Erasmus Merdiveni Kullanılarak Farelerde İnce ve İlişkisel Motor Öğrenmenin İzlenmesi

Özet

Bu makale, Erasmus Merdiveni adı verilen bir cihaz kullanılarak, ince motor performansın non-invaziv ve otomatik bir değerlendirmesinin yanı sıra zorluklar üzerine uyarlanabilir ve çağrışımsal motor öğrenmeye izin veren bir protokol sunmaktadır. Görev zorluğu, majörden ince derecelere kadar değişen motor bozukluğunu tespit etmek için titre edilebilir.

Özet

Davranış, eylemlerle şekillenir ve eylemler güç, koordinasyon ve öğrenme gibi motor becerileri gerektirir. Yaşamı sürdürmek için gerekli olan davranışların hiçbiri, bir pozisyondan diğerine geçiş yeteneği olmadan mümkün olmazdı. Ne yazık ki, motor beceriler çok çeşitli hastalıklarda tehlikeye girebilir. Bu nedenle, hücresel, moleküler ve devre seviyelerinde motor fonksiyonların mekanizmalarını araştırmak ve motor bozuklukların semptomlarını, nedenlerini ve ilerlemesini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Fare modelleri bu amaçla sıklıkla kullanılır.

Bu makale, Erasmus Merdiveni adı verilen otomatik bir araç kullanılarak farelerde motor performansın ve öğrenmenin çeşitli yönlerinin izlenmesine izin veren bir protokolü açıklamaktadır. Tahlil iki aşamadan oluşur: farelerin düzensiz basamaklardan oluşan yatay bir merdivende ("ince motor öğrenme") gezinmek için eğitildiği bir başlangıç aşaması ve hareket eden hayvanın yolunda bir engelin sunulduğu ikinci bir aşama. Tedirginlik beklenmedik olabilir ("zorlu motor öğrenme") veya öncesinde işitsel bir ton ("çağrışımsal motor öğrenme") olabilir. Görevin yürütülmesi kolaydır ve otomatik yazılım tarafından tam olarak desteklenir.

Bu rapor, hassas istatistiksel yöntemlerle analiz edildiğinde, testten elde edilen farklı okumaların, küçük bir fare kohortu kullanılarak fare motor becerilerinin iyi izlenmesine nasıl izin verdiğini göstermektedir. Yöntemin, çevresel modifikasyonların neden olduğu motor adaptasyonlarının yanı sıra, motor fonksiyonlarından ödün veren mutant farelerde erken evre ince motor eksikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas olacağını öneriyoruz.

Giriş

Farelerde motor fenotipleri değerlendirmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Her test, motor davranışın belirli bir yönü hakkında bilgi verir¹. Örneğin, açık alan testi genel hareket ve kaygı durumu hakkında bilgi verir; rotarod ve yürüyen kiriş koordinasyon ve denge testleri; Ayak izi analizi yürüyüşle ilgilidir; zorla veya gönüllü fiziksel egzersizde koşu bandı veya koşu tekerleği; Ve karmaşık tekerlek, motor beceri öğrenimi ile ilgilidir. Fare motor fenotiplerini analiz etmek için, araştırmacılar bu testleri sırayla yapmalıdır, bu da çok fazla zaman ve çaba ve genellikle birkaç hayvan kohortu gerektirir. Hücresel veya devre düzeyinde bilgi varsa, araştırmacı normalde ilgili bir yönü izleyen ve oradan takip eden bir testi tercih eder. Bununla birlikte, motor davranışın farklı yönlerini otomatik bir şekilde ayırt eden paradigmalar eksiktir.

