Faj ve Robotik Destekli Neredeyse Sürekli Evrim için Pratik Bir Kılavuz

PRANCE, iki güçlü yönlendirilmiş evrim tekniğinin birleşimidir. Birincisi, gen çeşitlendirme ve seçilim turlarını M13 bakteriyofajının hızlı yaşam döngüsüne bağlayan ve sıvı faj kültüründe sürekli olarak hızlı evrim turlarının gerçekleşmesini sağlayan moleküler bir teknik olan PACE^1'dir. Bu seçim, evrimleşen proteinin işlevini, faj yayılımı için gerekli olan M13'ün kuyruk kaplama proteini olan pIII'ün ekspresyonuna bağlayan plazmid kodlu bir gen devresinin kullanılmasıyla yönlendirilir, bu Şekil 1'de gösterilmiştir. Deneysel düzeyde, sıvı faj kültürünün sürekli seyreltilmesi, sürekli seçime izin verir. Bu nedenle, seçim sıkılığı hem gen devresi düzeyinde hem de faj kültürü seyreltme hızı kontrol edilerek deneysel düzeyde modüle edilebilir. Bu nedenle PACE, pIII ekspresyonunu indüklemek için E. coli bakterilerinde istenen aktiviteyi tespit edebilen bir moleküler sensörün bulunduğu herhangi bir biyomolekül mühendisliği zorluğuna uygulanabilir. Uygulamalar, protein-protein bağlanmasının ^2,3,4, protein-DNA bağlanmasının⁵, protein çözünürlüğünün⁶ ve çok sayıda spesifik enzimatik fonksiyonun⁷ evrimini içerir. İkincisi, yönlendirilmiş evrimin iki yaygın başarısızlık modunu ortadan kaldırmak için bir geri bildirim denetleyicisi kullanan Robotik hızlandırmalı Evrim ^8,9'dur: çevre çok katı olduğunda meydana gelen yok olma ve çevre çok yumuşak olduğunda ortaya çıkan evrim eksikliği. PANCE'de (Faj Destekli Sürekli Olmayan Evrim)^7,10'da yapıldığı gibi fajın seri geçişinden farklı olarak, Robotik hızlandırmalı "neredeyse sürekli" evrim, kültürleri orta log fazında tutan ve popülasyonların sürekli enfeksiyon ve yayılma döngüleri yaşamasına izin veren hızlı pipetlemeyi içerir. Bu iki teknoloji birlikte kullanıldığında, sağlam, çoğullanmış ve hızlı sürekli evrim sağlayan Faj ve Robotik destekli Yakın Sürekli Evrim⁸ için PRANCE olarak adlandırılırlar. PRANCE, polimerazları, tRNA'ları ve amino-asil tRNA sentetazlarını geliştirmek ve bu evrimler sırasında hızlarını ve güvenilirliklerini artırmak için geri besleme kontrolü yapmak için kullanılmıştır⁸.

Bir sıvı işleme robotunda bakteriyofaj kullanımını sağlayan PRANCE için donanım ve yazılım kurulumunun birkaç ayrıntısı vardır. Robot üreticisi tarafından sağlanan varsayılan yazılımı kullanmak yerine, hızlı, eşzamanlı yürütmeyi ve böylece yarı sürekli biyoreaktörleri orta log fazında tutma yeteneğini sağlayan python tabanlı açık kaynaklı bir yazılım paketi¹¹ kullanıyoruz. Araştırmacının elden çıkarma süresi, güvertedeki birkaç bileşenin rutin olarak kendi kendini sterilize etmesiyle birkaç güne kadar uzatılabilir ve bu, bu bileşenleri ağartabilen ve durulayabilen pompaların otomatik kontrolü ile elde edilir. Faj çapraz kontaminasyonu, zorla takılan uçlar kullanmayan bir sıvı işleme robotunun kullanılması ve sıvı işleme ayarlarının dikkatli bir şekilde ayarlanmasıyla ortadan kaldırılabilir.

