Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

3.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65978

⸱

9 Şubat 2024

 ,  , 
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Özet

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), hedeflenen hücre popülasyonlarında hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri izlemek için görüntüleme tekniklerini sağlar. Büyük sinyal-gürültü oranları, GECI'leri duyusal nöronlarda uyaranla uyarılan aktiviteyi tespit etmek için güçlü bir araç haline getirir. GECI'ler, aynı anda incelenebilen nöron sayısı ile uyaran kodlamasının popülasyon düzeyinde analizini kolaylaştırır. Bu popülasyon kodlaması en uygun şekilde in vivo olarak yapılır. Boynun altındaki somatik ve viseral yapıları innerve eden duyusal nöronların somasını barındıran dorsal kök gangliyonları (DRG), bu yapılara nispeten kolay erişilebildiği için en yaygın olarak in vivo görüntülemede kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bu teknik farelerde oral ve kraniyofasiyal yapıları innerve eden trigeminal gangliondaki (TG) duyusal nöronları incelemek için kullanıldı. DRG'ye ek olarak, trigeminal nevralji gibi duyusal nöron aktivitesindeki değişiklikleri yansıtıyor gibi görünen oral ve kraniyofasiyal yapılara özgü ağrı sendromlarının uzun listesi de dahil olmak üzere TG'yi incelemek için birçok neden vardır. Fareler, genetik araçların mevcudiyeti nedeniyle DRG ve TG nöronlarının çalışmasında en yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, boyut, kullanım kolaylığı ve potansiyel olarak önemli tür farklılıklarındaki farklılıklarla, fare TG nöronlarından ziyade sıçanları incelemek için nedenler vardır. Bu nedenle, sıçan TG nöronlarını in vivo görüntülemek için bir yaklaşım geliştirdik. Yenidoğan yavrularına (p2) intraperitoneal olarak GCaMP6'ları kodlayan bir AAV enjekte ettik ve hem TG hem de DRG nöronlarının %>90 enfeksiyonu ile sonuçlandı. Kraniyotomi ve dekortikasyonu takiben erişkinlerde TG görüntülendi ve yüzün mandibular ve maksiller bölgelerinin uyarılmasını takiben TG nöronlarında GCaMP6s floresansındaki değişiklikler izlendi. Floresanstaki artışların periferik sinir bloğu ile uyaran olarak uyarıldığını doğruladık. Bu yaklaşımın birçok potansiyel kullanımı olsa da, periferik sinir hasarını takiben değişen TG nöronlarının alt popülasyonlarını karakterize etmek için kullanıyoruz.

Giriş

Cilde veya kaslar, kemik ve iç organlar dahil olmak üzere diğer vücut yapılarına etki eden mekanik, termal ve kimyasal uyaranların sinirsel kodlaması olan somatosensation, bu yapıları innerve eden birincil afferent nöronlardaki aktivite ile başlar1. Tek birim tabanlı elektrofizyolojik yaklaşımlar, bu süreçte yer alan afferent alt tipler ve bunların uyaran-tepki özelliklerinin zaman içinde nasıl değişebileceği hakkında zengin bilgiler sağlamıştır 1,2,3. Bununla birlikte, spesifik duyusal modalitelerin nöronların spesifik alt popülasyonları tarafından taşındığını öne süren etiketli çizgi teorisini destekleyen güçlü kanıtlar olsa da, birçok nöron alt popülasyonunun aynı tür mekanik, termal ve kimyasal uyaranlara yanıt verme yeteneği, somatosensoriyel uyaranların çoğunun nöronların çoklu alt popülasyonları tarafından kodlandığını göstermektedir4, 5. Bu nedenle, somatosensasyonun daha iyi anlaşılması, yalnızca yüzlerce olmasa da 10'larca nöronun aktivitesini aynı anda inceleme yeteneği ile gelecektir.

