Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Abstract

Çözünen taşıyıcılar (SLC’ler), iyonlar, besinler, metabolitler, nörotransmiterler ve farmasötikler dahil olmak üzere bir dizi endojen ve eksojen substratı ithal ve ihraç eden membran taşıyıcılardır. Çekici terapötik hedefler ve hastalık belirteçleri olarak ortaya çıkmasına rağmen, bu protein grubu hala mevcut farmasötikler tarafından nispeten yetersiz ilaçlanmaktadır. Bu taşıyıcılar için ilaç keşif projeleri, nihayetinde bu zara gömülü protein sınıfının ekspresyonu ve saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlı yapısal, işlevsel ve fizyolojik bilgi tarafından engellenmektedir. Burada, kodon için optimize edilmiş gen dizilerini kullanarak yüksek saflıkta, miligram miktarlarda insan SLC taşıyıcı proteinleri elde etme yöntemlerini gösteriyoruz. Yapı tasarımının ve yüksek verimli ekspresyonun sistematik bir şekilde araştırılması ile bağlantılı olarak, bu protokoller hedef proteinlerin yapısal bütünlüğünün ve biyokimyasal aktivitesinin korunmasını sağlar. Ayrıca, bu proteinlerin ökaryotik hücre ekspresyonu, afinite saflaştırması ve boyut dışlama kromatografisindeki kritik adımları da vurguluyoruz. Sonuç olarak, bu iş akışı, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme, taşıma çalışmaları, küçük moleküllü etkileşim testleri ve yüksek verimli in vitro tarama için uygun saf, işlevsel olarak aktif ve stabil protein preparatları sağlar.

Introduction

Membran proteinleri uzun zamandır hem araştırmacılar hem de ilaç endüstrileri için hedef olmuştur. Bunlardan çözünen taşıyıcılar (SLC’ler), insan genomu¹ içinde kodlanmış 400’den fazla ikincil taşıyıcı genden oluşan bir ailedir. Bu taşıyıcılar, iyonlar², nörotransmiterler³, lipitler 4,5,6,7, amino asitler ⁸, besinler^9,10,11 ve farmasötikler ¹² dahil olmak üzere çok sayıda molekülün ithalat ve ihracatında yer almaktadır. Bu kadar geniş bir substrat yelpazesine sahip olan bu proteinler, toksinlerin taşınması¹³, kötüye kullanım ilaçlarının^{taşınması ve inhibisyonu 14,15} veya zararlı mutasyonlar ¹⁶ yoluyla bir dizi patofizyolojide de rol oynar. Bakteriyel homologlar, çeşitli SLC ailelerinin temel taşıma mekanizması için prototip görevi görmüştür 17,18,19,20,21,22,23,24,25. İnsan proteinlerinin aksine, prokaryotik ortologlar genellikle iyi anlaşılmış Escherichia coli ekspresyon sisteminde^26,27 daha iyi ifade edilir ve X-ışını kristalografisi²⁸ için iyi düzenlenmiş kristaller veren daha küçük deterjanlarda daha kararlıdır. Bununla birlikte, dizi ve fonksiyonel farklılıklar, bu uzaktan ilişkili proteinlerin ilaç keşfi için kullanımını zorlaştırmaktadır^29,30. Sonuç olarak, SLC’leri hedef alan ilaçların etki mekanizmasını deşifre etmek için genellikle insan proteininin doğrudan incelenmesi gerekir 31,32,33,34,35. Kriyo-elektron Mikroskobu’ndaki (Cryo-EM) son gelişmeler, SLC’lerin daha doğal benzeri koşullarda yapısal karakterizasyonunu mümkün kılarken,^36,37, bu proteinleri ifade etme ve saflaştırmadaki zorluk^, hedeflenen terapötikler ve teşhisler geliştirmek için bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Bu zorluğu hafifletmek için, RESOLUTE konsorsiyumu (re-solute.eu), insan SLC ailesi proteinlerinin büyük ölçekli ekspresyonu ve saflaştırılması için kaynaklar ve protokoller geliştirmiştir³⁸. Kodon için optimize edilmiş genlerden başlayarak, SLC yapılarının yüksek verimli klonlanması ve taranması için yöntemler geliştirdik. Bu yöntemler sistematik olarak tüm SLC ailesine uygulandı, genler BacMam viral ekspresyon sistemine klonlandı ve protein ekspresyonu, yüksek verimli klonlama ve ekspresyon testi⁴⁰ için daha önce açıklanan yöntemlere dayalı olarak insan hücre hatlarında³⁹ test edildi. Özetle, SLC geni pDONR221 plazmitinden bir pHTBV1.1 vektörüne klonlanır. Bu yapı daha sonra, memeli hücrelerinde ekspresyon için bir sitomegalovirüs promotörü ve arttırıcı elementler içeren böcek hücrelerini transfekte etmek için ilgilenilen geni bir bacmid vektörüne aktarmak için kullanılır. Elde edilen bakulovirüs, hedef SLC proteininin ekspresyonu için memeli hücrelerini dönüştürmek için kullanılabilir.