1. Donanım kurulumu

NOT: Bir PRANCE sisteminin donanım bileşenlerine genel bir bakış için Şekil 2'ye ve bu bileşenlerin fiziksel olarak monte edilmiş fotoğrafları için Şekil 3'e bakın.

1. Bir sıvı taşıma cihazı, bir plaka okuyucu ve yardımcı pompalar dahil olmak üzere PRANCE sistemi için birincil donanımı edinin.
   NOT: Bugüne kadarki tüm PRANCE sistemleri, 8 kanallı, ayrı ayrı adreslenebilir pipetleme kolları, tek pistonlu 96 uçlu pipetleme kolu, hareketli plakalar için robotik tutucu, uç sterilizasyonu için entegre bir yıkama istasyonu ve absorbans ve lüminesans ölçümleri yapabilen entegre bir plaka okuyucu ile donatılmış Orta ila Büyük Boy sıvı işleme cihazlarına uygulanmıştır.
2. Sıvı işleme robotunun modeline ve özelliklerine bağlı olarak ısıtma stratejilerini yapılandırın. Isıtmalı bir plaka taşıyıcı veya ısıtıcı aracılı robot klima kontrolü kullanın.
3. Ucun yeniden kullanılmasına izin vermek için bir uç yıkama istasyonu kurun.
   NOT: Bugüne kadar, PRANCE sistemleri kullanıma hazır yıkama istasyonları kullanmıştır, ancak prensip olarak bu bileşen düşük maliyetli bileşenlerden kolayca yapılabilir.
4. Kemostat/türbidotat olarak 37 °C'de çalışan gerçek zamanlı bir biyoreaktör kurarak log fazında tutulan bir bakteri kültürü kaynağı oluşturun. Alternatif olarak, yakındaki bir buzdolabında 4 ° C'de log fazında (0,25 ile 0,45 arasında OD₆₀₀ ) 37 ° C'de önceden yetiştirilmiş en az 1 L hacimli bir log faz bakteri kültürünü tutuklayın. İster soğutulmuş ister ılık olsun, çökelmeyi önlemek için kültürün bir çalkalayıcı plaka veya karıştırma plakası kullanılarak düzenli olarak karıştırıldığından emin olun.
5. Gerekli yazılım ve sürücülerle robotik entegrasyon için tercih edilen pompaları yapılandırın. Pompaların 10-100 mL mertebesinde tanımlanmış miktarlarda sıvı vermesini sağlamak için yazılımı uygulayın.
   NOT: Bu uygulamada kullanılan pompalar için Malzeme Tablosuna ve bu pompaları çalıştırmak için kullanılan yazılım ve bunların nasıl yapılandırılacağına ilişkin belgeler için üreticinin web sitesine bakın. Bu el yazmasında gösterilen PRANCE kurulumunda kullanılan pompalar için bu tür bir yazılım, aşağıdaki GitHub deposunda açık kaynak olarak sağlanmaktadır https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE, üç ayrı kanalı pompalayabilen en az üç pompalı bir manifold gerektirir (bakterileri bakteri rezervuarına iletin, çamaşır suyunu bakteri rezervuarına iletin ve bakteri rezervuarını boşa boşaltın), her birinin hızı kalibre edilmiş ve bağımsız olarak kontrol edilmiştir. Geçmişte, insanlar akvaryum pompaları ve hidroponik pompa dizileri kullandılar, ancak prensipte herhangi bir piton kontrollü peristaltik pompa kullanılabilir. Temel işlevler arasında, plakaları okuyucunun içine veya dışına aktarmak, bir plaka okuyucu ölçümü başlatmak ve ölçümlere erişmek için bir robot tutucu kullanma yeteneği yer alır.
6. Ek Dosya 1'de (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link) bulunduğu gibi, en azından bakteri rezervuarı/dağıtım manifoldu ("waffle") dahil olmak üzere PRANCE sistemi için gerekli özel güverte bileşenlerini 3D Yazdırın. Bu konteynerleri güverteye sabitleyin ve standart Sıvı Taşıma Robotu yazılımını kullanarak konumlarını kalibre edin. Rezervuarı pompa dizisine bağlayın.
   NOT: Robota bağlı olacağından kalibrasyonun nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılar için robot üreticisinin belgelerine bakın. Reçine bazlı 3D yazıcılar en uygun olanlardır; kullanılan yazıcı tipine bir örnek Malzeme Tablosunda verilmiştir; Varsayılan yazıcı ayarlarıyla standart şeffaf reçine kullanılmıştır.
7. Sistemi yerel biyogüvenlik önerileriyle uyumlu bir tahliye ile donatın.
8. Laboratuvar gereçlerini Şekil 4'te örneklendiği gibi Sıvı Taşıma Robotunun güvertesine yerleştirin.
9. Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipmanlarının (örn. laboratuvar önlüğü, eldivenler ve göz koruması) kullanımı da dahil olmak üzere standart güvenlik prosedürlerini izleyin.