Bu makale, farelerde çeşitli motor öğrenme özelliklerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine izin veren bir sistem olan Erasmus Ladder ^2,3'ü kullanmak için bir protokolü açıklamaktadır. Başlıca avantajları, yöntemin tekrarlanabilirliği ve duyarlılığının yanı sıra motor zorluğu titre etme ve motor performanstaki eksiklikleri bozulmuş ilişkisel motor öğrenmeden ayırma yeteneğidir. Ana bileşen, farenin merdiven üzerindeki konumunu algılayan dokunmaya duyarlı sensörlerle donatılmış, alternatif yüksek (H) ve alçak (L) basamaklara sahip yatay bir merdivenden oluşur. Merdiven 2 x 37 basamaktan (L, 6 mm; H, 12 mm) birbirinden 15 mm aralıklı ve 30 mm boşluklu sol-sağ dönüşümlü olarak konumlandırılmıştır (Şekil 1A). Basamaklar, çeşitli zorluk seviyeleri oluşturmak, yani bir engel oluşturmak (yüksek basamakları 18 mm yükseltmek) için ayrı ayrı hareket ettirilebilir. Otomatik bir kayıt sistemi ve basamak modelinin modifikasyonlarını duyusal uyaranlarla ilişkilendiren Erasmus merdiveni, çevresel zorluklara yanıt olarak ince motor öğrenme ve motor performansın adaptasyonunu test eder (bir engeli simüle etmek için daha yüksek bir basamağın görünümü, koşulsuz bir uyaran [US]) veya duyusal uyaranlarla ilişki (bir ton, koşullu bir uyaran [CS]). Test, her biri 4 gün boyunca motor performansındaki iyileşmeyi değerlendiren iki farklı aşamadan oluşur ve bu süre zarfında fareler günde 42 ardışık denemeden oluşan bir seansa tabi tutulur. İlk aşamada, fareler "ince" veya "yetenekli" motor öğrenmeyi değerlendirmek için merdivende gezinmek üzere eğitilir. İkinci aşama, hareket eden hayvanın yolunda daha yüksek bir basamak şeklinde bir engelin sunulduğu aralıklı denemelerden oluşur. Tedirginlik, "zorlu" motor öğrenmeyi (yalnızca ABD'de yapılan denemeler) değerlendirmek için beklenmedik olabilir veya "çağrışımsal" motor öğrenmeyi değerlendirmek için işitsel bir tonla duyurulabilir (Eşleştirilmiş denemeler).

Erasmus merdiveni nispeten yakın zamanda geliştirilmiştir ^2,3. Protokolün kurulması ve optimize edilmesi odaklanmış çaba gerektirdiğinden ve diğer motor eksiklikleri ortaya çıkarma potansiyelini ayrıntılı olarak araştırmadan serebellara bağımlı ilişkisel öğrenmeyi değerlendirmek için özel olarak tasarlandığından yaygın olarak kullanılmamıştır. Bugüne kadar, farelerde serebellar disfonksiyona bağlı ince motor bozuklukları ortaya çıkarma kabiliyeti ile doğrulanmıştır 3,4,5,6,7,8. Örneğin, olivary nöronlarında boşluk bağlantılarının bozulduğu connexin36 (Cx36) nakavt fareleri, elektrotonik eşleşme eksikliği nedeniyle ateşleme açıkları gösterir, ancak motor fenotipinin tam olarak belirlenmesi zordu. Erasmus merdiveni kullanılarak yapılan testler, serebellar motor öğrenme görevinde inferior olivary nöronlarının rolünün, uyaranların kesin zamansal kodlamasını kodlamak ve beklenmedik olaylara öğrenmeye bağlı tepkileri kolaylaştırmak olduğunu göstermiştir ^3,4. Frajil X Sendromu (FXS) için bir model olan Frajil X Messenger Ribonükleoprotein 1 (Fmr1) nakavt faresi, prosedürel bellek oluşumunda daha hafif kusurlarla birlikte iyi bilinen bir bilişsel bozukluk sergiler. Fmr1 nakavtları, Erasmus Merdiveni'ndeki seanslara göre adım sürelerinde, deneme başına yanlış adımlarda veya motor performans iyileşmesinde önemli bir fark göstermedi, ancak yürüme düzenlerini vahşi tip (WT) yavrularına kıyasla aniden ortaya çıkan engele göre ayarlayamadı^ve bu da belirli prosedürel ve çağrışımsal bellek eksikliklerini doğruladı ^3,5. Ayrıca, bozulmuş Purkinje hücre çıkışı, potansiyasyon ve moleküler tabaka internöron veya granül hücre çıktıları dahil olmak üzere serebellar fonksiyonda kusurları olan hücreye özgü fare mutant hatları, verimli adım modellerinin değişmiş edinimi ile motor koordinasyonda ve merdiveni geçmek için atılan adım sayısında problemler sergiledi⁶. Yenidoğan beyin hasarı, serebellar öğrenme eksikliklerine ve Erasmus Merdiveni ^7,8 ile de tespit edilebilen Purkinje hücre disfonksiyonuna neden olur.

