Yöntem makalesi

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

3.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65921

⸱

20 Ekim 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Özet

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sisteminin (CNS) önemli bir fizyolojik bileşenidir, besinleri korur, atıkları temizler ve beyni patojenlerden korur. BBB'nin doğal bariyer özellikleri, nörolojik hastalıkları tedavi etmek için CNS'ye terapötik ilaç verilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bozulmuş BBB fonksiyonu nörolojik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatürde amiloidin birikmesi ve riskli bir BBB'ye yol açması, Alzheimer hastalığının (AD) çoğu vakasında bir komorbiditedir ve BBB disfonksiyonunun veya bozulmasının nörodejenerasyonda rol oynayabileceğini düşündürür. İnsan BBB dokusuna sınırlı erişim nedeniyle, uygun BBB fonksiyonuna ve BBB dejenerasyonuna katkıda bulunan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu sınırlamaları ele almak için, endotel hücrelerini, perisitleri ve astrositleri bir 3D matriste birleştirerek insan pluripotent kök hücre türevi bir BBB (iBBB) geliştirdik. iBBB, BBB'de bulunan anatomiyi ve hücresel etkileşimleri özetlemek için kendi kendine toplanır. iBBB'lerin amiloid ile tohumlanması, CAA'nın önemli yönlerini yakalar. Ek olarak, iBBB, genetik ve yaşam tarzının hastalık riskini nasıl etkilediğini araştırmak için serebrovasküler hastalık ve nörodejenerasyonda rol oynayan genetik ve çevresel faktörleri modüle etmek için esnek bir platform sunar. Son olarak, iBBB, CNS'ye terapötik iletimi optimize etmek için ilaç taraması ve tıbbi kimya çalışmaları için kullanılabilir. Bu protokolde, insan pluripotent kök hücrelerinden kaynaklanan üç tip hücrenin (endotel hücreleri, perisitler ve astrositler) farklılaşmasını, farklılaşmış hücrelerin iBBB'ye nasıl birleştirileceğini ve ekzojen amiloid kullanılarak CAA'nın in vitro olarak nasıl modelleneceğini açıklıyoruz. Bu model, hem biyolojik sadakate hem de deneysel esnekliğe sahip bir sistemle canlı insan beyin dokusunu incelemenin zorluğunun üstesinden gelir ve insan BBB'sinin ve nörodejenerasyondaki rolünün sorgulanmasını sağlar.

Giriş

Kan-beyin bariyeri (BBB), uygun nöronal fonksiyon için ideal bir ortam sağlamak için merkezi sinir sistemini (CNS) çevreden ayıran önemli bir mikrovasküler ağdır. Metabolik homeostazı 1,2,3,4 koruyarak, atıkları temizleyerek 4,5,6 ve beyni patojenlerden ve toksinlerdenkoruyarak 7,8 maddelerin CNS'ye akışını ve akışını düzenlemede kritik bir role sahiptir.

BBB'nin birincil hücre tipi endotel hücresidir (EC). Mezoderm soyundan türetilen endotel hücreleri, vaskülatür 1,9'un duvarlarını oluşturur. Mikrovasküler EC'ler, membranlarının 10,11,12,13,14 geçirgenliğini büyük ölçüde azaltmak için birbirleriyle sıkı bağlantılar oluştururken, besinlerin CNS'ye girip çıkmasını kolaylaştırmak için taşıyıcıları eksprese eder 1,4,12,14. Mikrovasküler EC'ler, mikrovasküler fonksiyonu ve homeostazı düzenleyen perisitler (PC'ler)-duvar hücreleri ile çevrilidir ve BBB'nin moleküllere ve bağışıklık hücrelerine geçirgenliğini düzenlemek için kritik öneme sahiptir 15,16,17. Majör bir glial hücre tipi olan astrosit, BBB'yi oluşturan son hücre tipidir. Astrosit uç ayakları EC-PC vasküler tüplerinin etrafını sararken, hücre gövdeleri beyin parankimine uzanarak nöronlar ve damar sistemi1 arasında bir bağlantı oluşturur. Farklı çözünen ve substrat taşıyıcıları, BBB fonksiyonu18,19,20,21'de kritik bir role sahip olan astrosit uç ayaklarında (örneğin, aquaporin 4 [AQP-4]) lokalizedir.