Ayrıca, seçilen SLC’lerin büyük ölçekli ekspresyonu ve stabil saflaştırılması için standartlaştırılmış yöntemler geliştirdik (Şekil 1). Bu protokol, etkili sorun gidermeyi kolaylaştırmak ve deneyler arasındaki değişkenliği en aza indirmek için birden fazla kontrol noktası içerir. Özellikle, protein ekspresyonunun ve lokalizasyonunun rutin olarak izlenmesinin yanı sıra bireysel hedefler için saflaştırma koşullarının küçük ölçekli optimizasyonu, Strep ve Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketleri^41,42 tarafından desteklenmiştir.

Sonuç olarak, bu kimyasal olarak saf ve yapısal olarak homojen protein örnekleri, X-ışını kristalografisi veya Kriyo-Elektron Mikroskobu (Cryo-EM) ile yapısal belirleme, biyokimyasal hedef-angajman deneyleri, bağlayıcı üretimi için bağışıklama ve kimyasal olarak tanımlanmış lipozomlara sulandırma yoluyla hücresiz fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.

Protocol

NOT: Tüm kodon için optimize edilmiş RESOLUTE SLC genleri, bağlantıları RESOLUTE genel reaktifleri⁴⁴ listesinde bulunan AddGene^43’e yatırılmıştır. Bu genler pDONR221 plazmidine klonlanmıştır ve rekombinasyon klonlaması⁴⁵ kullanılarak genlerin hedef vektöre doğrudan klonlanmasına izin verir. Paralelliği en üst düzeye çıkarmak için, bakteriyel, böcek ve memeli hücreleri, sırasıyla bakmid üretimi (bölüm 3), bakulovirüs amplifikasyonu (bölüm 5) ve ekspresyon testi (bölüm 6) için blok formatında büyütülür. Bu adımlar için, yeterli karıştırma ve havalandırmayı sağlamak için bir mikro ekspresyon çalkalayıcı gereklidir.

1. SLC’lerin pHTBV1.1 bacmid’e (Yüksek verimli) klonlanması

NOT: Klonlama adımı, verimli klonlama ve ısı şoku yöntemi⁴⁶ kullanılarak Escherichia coli’ye (E. coli) dönüşüm için bir rekombinasyon klonlama protokolü kullanır. Protokol, birden fazla hedefin veya yapının yüksek verimli ve paralel klonlanması için tasarlanmıştır, ancak daha küçük ölçeklere kolayca uyarlanabilir.

1. 96 oyuklu bir plakada, 150 ng pDONR221 SLC klonu ve 100 ng pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW vektörü ekleyin. Reaksiyon hacmini 10 mM Tris pH 8.0 ile 8 μL’ye getirin ve ardından 2 μL rekombinasyon enzim karışımı ekleyin.
2. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, 1 μL Proteinaz K ekleyin ve 37 °C’de 30 dakika inkübe edin.
3. Geri kazanım için ısı-şok yöntemi⁴⁶ ve SOC ortamını kullanarak 50 μL kimyasal olarak yetkin E. coli MACH-1 hücrelerini dönüştürmek için 4 μL reaksiyon karışımı kullanın. 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş% 5 sakaroz veya SOC agar içeren LB-agar üzerine plaka.
4. Uygun primerler (bakınız Tablo 1) ve koloni PCR⁴⁷ için standart protokoller kullanarak SLC gen eki ile pHTBV1.1 vektörünü barındıran kolonileri tanımlayın.
5. Bir plazmid miniprep kiti kullanarak ilgilenilen gen ile tek kolonilerden rekombinant plazmidi saflaştırın.

2. Aktarma

NOT: Aşağıdaki adımlar, SLC genlerini pHTBV1.1 vektöründen Sf9 hücrelerinde BacMam bakulovirüs üretimi için bir bacmid’e aktarmak için kullanılır. Isı şoku yöntemi⁴⁶ kullanılarak, pHTBV1.1 vektörü, bir lacZ-mini-attTn7 füzyonu ile bir ana bacmid içeren DH10Bac yetkin E. coli hücrelerine dönüştürülür. Transpozisyon, pHTBV1.1 vektörünün elemanları ile ana bacmid arasında, bir yardımcı plazmid⁴⁸ tarafından sağlanan transpozisyon proteinlerinin varlığında meydana gelir. Bu protokolde kullanılan çözümlerin bileşimi için Tablo 2’ye bakın.

1. 3 μL 100-200 ng/μL saflaştırılmış pHTBV1.1 vektör DNA’sı kullanarak, 96 oyuklu bir PCR plakasında ısı şoku yöntemini kullanarak DH10Bac’ı dönüştürün. Hücreleri, bir mikro ekspresyon çalkalayıcıda 700 rpm’de çalkalarken 37 ° C’de 4-5 saat boyunca geri kazanım ortamında inkübe ederek geri kazanın.
2. 50 μL dönüştürülmüş hücreyi DH10Bac seçim plakalarına yayın. Plakaları folyo ile kaplanmış olarak 37 ° C’de 48 saat inkübe edin.
3. Tek bir beyaz koloni (rekombinant DNA içeren) seçin ve seyreltme çizgisini çizin. Gece boyunca 37 °C’de inkübe edin.