2. Yazılım hazırlığı

1. Açık kaynaklı PyHamilton deposunda bulunan python¹¹ ile Sıvı İşleme robotlarını kontrol etmek için kullanılan açık kaynaklı yazılımı yükleyin. https://github.com/dgretton/pyhamilton
2. Şekil 4'te gösterildiği gibi, robot güvertesindeki laboratuvar yazılımı konumlarını doğru bir şekilde yansıtmak için Sıvı Taşıma robot yazılımı için güverte düzenini değiştirin ve kalibre edin.
   NOT: Burada kullanılan kurulum, sağlanan belgelere göre sıvı işleme robotunun üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanır.
3. PRANCE robot metot programını simülasyon modunda çalıştırın.
   1. Komut Satırını, Şekil 5'te gösterildiği gibi aşağıdaki komutlarla (Windows işletim sisteminde) açın.
      Windows tuşu + R
      Girin: cmd
   2. Üst dizini robot yöntem programının dizinine değiştirin. Şekil 5'te gösterildiği gibi doğru yolla aşağıdaki gibi bir komut girin.
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   3. Şekil 5'te gösterildiği gibi simülasyon modu bayrağıyla Python ile robot yöntemi programını çağırın.
      py robot_method.py --benzetim
   4. Program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Çalıştırma Kontrolü penceresinin sol üst köşesindeki OYNAT düğmesini seçin (Şekil 5).
      NOT: İlerlemeden önce PRANCE yönteminin simülasyonda hatasız çalışabildiğinden emin olun. Komut dosyasının simülasyon modunda hatasız çalışıp çalışamayacağı belli olur, çünkü ana program döngüsünü sonlandıran sistemin hata işleme çağrılmadan ana programın birden çok döngüsünü tamamlayacaktır.
4. PRANCE robot metodu programını simülasyon modu devre dışıyken çalıştırın.
   1. Komut Satırı'nı uygun dizinde açın (Şekil 5).
      Windows tuşu + R
      Girin: cmd
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   2. Bayraklar olmadan Python ile robot yöntemi programını çağırın:
      py robot_method.py
   3. Program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Run Control penceresinin sol üst köşesindeki PLAY düğmesini seçin.
   4. PyHamilton'un cihazı kontrol edebildiğini ve başlatılmasını sağlayabildiğini onaylayın.
5. Gerçek zamanlı veri senkronizasyonu kurun.
   NOT: Bugüne kadar, PRANCE sistemleri, kullanıcıların günlük dosyalarını ve gerçek zamanlı plaka okuyucu ölçüm grafiklerini uzak dosya paylaşım yazılımı veya uzak bir masaüstü aracılığıyla izlemesine olanak tanıyan ağa bağlı bilgisayarlar kullanmıştır.
6. Otomatik güncellemeleri kapatın.