Bu videoda, davranış odasının kurulumunu, davranışsal test protokolünü ve sonraki veri analizini ayrıntılarıyla anlatan kapsamlı bir adım adım kılavuz sunuyoruz. Bu rapor, erişilebilir ve kullanıcı dostu olacak şekilde hazırlanmıştır ve özellikle yeni gelenlere yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, motor eğitiminin farklı aşamaları ve farelerin benimsediği beklenen motor kalıpları hakkında fikir verir. Son olarak, makale, protokolün diğer araştırma bağlamlarına uyarlanması ve uygulanması için değerli öneriler ve önerilerle tamamlanmış, güçlü bir doğrusal olmayan regresyon yaklaşımı kullanarak veri analizi için sistematik bir iş akışı önermektedir.

Protokol

Bu çalışmada, her iki cinsiyetten yetişkin (2-3 aylık) C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar, gözlem altındaki bir hayvan ünitesinde yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan kafes başına iki ila beş barındırıldı ve 12 saatlik bir karanlık/aydınlık döngüsünde sıcaklık kontrollü bir ortamda tutuldu. Tüm prosedürler Avrupa ve İspanyol yönetmeliklerine (2010/63/UE; RD 53/2013) ve Generalitat Valenciana Etik Komitesi ve Universidad Miguel Hernández'in hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı.

1. Davranışsal oda kurulumu

1. Davranışsal test odasını her gün aynı saatte rezerve edin ve kullanılacak farelerin listesini ve sırasını ve bunların barındırılması için düzenlemeleri belirleyin.
2. Deney farelerini test odasının dışında tutun, böylece test edilmediklerinde hava kompresörünün ve Erasmus Merdiveni seslerini duymazlar.
3. Erasmus Ladder sisteminin tüm bileşenlerinin düzenli ve kullanıma hazır olup olmadığını kontrol edin: ağ yönlendiricisi, yazılımın bulunduğu bilgisayar (Malzeme Tablosuna bakınız), hava kompresörü, iki hedef kutusu ve basamakları uygun şekilde yerleştirilmiş merdiven.
4. Kale kutularını, merdiveni ve basamakları her hayvandan sonra suyla ve her antrenman gününün sonunda su ve% 70 etanol ile kapsamlı bir şekilde temizleyin.