Konfokal ve daha sonra multifoton ve dijital görüntüleme tekniklerinin nispeten yakın zamanda ortaya çıkmasıyla optik yaklaşımlardaki ilerlemeler, nöronal aktivitenin nispeten invaziv olmayan popülasyon düzeyinde analizlerini gerçekleştirme yeteneğini kolaylaştırmıştır 6,7. Bu teknolojinin uygulanmasındaki son engellerden biri, nöral aktivitenin optik değerlendirmesini sağlayacak araçların geliştirilmesi olmuştur. Bir milisaniyeden daha kısa sürede başlayıp bitebilen bir aksiyon potansiyelinin hızı göz önüne alındığında, bir aksiyon potansiyeli hızında membran potansiyelindeki değişiklikleri takip etme kapasitesine sahip voltaja duyarlı bir boya bu amaç için ideal bir araç olacaktır. Ancak bu alanda muazzam bir ilerleme kaydedilmiş olsa da 7,8,9,10, bu boyaların çoğu için sinyal-gürültü oranı, tek hücre düzeyinde yüzlerce nöronun popülasyon analizini mümkün kılacak kadar yüksek değildir. Alternatif bir yaklaşım olarak, araştırmacılar hücre içi Ca2 + konsantrasyonundaki ([Ca2 +] i) değişiklikleri izlemeye yöneldiler. Bu stratejiyle ilgili sınırlamalar en başından beri açıktı ve [Ca2 +] i'deki bir artışın nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olduğugerçeğini içeriyor 11; voltaj kapılı Ca 2+ kanallarının (VGCC'ler) aktivasyonu ile ilişkili Ca2+ akışından bağımsız olarak [Ca2 +] i'de bir artışın meydana gelebileceğini12,13; bir Ca2+ geçici olayının büyüklüğünün ve süresinin, VGCC aktivitesinden bağımsız süreçler tarafından kontrol edilebileceğini, 11,12,14; ve Ca2+ geçici akımlarının zaman seyrinin, bir aksiyon potansiyelininkinden çok daha fazlaolduğunu 15. Bununla birlikte, nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak Ca2 + kullanımıyla ilişkili bir dizi önemli avantaj vardır. Bunlardan en önemlisi, hem hücre içiCa2+'daki değişimin büyüklüğünü hem de sinyalin hücre zarının iki boyutlu uzayından ziyade sitozolün üç boyutlu uzayından kaynaklandığı gerçeğini yansıtan çoğu Ca2+ göstergesiyle ilişkili sinyal-gürültü oranıdır. Ayrıca, genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerinin (GECI'ler) geliştirilmesiyle, hücrelerin belirli alt popülasyonlarında Ca2+ göstergelerinin ekspresyonunu yönlendirmek için genetik stratejilerden yararlanmak mümkündür, bu da bozulmamış preparatlarda popülasyon düzeyinde analizleri kolaylaştırır (örneğin, bkz.16).

Şu anda farelerde mevcut olan genetik araçların sayısı göz önüne alındığında, GECI'lerin bu türde en yaygın şekilde kullanılması şaşırtıcı olmamalıdır. Duyusal nöronların alt popülasyonlarında yapısal GECI ekspresyonuna sahip fare çizgileri geliştirilmiştir 7,16,17. Belirli hücre tiplerinde rekombinazları ifade eden fare çizgilerinin geliştirilmesiyle, GECI ekspresyonunu kontrol etmek için daha da karmaşık stratejiler kullanmak mümkündür15. Bununla birlikte, bu araçlar her zamankinden daha güçlü olsa da, sıçanlar gibi diğer türlerin bazı deneysel sorular için daha uygun olmasının birkaç nedeni vardır. Bunlar, daha küçük farede imkansız olmasa da zor olan bir dizi deneysel manipülasyonu kolaylaştıran daha büyük boyutu içerir; sıçanları nispeten karmaşık davranışsal görevlerde eğitmenin kolaylığı; ve sıçan duyusal nöronlarındaki çeşitli iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerinin ve ekspresyon modellerinin, insan duyusal nöronlarında gözlemlenenlere, insana göre faredeki aynı kanallardan daha benzer olabileceğine dair en azından bazı kanıtlar18.

Somatosensoriyel uyaranların transdüksiyonu genellikle primer afferentlerin periferik terminallerinde meydana gelirken, periferde başlatılan aksiyon potansiyeli, merkezi sinir sistemine ulaşmadan önce dorsal kök (DRG) veya trigeminal (TG) gangliyonlar olarak adlandırılan primer afferent somataları barındıran yapıdan geçmelidir19. Birincil afferent akson boyunca yayılan her aksiyon potansiyelinin hücre gövdesini20 istila etmeyeceğine dair kanıtlar olsa da, birincil afferent somatların ana afferent aksona bir T-kavşağı19 yoluyla bağlanmasının bir sonucu olarak, periferde başlatılan aksiyon potansiyellerinin çoğu soma21'i istila ediyor gibi görünmektedir. Bu, birincil afferentlerde popülasyon kodlamasını değerlendirmek için GECI'leri kullanırken üç deneysel avantaj sağlar: hücre gövdesinin aksonlara göre büyük boyutu, afferent aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak [Ca2+]i kullanıldığında sinyalden gürültüye daha da artar; DRG'ye erişim genellikle kolaydır; ve afferent terminallerden uzamsal olarak uzak bir bölgedeki aktivitenin değerlendirilmesi, gangliyonları ortaya çıkarmak için gereken ameliyatın afferent terminallerin uyaran-tepki özellikleri üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirir. Bununla birlikte, TG beynin altında (veya paletin üstünde) bulunduğundan, DRG'den çok daha zordur. Ayrıca, DRG ve TG nöronları arasında birçok benzerlik olsa da, büyüyen bir farklılıklar listesi de vardır. Bu, TG22'deki nöronların kabaca somatotopik organizasyonunu, innerve edilmiş benzersiz yapıları, farklı merkezi terminal sonlandırma modellerini 23,24,25,26 ve şimdi hem gen ekspresyonu 27,28 hem de fonksiyonel reseptör ekspresyonu29'daki artan farklılıklar listesini içerir. Ek olarak, periferik ağrı mekanizmalarının tanımlanmasıyla ilgilendiğimiz için, trigeminal sisteme özgü gibi görünen nispeten fazla sayıda ağrı sendromu (örneğin, migren, trigeminal nevralji, ağız yanması sendromu) primer afferentlerde anormal aktivite içeriyor gibi görünen30,31,32, TG'nin doğrudan incelenmesi gerektiğini düşündürmektedir.