BBB, uygun beyin sağlığı fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik öneme sahiptir ve Alzheimer hastalığı (AD)22,23,24,25, multipl skleroz 7,26,27,28, epilepsi 29,30 ve inme31,32 dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıkta BBB'nin işlev bozukluğu bildirilmiştir . Serebrovasküler anormalliklerin nörodejenerasyonda merkezi bir rol oynadığı ve iskemik ve hemorajik olaylara duyarlılığın artmasına katkıda bulunduğu giderek daha fazla kabul edilmektedir. Örneğin, AD hastalarının %90'ından fazlasında serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatür boyunca amiloid β (Aβ) birikimi ile karakterize bir durumdur. CAA, BBB geçirgenliğini arttırır ve BBB fonksiyonunu azaltır, CNS'yi iskemi, hemorajik olaylar ve hızlandırılmış bilişsel gerilemeye karşı savunmasız bırakır33.

Yakın zamanda, bir 3D matriste kapsüllenmiş EC'leri, PC'leri ve astrositleri içeren, hasta kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen insan BBB'sinin in vitro bir modelini geliştirdik (Şekil 1A). iBBB, vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür24 ile lokalizasyonu dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili etkileşimleri özetler. APOE4'ün aracılık ettiği CAA duyarlılığını modellemek için iBBB'yi uyguladık (Şekil 1B). Bu, APOE4'ün CAA'yı teşvik ettiği nedensel hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamamızı ve CAA patolojisini azaltan ve APOE4 farelerinde in vivo öğrenme ve hafızayı geliştiren terapötik stratejiler geliştirmek için bu içgörülerden yararlanmamızı sağladı24. Burada, BBB'yi insan iPSC'lerinden yeniden yapılandırmak ve CAA'yı in vitro modellemek için ayrıntılı bir protokol ve video eğitimi sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. iPSC'leri iBBB hücrelerine ayırma

NOT: Bu farklılaşma protokolleri daha önce Mesentier-Louro ve ark.34'te tanımlanmıştır.