3. Yüksek verimli bakmid üretimi

NOT: Protokol, 96 oyuklu bir bakmid saflaştırma kiti kullanarak bakmidleri ekstrakte etme adımlarını açıklar.

1. Tek tek beyaz kolonileri (çizgili ve seyreltme plakalarına izole edilmiş) 1 mL 2x LB ortamı içeren 96 derin kuyulu bir bloğun kuyucuklarına aşılayın (Tablo 2).
2. Gözenekli bir conta ile örtün ve 37 °C’de gece boyunca 700 rpm’de bir mikro ekspresyon çalkalayıcıda inkübe edin.
3. Bir mikrotitre plakasında 120 μL kültürü 30 μL %60 gliserol ile karıştırarak hücrelerin bir gliserol stoğu hazırlayın ve -80 °C’de saklayın.
4. Derin kuyu bloğunu 2.600 × g’da 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dekontaminasyon için uygun bir kaba boşaltın. Bloğu ters çevirin ve bir kağıt havluya hafifçe vurun. Çok kanallı bir pipet kullanarak bloğun her bir oyuğuna 250 μL Çözelti 1 ekleyin.
5. Peletleri yeniden askıya alın; Gerekirse, çok kanallı bir pipet kullanın.
6. Her bir oyuğa 250 μL Çözelti 2 ekleyin ve silikon bir paspasla kapatın. Yavaşça 5 kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Çok kısa bir süre döndürün.
7. 300 μL Çözelti 3 ekleyin ve silikon bir paspasla kapatın. 5x ters çevirerek nazikçe ama iyice karıştırın.
8. Numuneyi 20 dakika buz üzerine koyun, ardından 4 °C’de 30 dakika boyunca 2.600 × g’da santrifüjleyin.
9. Berrak süpernatanı 96 oyuklu yeni bir bloğa aktarın. 4 ° C’de 30 dakika boyunca 2.600 × g’da tekrar santrifüjleyin.
10. Taze 96 derin kuyucuklu bir blokta, oyuk başına 0.8 mL% 100 izopropanol dağıtın. İlgili kuyucuklardan 0.8 mL süpernatan ekleyin.
11. Bir pipet kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından daha fazla bacmid elde etmek için 30 dakika veya gece boyunca 4 °C’de buz üzerinde inkübe edin.
12. 4 ° C’de 30 dakika boyunca 2.600 × g’da santrifüjleyin.
13. Biyolojik bir güvenlik kabininin içinde, bloğun dışına% 70 etanol püskürtün, bloğu açın ve süpernatanı atın.
14. Her bir kuyucuğa 500 μL %70 etanol (h/h) ekleyin ve peleti yıkamak için bloğa hafifçe vurun. Yapışkan bir plastik conta ile örtün ve 4 °C’de 30 dakika boyunca 2.600 × g’da santrifüjleyin.
15. Bir Biyolojik Güvenlik Kabini içinde, bloğu açın ve süpernatanı atın. Etanolü çıkarmak için bloğa bir kağıt havluya çok nazikçe vurun. Bloğun davlumbazın içinde 1-2 saat veya 50 °C fırında kurumasını bekleyin.
16. Bacmid DNA’yı yeniden süspanse etmek için 50 μL steril TE tamponu ekleyin ve yapışkan bir plastik conta kullanarak kapatın. İçeriği V tabanlı bir mikrotitre plakasına aktarın. Test saflaştırması tamamlanana kadar bakmid DNA’sını 4 °C’de saklayın ve ardından -20 °C’de saklayın.
    NOT: Rutin olarak ölçülmese de, genellikle 500 ila 2.000 ng / μL bacmid DNA verimi beklenebilir.
17. Hedef geni başarılı bir şekilde dahil eden bakmidleri taramak için standart koloni PCR yöntemlerini⁴⁷ ve aşağıdaki vektör primerlerini kullanın:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    NOT: Amplikon, hedef genden yaklaşık 700 bp daha büyük olacaktır.

4. Transfeksiyon

NOT: Bu adımlar, böcek hücrelerinin bakulovirüs parçacıkları (P0) oluşturmasına neden olan üretilen bacmid ile Sf9 böcek hücrelerini transfekte etmek için kullanılır.