3. Koşu öncesi hazırlık

1. Planlanan çalışma için gerekli tüm kültürler için log fazında bakteri kültürü kaynaklarının mevcut olduğundan ve çökelmeyi önlemek için aktif olarak karıştırıldığından emin olun. Aktif bir kemostat/türbidostat veya büyümeyi durdurmuş, soğutulmuş, önceden yetiştirilmiş bir kültür kullanın.
2. Denetleyici bildirim dosyasını, program döngüsü başına 96 kuyulu lagünün her bir kuyucuğuna hangi hacmin (aralık 0-500 μL) pompalanacağının ayrıntılarıyla güncelleştirin. Bu, etkili lagün seyreltme oranının hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Bu, Şekil 6'da görülebilir.
   1. Şekil 2'de görüldüğü gibi DilutionCalculator.xlsx elektronik tablosunu (Ek Dosya 7 olarak sağlanır) kullanarak lagünün Seyreltme oranını hesaplayın.
3. robot_method.py dosyasını hedeflenen lagün yüksekliğiyle güncelleştirin. Bu protokolü takip etmek için, programdaki fixed_lagoon_height değişkeni için varsayılan değer olarak 14'ü (milimetre birimi cinsinden) kullanın. Bu, sistemde 550 μL'lik bir lagün hacmine karşılık gelir, ancak kullanılan belirli 96 derin kuyu plakasına bağlı olarak farklılık gösterebilir.
4. Temiz filtreli pipet uçlarını belirlenen konumlarında robot güvertesine yerleştirin ve çalışma sırasında dengeyi sağlamak için uç raflarını uç tutuculara bantlayın.
5. Temiz 96 derin kuyulu plakaları belirlenen konumlarında robot güvertesine yerleştirin.
6. Temiz 96 kuyulu okuyucu plakalarını belirlenen konumlarında robot güvertesine yerleştirin.
7. Plaka okuyucu tepsisinin önceden var olan bir plaka tarafından işgal edilmediğinden emin olun.
8. Pompaların bilgisayara bağlı olduğundan ve doğru adrese atandığından emin olun.
9. Çamaşır suyu ve ardından su pompalamak için pompaları etkinleştirerek pompa hatlarını temizleyin.
10. Pompa hatlarını uygun kaynaklara ve çıkışlara bağlayın, doğru hatların ilgili bakteri kültürlerine bağlandığından emin olmak için çok dikkat edin.
11. Bakteri haznesi ve pipet ucu yıkama için ağartıcı/su içeren tankları/kovaları yeniden doldurun.
12. Güvertedeki tüm bileşenlerin, özellikle hareketli elemanların belirlenen konumlarında sabitlendiğinden emin olun.
13. Isıtıcıları yerel uygulamaya göre hedef sıcaklığa (yani 37 °C; Şekil 8).
14. UV Sterilizasyon Protokolünü çalıştırın file yerleşik UV sterilizasyon lambasını üretici tarafından sağlanan sıvı işleme robotlarında çalıştırmak için 9 dakika boyunca (Şekil 9).
    1. Program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Run Control penceresinin sol üst köşesindeki PLAY düğmesini seçin.
    2. Dosyayı 600 s boyunca parametrelendirilmiş seçenekle çalıştırın.
15. Robot Run Control yazılımının kapalı olduğundan emin olun.
    NOT: Run Control yazılımının çalışan mevcut herhangi bir örneği varsa, robot yöntemi programı çökecektir.