Bu nedenle, TG nöronlarının uyaran-tepki özellikleri farede GECI'lerle çalışılmış olsa da,16, yukarıda listelenen nedenler sıçanın çeşitli deneysel soruları ele almak için daha uygun bir tür olabileceğini düşündürdüğünden, bu çalışmanın amacı, sıçanlarda TG nöronlarını incelemek için GECI'leri kullanmak için bir yaklaşım geliştirmekti. Bunu başarmak için, periferik sinir sisteminde GECI GCaMP6'ların ekspresyonunu yönlendirmek için viral bir yaklaşım kullandık. Daha sonra TG'ye erişime izin vermek için ön beyni çıkardık. Son olarak, yüze mekanik ve termal uyaranlar uygulanırken, nöronal yanıtlar floresan mikroskobu altında değerlendirildi. Birlikte, bu veriler, birçok eyalette TG'deki değişiklikleri araştırmak için sıçanı kullanma rolünü desteklemekte ve trigeminal sistemdeki duyusal kodlama ile ilgilenen araştırmacılar için araç setini genişletmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Araştırmada hayvanların kullanımını içeren tüm deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Uluslararası Ağrı Araştırmaları Derneği tarafından ortaya konan standartlara uygun olarak gerçekleştirildi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (protokol #22051100). Her deneyin sonunda, sıçanlar, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği ve Pittsburgh Üniversitesi IACUC tarafından onaylanan bir yaklaşım olan buz gibi soğuk fosfat tamponlu salinin (PBS) kardiyak perfüzyonu ile ekzaninasyon yoluyla ötenazi yapıldı.

1. GCaMP indüksiyonu

  1. Yavruların doğumdan sonra uygun zamanda enjekte edilebilmesi için zaman hamile Sprague Dawley sıçanlarını sipariş edin.
  2. Her sıçan yavrusuna dokunmadan önce eldivenlere %70 EtOH püskürtün. Bu, barajı gençleri yamyamlaştırmaktan caydıracaktır.
  3. Sıçan yavrularını (P1-2) %70 EtOH ile sürüntü ve 3 dakika boyunca buz üzerinde uyuşturun.
  4. 25 μL steril, gaz geçirmez Hamilton şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) enjekte edin.