1. Serum içermeyen böcek ortamında Sf9 hücrelerini 2.0-2.4 × 10⁶ hücre / mL yoğunluğa kadar büyütün. Hücreleri serumsuz böcek ortamında 2 × 10⁵ hücre / mL’ye seyreltin ve seyreltilmiş hücrelerin 1 mL’sini 24 oyuklu bir doku kültürü plakasına dağıtın. Yalnızca transfeksiyon reaktifi ve yalnızca hücre kontrolü ekleyin. Hücrenin bağlanmasını sağlamak için plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 27 ° C’de 1 saat inkübe edin.
2. Serumsuz böcek ortamının oyuğu başına 38 μL’yi, transfeksiyon reaktifinin oyuğu başına 2 μL ile karıştırın. Karışımın 40 μL’sini 96 oyuklu steril düz tabanlı bir mikrotitre plakasına dağıtın. 0.5-2.0 μg/μL’de 2 μL rekombinant bakmid DNA ekleyin, plakayı kapatın ve mikrobiyolojik güvenlik kabini içinde 15 dakika inkübe edin.
3. DNA-transfeksiyon reaktif karışımını içeren mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 160 μL serumsuz böcek ortamı ekleyin.
4. Adım 4.1’deki hücrelerden ortamı aspire edin. Nazikçe, 200 μL bakmid-transfeksiyon reaktifi-ortam karışımını hücrelere ekleyin, plakayı örtün ve 27 ° C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 4 saat inkübe edin.
5. Her oyuğa %2 FBS ile takviye edilmiş 400 μL serumsuz böcek ortamı ekleyin. Buharlaşmayı azaltmak için plakayı temiz bir plastik torbaya aktarın, ancak kapatmayın. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 72 saat boyunca 27 ° C’de inkübe edin.
6. 3 gün sonra, ortamı plakadan steril bir 96 derin kuyu bloğuna aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.500 × g’da santrifüjleyin. P0 bakulovirüs içeren arıtılmış süpernatanı steril 96 derin kuyu bloğuna aktarın ve ışıktan uzakta 4 ° C’de saklayın.

5. BacMam bakulovirüs amplifikasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, başlangıçtaki P0 bakulovirüsünü daha yüksek titreli viral stoklara yükseltmek için kullanılır; yani P1, P2 ve P3. Son P3 titresi, transdüksiyon ve protein ekspresyonu için uygundur. Verimlilik ve paralellik için bu protokol, ampirik olarak optimize edilmiş viral amplifikasyon için sabit hacimsel oranlar kullanır. Bununla birlikte, daha sonra transdüksiyona uğrayan hücreler mikroskopi ile GFP floresansı ve hücre çapı artışı göstermiyorsa veya protein ekspresyonu başarısız olursa (bkz. bölüm 6 ve 8), bakulovirüs titresi^49,50,51,52 ölçüldükten sonra her adımda düşük bir enfeksiyon çokluğu için bakulovirüs amplifikasyonu yeniden optimize edilmelidir ve GFP floresan mikroskobu ile izlenen enfeksiyon ve artan hücre çapı ^53.

1. Sf9 hücrelerini serumsuz böcek ortamında 2 × 10⁶ hücre / mL yoğunluğa kadar büyüterek P1 virüs stoğunu hazırlayın,% 2 FBS ekleyin ve hücreleri oyuk başına 3 mL’lik bir son hacimde 24 derin kuyu bloğunda tohumlayın. Hücrelere 120 μL P0 virüs stoğu ekleyin.
2. Bloğu 27 °C’de inkübe ederken 450 rpm’de 66-72 saat mikro ekspresyonlu çalkalayıcıda çalkalayın. Bloğu oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.500 × g’da santrifüjleyin ve süpernatanı 96 derin kuyu bloklarına hasat edin. P1 virüsü stoğu olarak 4 °C’de ışıktan uzakta saklayın.
3. 250 μL P1 virüs stoğu ile% 2 FBS ile desteklenmiş serumsuz böcek ortamında yetiştirilen 50 mL Sf9 hücresini (2 ×^{10 6} hücre / mL hücre yoğunluğu) enfekte ederek P2 virüs stoğunu hazırlayın. Hücreleri 27 ° C’de 110 rpm’de çalkalayarak inkübe edin.
4. P2 virüs stoğunu 66-72 saat sonra 1.500 × g’da santrifüjleme ile 20 dakika hasat edin ve 4 °C’de ışıktan uzakta saklayın.
5. İstenilen hacimde Sf9 hücrelerini (2 × 10⁶ hücre/mL hücre yoğunluğu) 1:200 (h/h) P2 viral stoğu ile enfekte ederek P3 virüs stoğunu hazırlayın. Hücreleri 27 ° C’de 110 rpm’de çalkalayarak inkübe edin.
6. 66-72 saat sonra, 20 dakika boyunca 1.500 × g’da santrifüjleyin ve süpernatanı toplayarak P3 virüsünü hasat edin ve ışıktan koruyarak 4 ° C’de saklayın.

6. İfade testi için transdüksiyon

NOT: Aşağıdaki bölüm, küçük ölçekli ifade testini açıklar ve derin kuyu blokları kullanılarak birden çok yapının paralel testi için değiştirilebilir.