  1. Hücre kültürü plakalarının kaplanması
    1. Azaltılmış büyüme faktörü (GF) membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. 500 μL bazal membran matrisini 49.5 mL DMEM ile seyreltin. Kaplama çözeltisinin erken polimerizasyonunu önlemek için bu çözeltiyi soğuk tutun.
    2. 6 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın oyuğu başına 1-2 mL ekleyin. Kaplama solüsyonunu uygun ısıtılmış kültür ortamıyla değiştirmeden önce 37 °C'de en az 20 dakika bekletin.
  2. İnsan iPSC'lerinin ETV2 ile indüklenebilir endotel hücrelerine farklılaşması
    Süre: 8 gün
    NOT: Bu protokol Blanchard ve ark.24 ve Qian ve ark.35'ten uyarlanmıştır. Verimi artırmak için Wang ve ark.36 tarafından tarif edildiği gibi, transkripsiyon faktörü ETV2'nin doksisiklin ile indüklenebilir ekspresyonunu kullanıyoruz. ETV2, PiggyBac plazmidi yoluyla tanıtıldı ve hücreler daha sonra transfekte edildi.
    1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar besleyici içermeyen pluripotent kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
      NOT: İndüklenebilir iPSC'lerin PiggyBac plazmidi (yani puromisin) seçimi ile korunmasını öneririz
    2. Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri, 10 μM Y27632 ile desteklenmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine 20.800 hücre /cm2'de plakalayın.
    3. 1. Gün: Ortamı DeSR1 [DMEM / F12 + glutamin takviyesi, 1x Minimum Esansiyel Orta Esansiyel Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA),% 1 penisilin-streptomisin (P / S)], 10 ng / mL BMP4, 6 μM CHIR99021 ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiştir.
    4. 3. Gün: Ortamı 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş DeSR2 [DMEM/F12 + glutamin takviyesi, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, %1/S] ile değiştirin.
    5. 5. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR [İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27,% 1 P / S] ile değiştirin.
    6. 7. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR ile değiştirin.
    7. 8. Gün: ECs 1:3'ü bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın.
      NOT: Bu, tek tip vaskülatür oluşumu için EC'leri iBBB'lere kapsüllemek için en iyi zaman noktasıdır.
    8. 10+ Gün: Hücreleri her 2-3 günde bir 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş hECSR ile besleyin. Plakalar birleştiğinde hücreleri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölmeye devam edin.
      NOT: iPSC'den türetilen EC'ler, 8. günden itibaren herhangi bir noktada dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapıyormuş gibi kaldırın. Peletleri EC dondurma ortamında [% 60 nakavt serum replasmanı (KSR),% 30 hECSR,% 10 DMSO, 50 ng / mL VEGF-A ve 10 μM Y27632] hücreleri 1: 3'e bölerek yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
    9. CD31 / PECAM1 veya VE-kaderine karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile beyin mikrovasküler endotel hücre farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2A).
  3. İnsan iPSC'lerinin perisitlere farklılaşması
    Süre: 6 gün
    NOT: Bu protokol Patsch ve ark.36'dan uyarlanmıştır.
    1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
    2. Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 37.000-40.000 hücre/cm2'de (hücre hattına bağlı olarak) 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.
    3. 1. Gün: Ortamı N2B27 [% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x- B-27,% 1 P / S] ile değiştirin 25 ng / mL BMP4 ve 8 uM CHIR99021 ile desteklenmiştir.
    4. 3-4. Günler: Ortamı 2 ng/mL Activin A ve 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27 ile değiştirin ve günlük olarak besleyin.
    5. 5. Gün: PC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 10 ng / mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'de 35.000 hücre /cm2'de % 0.1 jelatin kaplı plakalara tohumlayın.
      NOT: Hücreleri yalnızca birleştikten sonra bölün. Bazı hatların bölünmeye hazır olması için birkaç gün daha gerekebilir; Hücreler birleşene kadar ortamı günlük olarak değiştirmeye devam edin.
    6. Her 2-3 günde bir medya değiştirerek 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'deki PC'leri genişletin. Hücreler bir kez daha birleştikten ve ikinci bir geçişten geçtikten sonra PDGF-BB'yi ortamdan çıkarın.
      NOT: Perisitler, ikinci geçişten sonra iBBB'lerde kullanılmaya hazırdır. Genişletildikten sonra PC'ler dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapacakmış gibi kaldırın, hücre peletini dondurma ortamında [%90 KSR ve %10 DMSO] yeniden süspanse edin ve -80 °C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. N2B27'de 35.000 hücre/cm2'de %0.1 jelatin kaplı plakalar üzerine çözdürün.
    7. PDGFRB ve NG2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile perisit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2B).
  4. İnsan iPSC'lerinin nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) ve astrositlere farklılaşması
    Zamanlama: Toplam 45 gün (NPC'ler için 15 gün, astrositler için 30 gün)
    NOT: NPC farklılaşma protokolü Chambers ve ark.38'den uyarlanmıştır ve astrosit farklılaşması TCW ve ark.39'da açıklandığı gibidir.
    1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
    2. Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 100.000 hücre/cm2'de 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.
    3. Kök hücre ortamını ertesi gün değiştirin. Hücreleri% >95 birleşme noktasına ulaşana kadar (hücre hattına bağlı olarak 3-4 gün) her gün beslemeye devam edin.
    4. NPC Gün 0: Ortamı N2B27 [%50 DMEM/F12 + glutamin takviyesi, %50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1X-B-27, %1 P/S] ile 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile tamamlayın.
    5. NPC Günleri 1-9: Hücreleri günlük olarak 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.
    6. NPC 10. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara tohumlayın.
    7. NPC Günleri 11 - 13: NPC'leri günlük olarak 20 ng/mL FGF-basic ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.
    8. NPC 14. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımıyla 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın.
    9. NPC Gün 15/Astrosit Gün 0: Bu, astrosit farklılaşmasının 0. günüdür. Hücreleri tam Astrosit ortamı () ile besleyin.
      NOT: NPC'ler, 20 ng/mL FGF-bazik ile desteklenmiş N2B27'de tutulabilir ve birleştiğinde geçilebilir. NPC'leri dondurmak için, hücre peletini dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] yeniden süspanse edin, hücreleri 1: 3'e bölün ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 20 ng/mL bFGF ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
    10. Astrosit Günleri 1-30: Hücreleri her 2-3 günde bir ile besleyin. Hücreler %>90 birleştiğinde,'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde 15.000 hücre/cm2'de proteaz-kollajenaz karışımı ve plakası kullanılarak geçiş.
      NOT: Astrositler 30 gün içinde tamamen farklılaşmalıdır. Astrositler, -80 °C'de bir dondurma kabında dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] dondurulabilir. 'de 25.000-35.000 hücre/cm2'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
    11. Nestin ve SOX2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile NPC farklılaşmasını doğrulayın. S100B ve CD44'e karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile astrosit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2C).