2. Trigeminal ganglion maruziyet cerrahisi

  1. 6-8 haftalık sıçanlara (yaklaşık 150-200 g) vücut ağırlığına göre intraperitoneal olarak anestezik kokteyl (55 mg/kg ketamin, 5.5 mg/kg ksilazin, 1 mg/kg asepromazin) uygulayın.
    NOT: Bu genellikle, bir arka pençenin zararlı bir şekilde sıkışmasına karşı bir geri çekilme refleksinin yokluğu ile değerlendirildiği gibi cerrahi bir anestezi düzlemini korumak için yeterlidir. Bununla birlikte, hayvanlar hafif hale gelirse, bir burun konisi yoluyla izofluran takviyesi yapın.
  2. Tamamen uyuşturulduktan sonra, başın ve yüzün saçlarını ve bıyıklarını tıraş edin.
  3. Fareyi kulak çubuklu stereotaksik bir çerçeveye monte edin ve vücut ısısını korumak için altına bir ısıtma yastığı (~ 37 oC) yerleştirin.
  4. Yaşamsal belirtileri (kalp atış hızı, solunum hızı, kan oksijen doygunluğu) bir fare oksimetresi veya benzeri bir cihazla izleyin.
    NOT: Vücut ısısı bir rektal prob ile izlenir ve sıçanlar geri besleme kontrollü bir sirkülasyonlu su battaniyesine yerleştirilerek korunur.
  5. Kanamayı en aza indirmek için kan damarlarını daraltmak için kafaya buz gibi tuzlu suya batırılmış gazlı bez yerleştirin. 15 numara bir neşter kullanarak, kafatası üzerinde cilt ve kasın orta hat kesisini yapın.
  6. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildin ve kasın künt diseksiyonunu kullanın.
  7. 1/4 yuvarlak matkap ucu kullanarak, ön beyni ortaya çıkarmak için kafatası kapağını dikkatlice delin. Ardından, kafatasını dikkatlice kesmek için rongeurs (2,5 mm fincan) kullanın.
  8. 15 numara neşter kullanarak beyne (Bregma: -3.80) ve koku soğancığına bir kesi yapın.
    NOT: Bu noktadan sonra daha kaudal olarak kesmek, sıçan ölümüne neden olacaktır
  9. Durayı kafatasından dikkatlice ayırmak için bir spatula kullanın ve TG'yi ve kafatasının tabanını ortaya çıkarmak için kopmuş beyni yavaşça kaldırın.
    NOT: Ekstraksiyon boyunca buz gibi soğuk salin perfüzyonunun ek kullanımı kanamayı en aza indirecek ve aşağıdaki diseksiyon alanını optimize edecektir.
  10. Bir koter kalemi kullanarak, ekstraksiyondan kaynaklanan kanamaları durdurun.
    NOT: Duranın kesilmesi kaçınılmaz kanamaya neden olur. Buz gibi soğuk aCSF (119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 2.5 mM CaCl2) hazırlamak en iyisidir.

3. GCaMP6s görüntüleme

NOT: Bu nöronların büyüklüğü ve yoğunluğu göz önüne alındığında, kullanılan görüntüleme ve veri toplama sistemi (objektif, mikroskop, ışık kaynağı, kamera) görselleştirilen GECI+ hücrelerinin sayısını belirleyecektir. Işık kaynağı, objektif ve kamera, pozlama süresi ve görüntü yakalama hızı dahil olmak üzere görüntü elde etmek için kullanılan parametreleri de belirleyecektir. Deneyin parametrelerine bağlı olarak multifoton ve konfokal teknikler kullanılabilirken, epifloresan mikroskobu birçok hücreyi çözmek için yeterli olabilir. Herhangi bir görüntü alma paketi kullanılabilir. İdeal olarak, uyaran uygulaması, görüntü alma yazılım paketi ile zaman kilitlidir.