1. 200 g PEG 10.000 ve 12 g NaCl’yi 600 mL çift damıtılmış_H2Oiçinde çözerek% 20 (a / h) polietilen glikol çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi otoklavlayın.
2. 24 derin kuyu bloğunun kuyucuklarına 300 μL hasat edilmiş P1 virüsü ve her oyuğa 75 μL PEG çözeltisi ekleyin. Bloğu 300 rpm’de 5 dakika çalkalarken 18 °C’de bir mikro ekspresyon çalkalayıcıda inkübe edin ve bloğu gece boyunca 4 °C’de saklayın.
3. Bloğu 18 °C’de 30 dakika boyunca 300 rpm’de tekrar çalkalayın ve bloğu 45 dakika boyunca 3.000 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı mikrobiyolojik güvenlik kabininde bir pipet kullanarak atın.
4. HEK293 ortamında süspansiyona uyarlanmış HEK293 hücrelerini 2 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğa hazırlayın ve 5 mM sodyum bütirat ile takviye ederek virüs peletini içeren her bir oyuğa 3 mL tohumlayın.
5. Bloğu 30 °C’de %8 CO 2 ile inkübe edin_ve 72 saat boyunca 200-250 rpm’de çalkalayın.
   NOT: Hücre kültürü sırasında satıcı tarafından önerilen CO₂ konsantrasyonları, süspansiyona uyarlanmış ve atalardan kalma HEK293 hücre hatları için sırasıyla %8 ve %5 olmak üzere farklıdır.
6. Hücreleri 20 dakika boyunca 900 × g’da santrifüj ile hasat edin ve her birini 1 mL PBS ile yıkayın.
   NOT: 10 μL yeniden süspanse edilmiş hücreleri aspire edin ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu değerlendirmek için hücreleri GFP uyumlu bir filtre küpü ile bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin. 10-15 μL yeniden süspanse edilmiş hücreleri aspire edin ve jel içi GFP floresan tespiti için tam hücreli bir SDS-PAGE jeli çalıştırın⁵⁴.
7. 20 dakika boyunca 900 × g’da tekrar santrifüjleyin. Peletleri -80 °C’de dondurun.

7. Yüksek verimli küçük ölçekli test saflaştırma

NOT: Aşağıdaki adımlar, tek tek SLC’lerin ekspresyon seviyelerini taramak için 24 kuyucuklu blok formatında hızlı bir test saflaştırma iş akışını açıklar. Bu protokolde kullanılan çözümlerin bileşimi için Tablo 2’ye bakın.

1. Hasat edilen hücrelerin her bir oyuğuna 1 mL HT lizis tamponu ekleyin ve 24 başlı bir prob kullanarak 24 oyuklu bloklarda toplam 4 dakika (3 s açık / 15 s kapalı) boyunca buz üzerinde sonikasyon yapmaya devam edin.
2. İçeriği 96 derinliğinde bir kuyu bloğuna aktarın, 125 μL deterjan stoğu ekleyin ve silikon conta ile kapatın. Bloğu 4 °C’de 1 saat boyunca yavaşça döndürün. Alternatif olarak, dodesilmaltosit (DDM) ve kolesterol hemisüksinat (CHS) doğrudan 24 oyuklu bloklara ekleyin ve bunları 4 ° C’de bir külbütör çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
3. Bloğu 2600 × g’da 4 °C’de 20 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 96 derin kuyulu yeni bir bloğa aktarın.
4. Lizis tamponu ile önceden dengelenmiş %50 yüksek kapasiteli Strep-Tactin reçinesi stoğu hazırlayın.
5. Her kuyucuğa 100 μL yeniden askıya alınmış reçine stoğu ekleyin.
6. Bloğu silikon bir conta ile örtün ve 4 °C’de 2 saat döndürün ve ardından kapağa yapışan sıvıyı çıkarmak için çok kısa bir süre (200 × g’a kadar) santrifüjleyin.
7. Boş bir bloğun üzerine 96 oyuklu bir filtre plakası yerleştirin ve reçine/süpernatan karışımını filtre plakasına aktarın. Derin kuyu bloğunun kuyularını 800 μL HT yıkama tamponu ile durulayın ve maksimum reçine miktarını toplamak için filtre bloğuna aktarın.
8. Tamponun damlamasına izin verin veya 200 × g’da kısa bir süre santrifüjleyin ve akışı toplayın. Filtre plakasını yeni bir yıkama bloğunun üzerine yerleştirin ve reçineyi 800 μL HT yıkama tamponu ile yıkayın, böylece tamponun damlamasına (veya kısa bir süre santrifüj etmesine) izin verin. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve kalan HT yıkama tamponunu çıkarmak için bloğu 500 × g’da 3 dakika santrifüjleyin.
9. Filtre plakasını 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının üzerine yerleştirin. 50 μL HT elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayarak inkübe edin. Numuneleri 500 × g’da 3 dakika santrifüjleyerek elute.
10. Protein ekspresyonunu kontrol etmek için ayrıştırılmış numunenin 15 μL’sini Coomassie ile boyanmış bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın. DDM/CHS’de protein monodispersitesini değerlendirmek için kalan eluent numunelerini bir Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC) veya Floresan algılamalı Boyut Dışlama Kromatografisi (FSEC) sistemine yükleyin.