2. Davranışsal test protokolü

1. Bir deney oluşturun ve protokolü yazılıma girin (Ek Şekil S1).
   1. Yazılımı açın.
   2. Deneme oluşturmak için Dosya | Yeni deney | Yeni veya Kurulum | Deney protokolü.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan varsayılan protokol EMC olarak adlandırılmıştır ve Rotterdam'daki Erasmus Üniversitesi Tıp Merkezi'nde tasarlanmıştır.
   3. Denemeye bir ad verin ve Tamam'ı tıklatın.
   4. Seçilen varsayılan EMC protokolünün 4 günlük kesintisiz oturumlardan (günde 42 kesintisiz deneme) ve 4 günlük meydan okuma oturumlarından (42 günlük karma deneme: bozulmamış, yalnızca CS (ton), yalnızca ABD (engel), Eşleştirilmiş (tonla duyurulan engel) oluştuğunu kontrol edin (bkz. Şekil 1B). Sağ taraftaki panelde, fareyi merdiveni geçmeye teşvik etmek için kullanılan ışık işaretini (maksimum 3 sn süre), hava işaretini (maksimum 45 sn maksimum süre) ve arka rüzgarı (tüm deneme türlerinde Evet) ve tonu (250 ms, Yalnızca CS ve Eşleştirilmiş denemelerde Evet) kontrol edin.
   5. Farklı bir protokol oluşturmak için Kurulum | Deney protokolü | Yeni | Sıfırdan veya EMC protokolünden kopyalayın ve basitçe değiştirin, oturum sayısı (deney günleri) ve günlük deneme sayısı ve türü ile ilgili tablo satırlarını düzenleyin.
      NOT: Dinlenme süresi, ipucu tipi ve aktivasyonu, süre, yoğunluk ve aralık da deneysel sorulara göre uyarlanabilir.
   6. Oturum listesini açmak ve konuları adlandırmak için Kurulum | Oturum Listesi.
   7. Konu ve değişken ekle'ye tıklayın.
   8. Sıralı fare listesini takip ederek her bir Fare Tanımlayıcısını, Doğum Tarihini, Cinsiyeti, Genotipi ve ilgili kategorileri girin.
2. Oturumu başlatın (Ek Şekil S2).
   1. Başlamadan önce yazılımın açık olup olmadığını kontrol edin, ardından Merdiveni açın.
   2. Hava kompresörünün bağlı ve açık olduğunu kontrol edin.
   3. Edinme penceresini açmak için Oluşturulan Deneme'yi açın.
   4. Satın Alma Seçin | Açık Satın Alma.
   5. Fareyi, yazılım tarafından belirtilen tanımlayıcı ile başlangıç hedefi kutusuna (merdivenin sağ tarafı) yerleştirin.
   6. İlk oturumda alınacak fare tanımlayıcısını seçin.
   7. Edinmeyi Başlat'a tıklayın.
   8. Kırmızı merdiven menü düğmesine 3x basın. Oturumun başladığını kontrol edin ve oturumun son denemesinin sonuna kadar fare hareketlerini otomatik olarak kontrol eder ve kaydeder.
3. Oturumu sonlandırın.
   1. 42^{. denemenin} sonunda, ekranın Veri Gönderiliyor ve Alındı mesajlarının gösterildiğini kontrol edin.
   2. Fareyi ev kafesine geri koyun.
   3. Merdiveni ve gol kutularını temizleyin.
   4. Sonraki fareyi yerleştirin ve 2.2.6 adımından itibaren tekrarlayın.
4. Protokolün sonuna kadar her gün seçilen oturum türünü gerçekleştirin. Seçilen protokole göre her gün 2.2 ve 2.3 adımlarını tekrarlayın.
5. Verileri dışa aktarın (Ek Şekil S2).
   1. Kaydedilen verileri görselleştirmek için Analiz menüsünden, Deneme İstatistikleri'nden, Oturum istatistiklerinden ve Grup İstatistikleri ve Grafikler'den seçim yapın.
      NOT: Veriler, bireysel denemeler için verileri ve bir oturum içindeki aynı deneme türlerinin araçlarını içeren bir elektronik tablo olarak indirilebilir. Oturumlar, belirli analizler için seçilen değişkenlere göre de filtrelenebilir.
   2. Dosya biçimini (elektronik tablo) ve klasör konumunu seçerek sağ üst köşedeki Dışa Aktar düğmesine tıklayın.
   3. Otomatik olarak oluşturulan grafiklere sağ tıklayın ve Dosyaya Farklı Kaydet'i *.jpg.

3. Veri analizi

NOT: Dokunmaya duyarlı sensörlerin faaliyetlerinin anlık kaydına dayalı olarak Erasmus Merdiveni tarafından bir parametre listesi otomatik olarak ölçülür. Analiz için, kullanıcı tarafından seçilen çıktı parametreleri elektronik tablolarda düzenlenir ve işlenir. Yazılım tarafından oluşturulan grafiklerin yanı sıra, kullanıcılar, oturumlar boyunca farklı parametrelerdeki belirli değişiklikleri görselleştirmek için tercih ettikleri grafik yazılımını kullanarak grafikler oluşturabilir.