4. Donanım ve yazılım entegrasyonu

1. PRANCE robot metot programının, tüm kültürler ve ıslak reaktifler yerine su ikame edilerek gece boyunca çalıştırıldığı bir 'su çalışması' gerçekleştirin.
   NOT: Bu test oda sıcaklığında yapılabilir.
   1. Şekil 1 ve Şekil 5'da gösterildiği gibi etkili bir lagün seyreltme hızı için controller_manifest ve robot_method kurulumu ile yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalışma öncesi hazırlığı tamamlayın.
   2. Su akışı için log fazındaki bakterileri değiştirmek için 'bakteri girişi' hattını bir su kabına bağlayın.
      NOT: Deney boyunca sıvı hareketini izlemek için su kaynaklarına gıda boyası eklenebilir.
   3. Komut Satırını uygun dizinde açın.
   4. Python ile robot yöntemi programını yeni çalıştırma bayrağıyla (py robot_method.py --new) çağırın ve günlük dosyası adı (TestRun), lagün kuyusu sayısı (16), döngü süresi (30), okuyucu plakası ölçümü başına döngü sayısı (4) ve indükleyici hacmi (indükleyici hacmi 0'dır ) dahil olmak üzere istenen argümanları girinBu test çalıştırması için μL, mutajenezin arabinoz ile indüklendiği bir evrim sırasında, Şekil 5'te gösterildiği gibi bu değer 10 μL olabilir.
   5. Argümanlar sağlandıktan sonra program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Çalıştırma Kontrolü penceresinin sol üst köşesindeki OYNAT düğmesini seçin.
      NOT: PRANCE yöntemi, boş bir lagün plakası kullanılarak başlatılabilir ve lagünlerin sıvı hacmi, ilk altı döngü boyunca nihai hacme dengelenecektir.
2. PRANCE protokolünün gece boyunca sadece hedef sıcaklıkta bakteri kültürü ile çalıştırıldığı, ancak bakteriyofaj olmadan çalıştırıldığı bir 'yalnızca bakteri çalışması' gerçekleştirin.
   1. Şekil 1 ve Şekil 5'da gösterildiği gibi, etkili bir lagün seyreltme oranı için controller_manifest ve robot_method kurulumu ile yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalışma öncesi hazırlığı tamamlayın. Isıtıcıların 37 °C hedef sıcaklık için açık olduğundan emin olun.
   2. 'Bakteri girişi' hattını seçilen log faz bakteri kaynağına bağlayın.
   3. Komut Satırını uygun dizinde açın.
   4. Python ile robot yöntemi programını yeni run bayrağıyla (py robot_method.py --new) çağırın ve daha önce bölüm 4.1.4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi istenen bağımsız değişkenleri girin.
   5. Argümanlar sağlandıktan sonra program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Çalıştırma Kontrolü penceresinin sol üst köşesindeki OYNAT düğmesini seçin.
3. Evrimleşmiş bir protein taşıyan fajların, bu proteine ihtiyaç duyan bakteriler üzerinde çoğalmaya zorlandığı bir 'enfeksiyon testi' yapın.
   NOT: Hangi lagünlerin fajla aşılanacağına ve hangi lagünlerin aşılanmayacağına önceden karar verin ve böylece çapraz kontaminasyonu tespit etmek için fajsız kontrol lagünleri olarak hizmet edin.
   1. Şekil 1 ve Şekil 5'da gösterildiği gibi, controller_manifest ve robot_method ayarlanmış 5 hacim/saatlik etkili bir seyreltme oranı ile yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalışma öncesi hazırlığı tamamlayın. Isıtıcıların 37 °C hedef sıcaklık için açık olduğundan emin olun.
   2. 'Bakteri girişi' hattını seçilen log faz bakteri kaynağına bağlayın.
   3. Komut Satırını uygun dizinde açın.
   4. Python ile robot yöntemi programını yeni run bayrağıyla (py robot_method.py --new) çağırın ve daha önce bölüm 4.1.4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi istenen bağımsız değişkenleri girin.
   5. Argümanlar sağlandıktan sonra program yürütüldüğünde açılacak olan Robot Çalıştırma Kontrolü penceresinin sol üst köşesindeki OYNAT düğmesini seçin.
   6. Bakteriyofaj eklemeden önce, lagün plakalarındaki hacmi ve bakteri OD'sini dengelemek için yöntemi 2-3 saat çalıştırın.
   7. Program uyurken bir çalışma döngüsünün sonunda fajlı lagünleri 10⁶ pfu/mL bakteriyofaj ile aşılayın (ör., plak tahlili veya qPCR ile belirlendiği gibi 10⁸ pfu/mL'de 5,5 μL faj alikot), 550 μL'lik bir lagüne.
   8. Programı gece boyunca çalıştırın ve ardından lagün kuyularındaki faj titresini plak testi veya qPCR ile kontrol edin.