8. Büyük ölçekli ifade için transdüksiyon

NOT: Aşağıdaki adımlar, SLC ifadesi için standart RESOLUTE protokolüdür. Bireysel hedefler, ekspresyon süresi, inkübasyon sıcaklığı ve sodyum bütirat konsantrasyonu için daha fazla optimizasyon gerektirecektir. Ayrıca, küçük ölçekli deneylerde süspansiyona uyarlanmış HEK293 hücrelerini enfekte etmek için kullanılan P3 virüsünün çeşitli hacimsel oranlarını test ederek bakulovirüs enfeksiyon çokluğunu rutin olarak optimize ediyoruz. Bu zaman açısından verimlidir, halihazırda eldeki teknikleri ve ekipmanı kullanır ve istenen deneysel çıktıyı doğrudan değerlendirir. Bununla birlikte, bu ampirik yöntem, P3 virüsünün her amplifikasyonu ile yeniden optimizasyon gerektirir ve bakulovirüs partiküllerini^ölçmek için başka yöntemler mevcuttur 49,50,51,52.

1. HEK293 ortamında süspansiyona uyarlanmış HEK293 hücrelerinin gerekli hacmini artırın.
2. Süspansiyona uyarlanmış HEK293 hücrelerini 1 × 10⁶ hücre/mL’ye seyreltin ve 24 saat büyütün (2 L’lik silindir şişeler için 170 rpm’de ve 3 L’lik silindir şişeler için 105 rpm’de).
3. Bir litre hücre başına 30 mL P3 virüsü ekleyin ve 5 mM sodyum bütirat ekleyin. Hücreleri 37 °C’de 48 saat veya 30 °C’de 72 saat inkübe edin.
4. Kuluçka süresi sırasında ve sonrasında, önemli bir Adım , mikrobiyal kontaminasyonu ve hücre canlılığını kontrol etmek için parlak alan mikroskobu kullanarak hücreleri incelemektir. GFP uyumlu bir filtre küpü ile floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu değerlendirin.
5. Hücreleri 20 dakika boyunca 900 × g’da santrifüjleme ile hasat edin.
6. Hücre peletini, hücre kültürünün litresi başına 10-15 mL PBS içinde yeniden süspanse ederek yıkayın ve peleti 20 dakika boyunca 900 × g’da tekrar yıkayın.
7. Hücre peletlerini sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C’de saklayın.

9. Protein saflaştırma

NOT: Aşağıdakiler, 5 L hücre kültürü için SLC saflaştırması için standart RESOLUTE yöntemidir. Her SLC hedefi için en uygun deterjan ampirik olarak belirlenmelidir. Baz tamponu, deterjan stok solüsyonunu, yıkamayı, elüsyonu ve SEC tamponlarını önceden hazırlayın (Tablo 2). Test edilen standart deterjanların listesi için Tablo 3’e bakın. Yıkama tamponundaki ATP ve MgCl₂ , ısı şoku proteinlerinin neden olduğu kontaminasyonu azaltır.