1. İlk 4 gün boyunca bazal motivasyon veya kaygı durumlarını, duyusal tepkileri, motor performansı ve ince motor öğrenmeyi analiz etmek için belirli parametreleri seçin.
   1. Işık ve hava ipuçlarına yanıt olarak kale kutusundaki dinlenme süresi ve dinlenme süresinden sonra kale kutusundan çıkma süresi dahil olmak üzere kontrol parametrelerini seçin ve çizin (Şekil 2A).
      NOT: WT farelerinde dinlenme süreleri veya ipuçlarına verilen yanıt nispeten sabittir. Çıkış sıklığı gibi diğer parametreler, WT farelerinde temel olarak ihmal edilebilir düzeydedir - hayvanlar nadiren dinlenme kutusunu ipuçları olmadan terk eder veya merdivende bir kez geri gelir, bu da çıkış frekanslarının deneme başına 1'e eşit olmasına neden olur. İşaretler uygulanmadan önce bir hayvan dışarı çıkarsa, fareyi kale kutusuna dönmeye zorlayan bir hava akımı etkinleştirilir; Bu, yazılım tarafından deneme olarak sayılmaz.
   2. Fare hedef kutusundan ayrıldıktan sonra merdiveni geçmek için harcanan süre olarak ölçülen, ipuçlarından sonra merdivende geçirilen süreyi seçin ve çizin (Şekil 2B).
      NOT: Doğrusal olmayan bir güç regresyon, öğrenmeyi değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir. Pearson veya Spearman katsayıları (R), veri uyumunun iyi olup olmadığının bir ölçüsünü sağlayacaktır (hayvanlar seanslar boyunca öğrendiğinde/geliştiğinde R değerleri bire yakındır; 0'a yakın R değerleri, verilerin sabit olduğunu ve farelerin öğrenmediğini gösterir).
   3. Hassas bir öğrenme parametresi olarak yanlış adımlarla denemelerin yüzdesi gibi adım paterni parametrelerini seçin ve çizin (Şekil 2C).
      1. Doğru adımı, adımın uzunluğundan bağımsız olarak, yüksek bir basamaktan başka bir yüksek basamağa (H) adım olarak tanımlayın. Daha düşük bir basamak içeren adım türlerini yanlış adımlar olarak düşünün.
      2. Doğru adımları ve yanlış adımları, basılan basamaklar arasındaki adımın uzunluğuna ve yönlülüğüne bağlı olarak kısa ve uzun adımlara, geri adımlara ve sıçramalara bölün (bkz. Şekil 1A).
2. Son 4 gün içinde zorlanan motor öğrenmeyi (yalnızca ABD denemeleri) ve ilişkisel öğrenmeyi (eşleştirilmiş denemeler) değerlendirmek için belirli parametreleri seçin ve çizin.
   1. İpuçlarından sonra merdivendeki zamanı seçin ve çizin (Şekil 3).
   2. Yanlış adımlarla denemelerin yüzdesini seçin ve çizin (Şekil 4A).
   3. Merdivenin aynı tarafındaki engelden hemen önce (kontrol adımı) ve sonra (uyarlanmış adım) basamak aktivasyonu arasındaki ms hassasiyet farkı olarak tanımlanan pertürbasyon öncesi ve sonrası adım sürelerini seçin ve çizin (Şekil 4B).
      NOT: Her bir oturum türündeki verileri karşılaştırmak için pertürbasyon öncesi ve sonrası adım süreleri analizi yapılmalıdır. Parametre, farelerin ilişkisel öğrenme sırasındaki engelleri tahmin etme ve üstesinden gelme yeteneğini ölçer.
3. Verileri özel istatistiksel yazılımla (örneğin, SigmaPlot) analiz edin. Öğrenme sürecini daha verimli bir şekilde tanımlamak için oturumlar arasında aynı deneme türünden toplanan verilerin doğrusal olmayan bir regresyon analizini gerçekleştirin ve deneme türleri arasında karşılaştırma yapmak için İki Yönlü Tekrarlanan Ölçümler (RM) ANOVA'sını kullanın.

Sonuçlar

Erasmus Ladder cihazı, kurulumu ve uygulanan protokol Şekil 1'de sunulmuştur. Protokol, dört kesintisiz ve dört meydan okuma oturumundan (her biri 42 deneme) oluşur. Her deneme, başlangıç ve bitiş hedef kutuları arasındaki merdivende bir koşudur. Oturumun başlangıcında, başlangıç kutularından birine bir fare yerleştirilir. 15 ± 5 sn ("dinlenme" durumu) ayarlanan bir süreden sonra ışık yanar (işaret 1, maksimum 3 sn için). Daha sonra fareleri kutudan çıkmaya ve karşı uca yürümeye teşvik etmek...

Tartışma

Erasmus Merdiveni, motor fenotip değerlendirmesi için mevcut yaklaşımların ötesinde büyük avantajlar sunmaktadır. Testin yapılması kolaydır, otomatikleştirilir, tekrarlanabilir ve araştırmacıların tek bir fare kohortu kullanarak motor davranışın çeşitli yönlerini ayrı ayrı değerlendirmesine olanak tanır. Mevcut çalışmada, tekrarlanabilirlik, cihazın özelliklerinden, deneysel tasarımdan ve analiz yöntemlerinden yararlanan az sayıda WT faresi ile sağlam verilerin üretilmesine izin verdi. Örneğin, geleneksel ışın yürüyüşü t...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6J fareler (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder cihazı	Noldus, Wageningen, Hollanda
Erasmus Ladder 2.0 yazılımı	Noldus, Wageningen, Hollanda
Excel yazılımı	Microsoft
Sigmaplot yazılımı	Systat Yazılım A.Ş.