Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir
Bu makalede
Özet
Özet
İnsanlarda hematopoietik hücre transplantasyonunun karmaşıklığına rağmen, araştırmacılar farelerde yaygın olarak intravenöz veya intrafemoral (IF) enjeksiyonlar gerçekleştirirler. Fare modellerinde bu teknik, nakledilen hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) tohumlama verimliliğini artırmak için uyarlanmıştır. Bu makale, farelerde IF enjeksiyonunun ayrıntılı bir adım adım teknik prosedürünü ve BM'de bulunan hücrelerin seri karakterizasyonuna izin veren farelerde aşağıdaki kemik iliği (BM) aspirasyonunu açıklamaktadır. Bu yöntem, intravenöz enjeksiyonla aşılanması özellikle zor olan düşük hücre sayılarına sahip değerli örneklerin nakledilmesini sağlar. Bu prosedür, patolojik analiz için kritik olan ksenogreftlerin oluşturulmasını kolaylaştırır. Periferik kana (PB) erişmek daha kolay olsa da, PB'nin hücresel bileşimi, HSPC'ler için niş olan BM'yi yansıtmaz. Bu nedenle, hematopoezi incelemek için BM bölmesine erişim sağlayan prosedürler gereklidir. IF enjeksiyonu ve seri BM aspirasyonu, burada tarif edildiği gibi, farelerden ödün vermeden HSPC'ler gibi BM'de zenginleştirilmiş hücrelerin prospektif olarak alınmasına ve karakterizasyonuna izin verir.
Giriş
Kan sistemi, kemik iliğinde (BM) bulunan hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) tarafından yaşam boyunca korunur1,2. BM ortamındaki dinamik değişiklikleri incelemek için hem normal hem de malign hematopoezinbiyolojisini anlamak önemlidir 3,4. HSC'lerin doğrudan insan BM'sine transplantasyonu, periferik kan (PB) infüzyonundan daha yüksek engraftman sağlar, ancak yüksek prosedür karmaşıklığı ve artan enfeksiyon riski, bu yöntemin standart uygulamanın bir parçası olmasını engeller5. Farelerde, hayvanl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Altı ila on haftalık erkek veya kadın NOD. Bu protokolde Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri kullanılmıştır, ancak tüm fare türlerine uygulanabilir. Işınlama, deneysel içeriğe ve farelerin türüne bağlıdır, farelerin ışınlanıp ışınlanmayacağı araştırma hedeflerine bağlıdır. Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak yürütülmüştür ve Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvanları Bakımı Yönetim Paneli (APLAC #22264) tarafından onaylanmıştır. Tüm normal kan hücresi popülasyonları taze olarak ayıklandı. İnsan AML örnekleri, kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokoller 1,14,15,16,17,18,19,20 takiben her bir örnek nakledildi ve ksenogreft fare modeli kuruldu. Buradaki deneylerin amacı, canlı farelerde çeşitli insan hücresi türleri ile IF enjeksiyonunu ve ardından kemik iliği aspirasyonunu/analizini göstermek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Murin ksenogreft modelleri hem normal hem de patolojik insan hematopoezini incelemek için önemlidir. BM, hematopoez3'ün kaynağıdır; bu nedenle, hematolojik hastalıkların incelenmesi, nadir insan kök hücrelerinin murin BM'sine başarılı bir şekilde aşılanmasını gerektirir. Şimdiye kadar kuyruk damarı, retroorbital ven ve IF enjeksiyonu gibi transplantasyon yöntemleri bildirilmiştir ve bu yöntemlerden herhangi birinin nakledilen hücreleri aşılayabileceği bilinmektedi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
R.M., Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics ve 858 Therapeutics'in Danışma Kurullarında yer almaktadır ve Gilead Sciences'a lisanslı CD47 kanser immünoterapisi ile ilgili bir dizi patentin mucididir. RM, Pheast Therapeutics, MyeloGene ve Orbital Therapeutics'in kurucu ortağı ve hisse sahibidir.