1. 1. Gün
   1. Donmuş hücre peletini oda sıcaklığına ayarlanmış bir su banyosunda çözdürün.
   2. 135 mL baz tampon ve üç proteaz İnhibitör Kokteyl tableti ile çözündürme tamponu hazırlayın. Tabletlerin çözünmesine izin verin.
   3. Çözülmüş peleti çözündürme tamponu ile yeniden süspanse edin. 10-15 g hücre peleti başına 27 mL çözündürme tamponu kullanın, DNaz ekleyin ve buz gibi bir Dounce homojenizatöre dökün. Homojenizatörü buz üzerinde tutarak pistonu yaklaşık 20 kat yukarı ve aşağı hareket ettirerek çözeltiyi homojenize edin.
      NOT: Yeniden süspansiyon hacminin, hasattaki hücre yoğunluğuna bağlı olarak değişecek olan hedef proteine ve hücre pelet kütlesine göre optimize edilmesi gerekecektir. Ticari DNase, üreticinin talimatlarına göre eklenebilir. DNase, yerleşik protokoller⁵⁵ kullanılarak kurum içinde de ifade edilebilir ve saflaştırılabilir.
   4. % 1 nihai konsantrasyona kadar deterjan stok çözeltisi ekleyin.
      NOT: Protein saflaştırmasını optimize etmenin önemli bir adımı , ampirik olarak tanımlanması gereken SLC çözündürme ve saflaştırma için en uygun deterjanın belirlenmesidir. Düzenli olarak çeşitli deterjanlar kullandık; her biri tek başına ve kolesteril hemisüksinat ile kombinasyon halinde, deterjanın CHS kütle oranını 10: 1’de tutar.
   5. Çözündürme karışımını 50 mL konik tüplere aktarın. 4 °C’de 1 saat yavaşça döndürün.
   6. Çözeltiyi 50.000 × g’da 4 °C’de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı topla.
   7. Strep-Tactin reçinesinin 4-6 mL yatak hacmini baz tampon ile dengeleyin.
   8. Çözündürülmüş süpernatana dengelenmiş reçine ekleyin ve 4 °C’de 2 saat döndürün.
   9. Çözeltiyi bir yerçekimi akış kolonuna dökün ve çözeltinin akmasına izin verin.
   10. Reçineyi Strep yıkama tamponunun yatak hacminin 30 katı ile 3 eşit hacimde yıkayın.
   11. 3-5 mL elüsyon tamponu ekleyin, 15 dakika inkübe edin ve elüatı toplayın. Her bir elüsyon fraksiyonunu ayrı ayrı toplayarak bu adımı dört kez daha tekrarlayın.
       NOT: Önemli bir Adım , elüsyon tamponunun her eklenmesinden sonra 15 dakika inkübe etmenin önemli olduğu Strep-Tactin reçinesinden protein elüsyonudur. Tipik olarak, ilk elüat fraksiyonu, elüsyon tamponunun artık yıkama tamponu tarafından seyreltilmesi nedeniyle daha düşük bir protein konsantrasyonu içerir. Bu nedenle, daha yüksek bir nihai protein konsantrasyonu isteniyorsa, ilk eluat fraksiyonu atılabilir. Alternatif olarak, protokolü optimize etmek için tüm seri elutiyonlardaki protein konsantrasyonu SDS-PAGE kullanılarak da analiz edilebilir.
   12. UV absorbans spektroskopisi ile protein konsantrasyonunu ölçün, istenen elüsyon fraksiyonlarını birleştirin ve 1:5 (a/a) ila 1:10 (a/a) oranında 3C proteaz ekleyin.
   13. Gece boyunca 4 °C’de yavaşça döndürün.
       NOT: 9.1.12 ve 9.1.13 adımları yalnızca GFP etiketinin kaldırılması gerekiyorsa gereklidir. Etiketin kaldırılması gerekmiyorsa, doğrudan Adım 9.2.4’e geçin. Alternatif olarak, protein ertesi gün devam etmek için gece boyunca 4 ° C’de tutulabilir. Ayrıca, stabilitesi azalmış SLC’ler için proteaz konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve sıcaklığın optimizasyona ihtiyacı olabilir. 3C proteaz, geniş bir sıcaklık aralığında aktiftir ve çeşitli SLC’ler için en uygun optimizasyona izin verir.
2. 2. Gün
   1. 2-4 mL yatak hacminde kobalt metal afinite reçinesini SEC tamponu ile dengeleyin.
   2. Gece boyunca 3C reaksiyon karışımına dengelenmiş kobalt metal afinite reçinesi ekleyin ve 4 ° C’de 1 saat döndürün.
   3. Çözeltiyi bir yerçekimi akış kolonuna dökün ve akışı toplayın.
   4. 4 °C’de 3.000 × g’da döndürerek akışı 100 kDa’lık bir kesme santrifüj filtrede konsantre edin ve istenen SEC enjeksiyon hacmine ulaşılana kadar numuneyi her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
   5. SEC tamponu kullanarak bir dekstran-agaroz bazlı boyut dışlama kromatografi kolonunu dengeleyin. SEC prosedürü 4 °C’de (soğutulmuş oda veya soğuk oda) gerçekleştirilmelidir.
      NOT: Anahtar adım: SLC’nin oligomerik durumuna bağlı olarak, SEC gerçekleştirmek için agaroz bazlı boyut dışlama kromatografisi kolonu gibi farklı bir kolon kullanılabilir.
   6. Numuneyi numune döngüsüne enjekte edin ve kolon basıncı kolon üreticisinin spesifikasyonlarının altında olacak şekilde bir akış hızıyla SEC programını çalıştırın. Bir kesir toplayıcı kullanarak, tüm SEC çalışması boyunca 0,3 mL kesirleri otomatik olarak toplayın.
   7. Tepe fraksiyonlarını bir araya getirin, UV absorbansını ölçün ve 4 °C’de 3.000 × g’da döndürerek 100 kDa’lık bir kesme santrifüj yoğunlaştırıcıda gerekli hacim/konsantrasyona konsantre edin.

Representative Results

Discussion

SLC hedefli tedavilerin geliştirilmesi, taşıyıcı fonksiyonun sistematik karakterizasyonunun olmaması nedeniyle engellenmiştir. Bu, normal ve patofizyolojik süreçlerdeki sayısız rollerine rağmen, GPCR’lere ve iyon kanallarına⁶³ göre bu protein sınıfını hedef alan orantısız olarak daha az ilaca yol açmıştır. RESOLUTE, mevcut SLC araştırmalarını hızlandırmak ve geliştirmek için en son araştırma tekniklerini ve araçlarını geliştirmeyi amaçlayan uluslararası bir konsorsiyumdur. RESOLUTE’un bir parçası olarak, bu protokolleri verimli klonlama, yapı taraması ve insan SLC’lerinin büyük ölçekli ekspresyonu ve saflaştırılması için geliştirdik.