  1. Kafatası boşluğunu objektifin altına yerleştirin ve görünür ışık kullanarak TG'yi odağa getirin.
  2. GCaMP6'ların uyarma dalga boyu 496 nm'dir ve emisyon dalga boyu 513 nm'dir; bu nedenle, GCaMP+ hücrelerini bulmak için uygun dikroik ve filtre küplerini kullanın. Nöronların alıcı ilgi alanına uygulanan uyaranlara yanıt verdiği gangliyon alanını bulmak ve çözmek için odağı ayarlayın.
  3. Yüzün 10cm'lik bir bölgesine uygulanan mekanik uyaranlara yanıt veren TG'deki çoğu nöronun görselleştirilmesini sağlamak için 2x objektif kullanın16. Çözünürlüğü artırmak için uzun çalışma mesafesine (10,8 mm) sahip 20x kuru objektif kullanın.
  4. Zaman içinde ve uyaran uygulamasına yanıt olarak floresan verilerini toplamak için toplama yazılımı (örneğin, Metamorf) kullanın.
    1. Nöronların foto-ağartmasını en aza indirmek için, floresandaki başlangıç ve uyarılmış artışları tespit etmek için mümkün olduğunca kısa pozlama süresi kullanın. Bu çalışmada kullanılan 20x, 0,40 NA hava objektifi, 120 W cıva halojenür ışık kaynağı ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera, 300 ms pozlama süresi ve 3 Hz görüntü elde etme hızı ile >90 dakika boyunca kararlı temel kayıtlar elde edin.
      NOT: 1) Bu görüntü elde etme parametreleri ampirik olarak belirlenmelidir. 2) Alıcı alana mekanik (fırça, nokta, titreşim, çimdikleme), termal (sıcak ve soğuk) ve kimyasal (kapsaisin, mentol, enflamatuar mediyatörler) uygulanabilir. Nispeten ucuz bir öznel yaklaşım, uyaranları elle uygulamaktır. Bununla birlikte, geri besleme kontrollü aktüatörlerin bilinen bir kuvvette tekrarlanan uygulama için kullanılabileceği daha objektif ve tekrarlanabilir yaklaşımlar önerilir. Geri besleme kontrollü Peltier cihazları, kontrollü ısıtma ve soğutma için yararlı olsa da, kavisli bir yüzün termal stimülasyonu için ideal değildir. Geri besleme kontrollü kızılötesi ışık kaynakları ısıtma için bir alternatiftir ve soğuk sprey, soğutma için ideal bir alternatiften daha azdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Daha önce sıçan duyusal nöronlarının15 enfeksiyonu için AAV9 serotipi ile başarılı olduğumuzdan, bu serotipi sıçan TG nöronlarında GCaMP6'ların ekspresyonu için kullandık. Bu nedenle, ilk olarak, bu virüs yenidoğan sıçan yavrularına uygulandığında AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40'ın (AAV9-GCaMP) duyusal nöron enfeksiyonu etkinliğini değerlendirmeye çalıştık20. Bu virüs, yüksek düzeyde gen ekspresyonunu yönlendiren ve sürdüren CAG promotörü kullanır. Ayrıca, AAV9'un yenidoğan sıça...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, TG'yi görüntülemek için bir GECI sıçanı üretmenin hızlı, invaziv olmayan bir yolunu gösteriyoruz. Yüksek düzeyde gen ekspresyonunu sürmek ve sürdürmek için bir CAG promotoru seçtik. Önceki çalışmalar, diğer AAV serotiplerinin DRG nöronlarındagen ekspresyonunu etkili bir şekilde yönlendirebileceğini öne sürerken, sonuçlarımız yenidoğanlarda32 AAV'nin intraperitoneal enjeksiyonunu içeren yeni bir çalışma ile tutarlıdır ve AAV9 serotipinin sıçan yenidoğan duyu nöronlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Gold, bu hazırlığın geliştirilmesi sırasında Grunenthal'dan hibe desteği alıyordu. Grunenthal çalışmasının odağında ve bu yazıda açıklanan preparatta herhangi bir örtüşme yoktu. Diğer yazarların hiçbirinin ifşa edecek başka bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Dr. Kathy Albers ve Brian Davis'e Leica Mikroskop ve Metamorf programlarını kullandıkları için, Charles Warwick'e termal Peltier cihazımızı oluşturmamıza yardımcı oldukları için ve Dr. Raymond Sekula'ya cerrahi hazırlık sorunlarının giderilmesine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) ve R01NS122784 (MSG ve RS) hibeleriyle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 Addgene100844-AAV9AAV9-GCaMP6s virüsü
ACEpromazine maleatCovetrus11695-0095-510 mg / mL
AnaSed (Xylazine) enjeksiyonuAKORN Hayvan Sağlığı23076-35-920 mg / mL
CTR5500 Elektronik kutusuLeica11 888 820Güç
Kaynağı Cutwell çapak matkap ucuFidye & Randolph& frac14; yuvarlak
DM 6000 FSLeica11 888 928Taban Standı
EL6000LeicaEL6000120 W cıva ampullü ışık kaynağı
ForsepsFST11252-00Dumont No. 05
Friedman rongeursFST16000-142,5 mm fincan boyutu
Friedman-Pearson rongeursFST16021-141 mm fincan boyutu
Isıtma yastığı (Sıcaklık terapi pedi)STRYKER8002-062-022
Ketamin hidroklorürCovetrus1695-0703-1100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40LeicaMRH0010520x objektif, 0.4 NA10.8 mm WD
Güç kolu yüksek sıcaklık koter kalemiBovieHIT1el tipi Change-A-Tip koter kalemi
Prime 95BFotometriPrime 95BCMOS Kamera
SalineFisher ScientificNC0291799%0.9 Steril Tuzlu
Neşter bıçağıFisher Scientific22-079-701boyut 15 tek kullanımlık bıçak
SpatulaBRI48-1460beyin spatulası
Yaylı makasFST91500-09Öğrenci Vannas, 5 mm kesici kenar
Yaylı makasFST15012-12Noyes, 14 mm kesici
kenar STP6000 Akıllı dokunmatik panelLeica11 501 255Kontrol
Paneli ŞırıngaHamilton8020125 & L Model 1702 Luer Uçlu şırınga
Su ısıtıcısıAdroitHTP-1500

Kaynaklar

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826(2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199(2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535(2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007(2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959(2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25(2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526(2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84(2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

In Vivo GörüntülemeGenetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleriNöropatik AğrıSıçan ModeliGCaMP6s FloresansıMekanik StimülasyonPeriferik Sinir Yaralanması
Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.