Florofor< / güçlü >: APC-Cy7 < br / > klon< / güçlü >: SK7		BD Biosciences3410901: 12.5
< güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD19
Florofor< / güçlü >: APC
Klon< / güçlü >: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antijen:Anti-insan CD33
Florofor: PE
Klon: WM53		BD Biosciences5554501:25
Canlı/Ölü boyamaConc.
PICanlandırıcı1 μ g/mL
Kompanzasyon boncukları
Negatif kontrolBD Biosciences: Ayrıntılar için talimatlarabakın
Anti-fare Ig, κBD BiosciencesAyrıntılar için talimatlara bakın
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886(2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660(2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873(2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ntrafemoral EnjeksiyonKemik li i AspirasyonuHematopoetik K k H crelerFare Xenogreft ModeliSeri Kemik li i AnaliziH cre EngraftmanHematopoetik Progenit r H crelerKemik li i TransplantasyonuFACS TamponuBiyol minesans G r nt leme

İlgili makaleler