2. iBBB'nin montajı

  1. Azaltılmış büyüme faktörü (GF) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. iBBB'ler %100 azaltılmış GF bazal membran matrisi içinde kapsüllendiğinden bu matrisi DMEM'de seyreltmeyin. Her iBBB, 50 μL matris gerektirir.
  2. Farklılaşmış EC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının hECSR'ye (İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, %1 P/S) oranıyla konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini hECSR'de yeniden süspanse edin.
    NOT: 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüp kullanın, bu, ayrışmış hücrelerin ve ortamın hacmini barındıracak kadar büyüktür. Hücreler ayrıca birden fazla tüp arasında bölünebilir ve daha sonra yeniden süspansiyon üzerine yeniden birleştirilebilir.
  3. Farklılaşmış PC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının N2B27'ye 1: 3 oranında konik bir tüpe aktarın (% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x B-27,% 1 penisilin-streptomisin [P / S]). Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini N2B27'de yeniden süspanse edin.
  4. Farklılaşmış astrositleri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, Astrosit Ortamını () tamamlamak için proteaz-kollajenaz karışımının 1:3 oranına sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini'de yeniden süspanse edin.
  5. Bir hemositometre kullanarak her hücre tipini sayın. Her bir hücre süspansiyonu tipini uygun ortamda 1 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
  6. Her hücre tipi için hesaplanan hücre sayısını konik bir tüpte birleştirin: 50 μL iBBB, 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC ve 5 × 104 astrosit gerektirir. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hesaplanan hücre sayısından %10 daha fazlasını ekleyin. Hücre karışımını 300 × g'da 3 dakika döndürün.
    NOT: Giriş hücrelerinin kalite kontrolü için sabitlemek ve boyamak için her hücre tipinden kalan bazı hücrelerin 2D monokültürlerde kaplanması şiddetle tavsiye edilir. Her hücre tipini 35.000 hücre/cm2'de önceden hazırlanmış plakalar üzerine azaltılmış GF bazal membran matrisi ile kaplayın ve 3-4 gün sonra sabitleyin. Hücre tipi spesifik antikorlar için Tablo 1'e bakınız.
  7. Hücre peletinden ortamı aspire edin ve hücre peletinin üzerinde yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın. Bir P200 kullanarak, tek hücreli bir bulamaç oluşturmak için hücre peletini artık ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.
  8. Hücre bulamacını, iBBB başına 50 μL indirgenmiş GF bazal membran matrisinde istenen sayıda iBBB için 10 ng/mL VEGF-A ile desteklenmiş yeterince azaltılmış GF bazal membran matrisinde karıştırın ve hücreleri homojen bir şekilde karıştırmaya özen gösterin.
    NOT: Erken polimerizasyonu önlemek için hücreleri ve azaltılmış GF bazal membran matrisini bu aşamada buz üzerinde tutmak çok önemlidir.
  9. 50 μL azaltılmış GF bazal membran matris karışımını 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabının kuyucuğuna pipetleyin. Hacmi tabağın dibine eşit olarak dağıtın (Şekil 1C).
  10. Azaltılmış GF bazal membran matrisinin polimerize olmasına izin vermek için iBBB'leri 37 °C'de 30-40 dakika inkübe edin ve matristeki hücreleri kapsülleyin.
  11. 10 ng / mL VEGF-A, 5 μg / mL doksisiklin ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş 500 μL ekleyin.
  12. Ertesi gün ortamı 10 ng / mL VEGF-A ile desteklenmiş olarak değiştirin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin. 2 hafta sonra VEGF-A takviyesini bırakın; iBBB'ler 2 hafta sonra aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

3. Aβ fibrilleri ile serebral amiloid anjiyopatinin (CAA) indüklenmesi

  1. PBS'de 200 μM'de amiloid-β1-40 ve amiloid-β1-42 stok çözeltileri hazırlayın.
  2. 2 haftalık iBBB'lerde iBBB ortamına Aβ'yi 20 nM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Hücreleri Aβ takviyeli ortamda 96 saat (4 gün) inkübe edin.
  3. 96 saat sonra ortamı çıkarın ve sabitlemeye devam edin (bölüm 4).