Enfeksiyon testi sonuçları
Bu test, bakteri kültürü, faj klonlama ve titre, ekipmanın sıcaklık kararlılığı, sıvı işleme ayarları ve plaka okuyucu entegrasyonu ile ilgili sorunları ortaya çıkaracaktır. Başarılı bir faj enfeksiyonu testi, fajla aşılanmış lagünlerde net ve hızlı faj enfeksiyonunu ortaya çıkaracak ve fajsız lagünlerde sinyal olmadığını ortaya çıkaracaktır. Şekil 10 , bir faj enfeksiyonu testinin bazı temsili sonuçlarını göstermektedir. Deneysel sonuçlar, bir "sıcak PRANCE" (canlı bir bakteri türbidotadı ile beslenir) veya "soğuk PRANCE" (soğutulmuş orta log faz kültürü ile beslenir) konfigürasyonunun uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak, bu PRANCE makalesi8'in Şekil 1d ve 1c ile de karşılaştırılabilir. Bu test birkaç yaygın sorunu ortaya çıkarabilir. Bakteri kültürü hazırlığı ile ilgili sorunlar genellikle zayıf veya eksik enfeksiyona neden olabilir. Bakteriler sadece orta log fazında ve 37 °C'de M13 faj tarafından en iyi şekilde enfekte edilebilir. Diğer sıcaklıklarda ve büyüme aşamalarında, daha zayıf pilus ekspresyonu sergilerler ve bu nedenle faj enfeksiyonuna karşı daha az hassastırlar12. Düşük titreli faj veya omurga mutasyonları olan faj ile aşılama, sinyalin gecikmesine veya yokluğuna neden olabilir. Floresan veya lüminesans için plaka okuyucu kazanç ayarlarıyla ilgili sorunlar bu testle ortaya çıkacaktır.