Teşekkürler
Majeti laboratuvarının tüm üyelerine yıllar boyunca yardımları, destekleri, teşvikleri ve ilhamları için teşekkür ederiz. Stanford Kök Hücre Enstitüsü'nün Akış Sitometrisi Çekirdeğine, Binns Kordon Kanı Araştırmaları Programına ve hastalarına örneklerini bağışladıkları için teşekkür ederiz. İnsan örnekleri için, normal donör insan kemik iliği ve periferik kan hücreleri, AllCells veya Stanford Kan Merkezi'nden taze olarak elde edildi. Stanford Üniversitesi'ndeki Nakauchi laboratuvarına pBac-AkaLuc-tdTomato plazmidini bağışladıkları için teşekkür ederiz. Her şeyden önce, farelerimizle ilgilenen Stanford'daki Veteriner Hizmet Merkezi'nde....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1/2 mL Şırınga, 27 G | BD | 305620 | https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620 |
| ACK Parçalama Tamponu | Qualoty Biyolojik | 118-156-101CS | https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/ |
| Biyolojik Işınlayıcı | Kimtron | IC-250 | https://www.kimtron.com/ic-250 |
| Klorheksidin | Nolvasan | NDC 54771-8701-1 | https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser |
| Etil alkol, kanıt 190 | Altın Kalkan | https://goldsd.com/line-card/ | |
| FACSCanto II | (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, ABD | ||
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Omega Scientific | FB-01 | |
| https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/ Akış sitometresi, AriaII | Beckton Dickinson (BD) | hücre sıralama | |
| IMDM | Gibco | 12440053 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053 | |
| İzofluran, USP | Dechra | NDC 17033-094-25 | https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri | Jackson Laboratuvarı, Bar Harbor, ME, ABD | Tür #:005557 | Altı ila on haftalık erkek veya kadın |
| Oftalmik merhem, USP | Bausch Lomb | NDC 24208-780-55 | https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/ |
| neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf OstiFen Enjeksiyonu (Caprofen) | VetOne | NDC 13985-748-20 | http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b |
| PBS, pH 7.4 | Ev yapımı | ||
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Povidon-iyot | Betadine | NDC 67618-155-16 | https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/ |
| TokeOni (ABD'de) | Sigma-Aldrich | 808350-5MG | AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350 |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020 |
| Engraftment antikor paneli (in vivo, fare kemik iliği) | |||
| Antijen | Seyreltme< / güçlü | ||
| > < güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD45 Florofor< / güçlü >: V450 < br / > Klon< / güçlü >: HI30 | BD Biosciences | 560367 | 1:25 |
| < güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-fare CD45.1 Florofor< / güçlü >: PE-Cy7 klon: A20 | eBioscience | 25-0453-81 | 1:50 |
| Antijen:Anti-fare TER-119 Florofor: PE-Cy5 Klon: TER-119 | eBiyobilim | 15-5921-83 | 1:100 |
| Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD3 Florofor< / güçlü >: APC-Cy7 < br / > klon< / güçlü >: SK7 | BD Biosciences | 341090 | 1: 12.5 |
| < güçlü > Antijen< / güçlü >: Anti-insan CD19 Florofor< / güçlü >: APC Klon< / güçlü >: HIB19 | BD Biosciences | 555415 | 1:25 |
| Antijen:Anti-insan CD33 Florofor: PE Klon: WM53 | BD Biosciences | 555450 | 1:25 |
| Canlı/Ölü boyama | Conc. | ||
| PI | Canlandırıcı | 1 μ g/mL | |
| Kompanzasyon boncukları | |||
| Negatif kontrol | BD Biosciences: Ayrıntılar için talimatlara | bakın | |
| Anti-fare Ig, κ | BD Biosciences | Ayrıntılar için talimatlara bakın |
Kaynaklar
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