4. iBBB'nin sabitlenmesi ve boyanması

  1. iBBB'yi sabitlemek için ortamı çıkarın, 1 mL PBS'de yıkayın ve gece boyunca 4 °C'de 500 μL %4 paraformaldehit içinde inkübe edin.
  2. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve 1 mL PBS'de 4 x (en az) 15 dakika durulayın.
  3. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.3 PBST (% 0.3 Triton X-100 ile PBS) içinde hafifçe çalkalayarak geçirgenleştirin.
  4. Kültürleri bloke edici tamponda (% 0.3 PBST'de% 5 Normal Serum) oda sıcaklığında en az 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Kullanılan serum tipi, kullanılan ikincil antikorlar için konakçı türe bağlıdır. Örneğin, ikincil antikorlar için konakçı tür keçi ise, normal keçi serumu kullanın; Konakçı tür eşek ise, normal eşek serumu kullanın. Bu aynı zamanda gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.
  5. Birincil antikorları, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin.
  6. Bloke edici çözeltiyi birincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  7. Birincil antikoru çıkarın. İBBB'leri %0,3 PBS'de 3 x 10-20 dakika yıkayın.
  8. İkincil antikoru, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin. Ek olarak, önerilen veya belirlenen konsantrasyonda ikincil antikor çözeltisine Hoechst gibi bir nükleer leke ekleyin.
  9. Son PBS yıkamasını ikincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    NOT: Bu, gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.
  10. PBS'de yıkama başına en az 1 saat boyunca iBBB'leri 4-5x yıkayın. Numuneler görüntülenene kadar PBS veya solma önleyici montaj ortamında 4 °C'de saklayın.
  11. Ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntülemek için, iBBB'leri cam tabanlı plakalarda veya tabaklarda tutun. iBBB'leri yerinde tutmak için camın üzerine bir cam lamel yerleştirin (Şekil 1D).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Düzgün şekillendirilmiş bir iBBB, tek bir yarı saydam diskte katılaşır (Şekil 3A). iBBB'nin birkaç gün sonra ilk pipetlendiği yüzeyden ayrılması normaldir. Bu önlenemez, ancak medyayı değiştirirken yanlışlıkla iBBB'yi aspire etmemek için dikkatli olunursa, iBBB'nin düzgün oluşumu için büyük bir endişe kaynağı değildir. 24 saat sonra, eşit olarak dağılmış, tek hücreler parlak alan mikroskobu altında tanımlanabilir (Şekil 3B). 2 hafta sonra, tanımla ayırt etmek zo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BBB disfonksiyonu bir komorbiditedir ve potansiyel olarak çok sayıda nörolojik hastalıkta bir neden veya şiddetlendirici faktördür 7,40,41. Bununla birlikte, nörovasküler hastalığı olan insanlarda BBB'nin işlev bozukluğu ve parçalanmasının altında yatan moleküler ve hücre biyolojisini incelemek neredeyse imkansızdır. Bu protokolde sunulan indüklenebilir-BBB (iBBB), vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür ile l...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Girişimi, MJFF / ASAP Vakfı ve Amerika Beyin Hasarı Derneği tarafından desteklenmektedir. CG, NIH F31NS130909 tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6e10 amiloid-βantikor BiolegendSIG-393201:1000
Accutase'deYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 ikincil antikorlarInvitrojenÇeşitli1:1000'de kullanılır
Amiloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amiloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antikoruInvitrogenPA5-532341:300'de kullanılır
Astrosit bazal ortam ve takviyeleriScienCell1801
B-27 serum içermeyen takviyeGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM / F12 GlutaMAX ortamıile Gibco10565018
DoksisiklinMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-temelPeprotech100-18B
Fluoromount-G kayar montaj ortamıVWR100502-406
ForskolinR & D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC Nitelikli İndirgenmiş Büyüme Faktörü Baz GibcoA1413302
Cam Alt 48 kuyulu Kültür YemekleriMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX takviyesiGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
İnsan Endotelyal Serum içermeyen ortamGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Esansiyel Orta Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 takviyesiGibco17502048
Nörobazal ortamGibco21103049
Normal Eşek SerumuMillipore-SigmaS30-100mLİkincil antikor konakçısı
Paraformaldehit'e (PFA)ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta) antikoruR& D SistemleriAF3851:500
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Trombosit endotel hücre adezyon molekülü 1) antikoruR& 1:500AF806
PiggyBac plazmidi (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  Katalog #168805
S100B antikoruSigma-AldrichS2532-100uL1:500'de kullanılır
SB43152 Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex2287025uM
Triton X-100'de kullanılır Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-kaderin (CD144) antikoruR& D sistemleriAF9381:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Sistemleri1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Seyreltme = 1:500
kullanılır uygun serum kullanın;Penisilin-Streptomisin Gibco'da Kullanılan D Sistemleri 15140122

Kaynaklar

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vitro ModelPluripotent K k H crelerEndotelyal H crelerAstrosit DiferansiyasyonuPerisit DiferansiyasyonuAmiloid PatolojisiSerebrovask ler Hastal kla TaramaN rodejenerasyon

İlgili makaleler