Şekil 1: PRANCE cihazının enfeksiyon testi çalıştırması sırasında çalışan genetik devrenin şeması. Faj genomunda kodlanan T7 RNA polimeraz, Escherichia coli konakçısını enfekte ettiğinde, kopyalanır ve T7 promotöründeki AP'ye bağlanır, bu da pIII faj proteininin ve luxAB proteininin transkripsiyonuna yol açar ve bu da faj yayılımını ve lüminesans üretimini kolaylaştırır. Kısaltmalar: PRANCE = Faj ve Robotik Destekli Yakın Sürekli Evrim; AP = aksesuar plazmid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PRANCE sisteminin fiziksel bileşenlerinin şeması. Bir buzdolabı, karıştırılmış kültürleri depolar ve bunlar daha sonra bir dizi pompa tarafından robot güvertesine, bakteri rezervuarına, "waffle"a taşınır. Sıvı işleme robotu, pipetleme kafasını kullanarak bakteri kültürlerini "waffle"dan inkübasyon sıcaklığına kadar ısıtmak için bekletme kuyularına ve ardından ana inkübasyonun gerçekleştiği lagünlere taşımak için kullanılır. Hem bekletme kuyuları hem de lagünler standart 2 mL derin kuyu plakalarıdır. Robot, numuneleri tek kullanımlık okuyucu plakalarına alır ve bunlar da ölçüm için bir plaka okuyucuya taşınır. Kısaltma: PRANCE = Faj ve Robotik destekli Yakın Sürekli Evrim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: PRANCE robot aparatı. (A) PRANCE kurulumu. (I) HEPA filtre ve harici ısıtıcı. (II) Kültür buzdolabı. (III) Ana robot muhafazası. (IV) Plaka okuyucu. (V) Pompalar ve tanklar. (B) Robot muhafazası. (VI) Ana kültür pompaları. (VII) Su, atık ve çamaşır suyu tankları. (VIII) Yıkayıcı pompaları. (C) Robot muhafazası. (IX) Robot pipetleme kolu ve tutucu. (X) Pipet uçları. (XI) Robota kültür dağıtımına izin vermek için 3D Baskılı bileşen ("waffle"). (XII) Plaka okuyucuda numune almak için plakalar. (XIII) Uç yıkama kovaları. (XIV) "Lagünler": evrimsel kültürün gerçekleştiği kültür kapları. Kısaltmalar: PRANCE = Faj ve Robotik Destekli Yakın Sürekli Evrim; HEPA = yüksek verimli partikül hava. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Güverte Düzeni. (A) Robot kontrol yazılımında güverte düzeninin 3D gösterimi. (B) Güverte bileşenlerinin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Örnek parametreler (yukarıda) ve çalıştırma kontrol yazılımı (aşağıda) içeren komut satırının ekran görüntüsü. Oynat düğmesi sol üstte bulunur ve yerel uygulamaya bağlı olarak bir fare ile tıklanabilir veya dokunmatik ekranla çalıştırılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Test çalıştırmaları için yapılandırılan denetleyici bildirim dosyası. Kültür #0 içeren lagünler, 96 derin kuyu plakasının 1. ve 3. sütunlarında olacaktır. Kalan sütunlar boş olacaktır. 96 derin kuyu plakasının A, B, D ve E satırları faj (1) enfeksiyonu için sağ sütunda işaretlenmiştir, diğer satırlar (0) fajsız kontrollerdir. Denetleyici bildiriminin bu örneği, programın lagünü her döngüde 210 μL kültürle seyreltmesine neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Seyreltme Hesaplayıcı Elektronik Tablosu kullanılarak etkin lagün seyreltme oranının hesaplanması. DilutionCalculator elektronik tablosu için Ek Dosya 2'ye bakın. Bu şekilde görüldüğü gibi, her 30 dakikalık döngüde bir 210 μL taze kültür ile seyreltilen 550 μL'lik bir lagün, her dört döngüde bir okuyucu plakası ölçümü için 150 μL numune alınırken, 1.0 lagün hacmi/saat'lik etkili bir seyreltme oranına karşılık gelecektir (her 1 saatten sonra, saatin başlangıcındaki orijinal lagün sıvısının P'si kalacaktır) Bunun daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın şekil.

Şekil 8: Robot ısıtıcı sistemi. Isıtıcı, kırmızı daire ile gösterildiği gibi güç kaynağına takılarak etkinleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: UV dekontaminasyon protokolünün ayarları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: PRANCE sisteminde çalıştırılan bir enfeksiyon testinin ölçümü. Çalışma sırasında numuneler alınır ve lüminesans ve absorbans ölçümleri yapılır. Her lagün için, lüminesans ölçümleri karşılık gelen absorbans ölçümüne bölünür ve zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. Faj ile enfekte olmuş lagünler yeşil renkteyken, enfekte olmamış kontrol lagünleri siyah renktedir. Kısaltma: PRANCE = Faj ve Robotik destekli Yakın Sürekli Evrim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: En azından bakteri rezervuarı/dağıtım manifoldu ("waffle") dahil olmak üzere PRANCE sistemi için gerekli özel güverte bileşenlerinin 3D baskısı için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: DilutionCalculator Elektronik Tablosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir ihtilafı yoktur.