Burada, varsayılan ve yetim SLC’ler de dahil olmak üzere insan SLC taşıyıcılarını sistematik olarak keşfetmek için başarıyla kullanılan ölçeklenebilir SLC klonlama ve ekspresyon yöntemlerini açıklıyoruz. Özellikle, bu şekilde saflaştırılan SLC’ler, taşıyıcı yapı, biyokimya, fonksiyon, bağlayıcı üretimi ve küçük molekül bağlanma ile ilgili sonraki çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli SLC’lerin miligram miktarlarını saflaştırmak için bu yöntemi düzenli olarak kullanıyoruz ve optimum koşullar altında, klonlama ve doku kültürü adımları da dahil olmak üzere tüm protokol 4-5 hafta içinde tamamlanabiliyor.

Yöntemimiz, birden fazla hedefi sistematik olarak değerlendirmek için ekonomi ve paralellik açısından optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yüksek verimli yöntem, farklı klonlama primerleri veya vektörleri kullanılarak çeşitli kesmeler veya etiketlerle tek bir hedef için paralel yapı oluşturmaya da kolayca uyarlanır. Bu, bir hedef⁶⁴ için birden fazla yapıyı optimize eden yöntemlere benzer, ancak protokolümüz paralel klonlama, bakulovirüs üretimi ve ekspresyon testi ile daha fazla verimlilik sunar. Transfeksiyon, bakulovirüs nesli^65’ten vazgeçerek yapı klonlaması ve ekspresyon arasında daha kısa bir süre sunar, ancak büyük ölçekli ekspresyon için önemli ölçüde daha pahalı ve zahmetlidir. Buna karşılık, kararlı hücre hatları, büyük ölçekli ekspresyon⁶⁶ için muhtemelen daha ucuzdur, ancak yüksek oranda eksprese eden klonal hücre hatları oluşturmak daha fazla zaman ve özel kaynaklar gerektirebilir. Son olarak, bu protokol protein üretimi için insan hücre hatlarını kullanırken, Spodoptera frugiperda ve Trichoplusia ni gibi böcek hücreleri hattı da büyük ölçekli SLC ekspresyonu ^5,31,64 için başarıyla kullanılmıştır. İnsan hücre hatlarındaki ekspresyon, medya maliyetlerini artırır, ancak daha doğal benzeri çeviri sonrası modifikasyonlar ve lipid ortamı sunar ^39,67.

Protokol, farklı membran taşıyıcıları ve deneysel ihtiyaçlar için uyarlanabilirken, saflaştırılmış protein numunelerinin kalitesini ve verimini çeşitli faktörler etkiler. Tam uzunlukta proteinleri incelemek ideal olsa da, daha iyi ekspresyon, saflaştırma ve sulandırma verimleri elde etmek için bir dereceye kadar dizi kesilmesi gerekebilir. Tüm RESOLUTE SLC yapıları, SLC ekspresyonunu, hücresel lokalizasyonu ve saflaştırmayı izlemede değerli olan bölünebilir bir GFP ile etiketlenmiştir. Bu deneylerde kullanılan süspansiyona uyarlanmış HEK293 hücre ekspresyon sistemi, üstün verimlere yol açmıştır ve rutin olarak süspansiyona uyarlanmış HEK293 GnTl- hücre hattı yoluyla kompleks glikozilasyon olmadan proteinler üretmemize rağmen tavsiye edilmektedir. Dönüştürülen hücreler tarafından protein ekspresyonu için inkübasyon sıcaklığı ve uzunluğu her hedef için optimize edilmelidir, ancak 30 ° C’de 72 saatin iyi bir varsayılan olduğunu bulduk.

Tüm protein saflaştırma adımları buz üzerinde veya 4 °C’de gerçekleştirilmeli ve saflaştırılmış protein dondurulduktan sonra donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır. Membran çözündürme ve saflaştırma tamponlarında kullanılan deterjanların türü ve miktarı kritiktir ve her SLC için ampirik olarak belirlenmelidir.

Bu yöntemle saflaştırılan SLC’ler, çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için kullanılabilecek homojen ve yapısal ve işlevsel olarak bozulmamış numuneler verir. Çözündürülmüş ve saflaştırılmış SLC proteininin tek, ayrık parçacıklarının negatif leke ve Cryo-EM (Şekil 3A,B) ile gözlenmesi, sonraki yapı tayini için umut verici olabilir³⁷. Deterjandaki saflaştırılmış SLC, substratlar, inhibitörler veya lipitler gibi küçük moleküllerle protein etkileşimlerini araştırmak için termal stabilite testi (Şekil 3C,D) gibi biyofiziksel testler için kullanılabilir^59,62. Son olarak, biyokimyasal deneylerde bu protokol kullanılarak saflaştırılan SLC’ler, fonksiyonel deneyler⁶⁸ için lipozomlara veya nanodisklere yeniden oluşturulabilir ve antikor ve nanokor üretimi ve seçimi^{için kullanılabilir 69,70}. Bu yöntemleri, yeni SLC hedefli küçük moleküllerin ^keşfi için gerekli verime uyarlamak zor olsa da, in vitro yüksek verimli tarama teknolojileri alanında umut verici ilerlemeler kaydedilmiştir^71,72,73,74.

Materials

3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl<br/> Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent