Burada, bir sıçan EVLP modeli oluşturmak için gerekli adımları açıklıyoruz ve perfüze akciğerlerle ilişkili inflamatuar profili gösteriyoruz. Amaç, sıçan EVLP modeli hakkındaki bilgi ve deneyimleri yaymak ve bu devrim niteliğindeki teknikle ilişkili biyolojik tepkilerin bütünsel olarak anlaşılmasını sağlamaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akciğer naklinde translasyonel içgörüler için ex vivo akciğer perfüzyon sıçan modelinin oluşturulması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Akciğer naklinin ilerlemiş akciğer hastalıkları için terapötik bir strateji olarak kurulmasından bu yana, bilim camiası, bağış süreci için uygun olduğu düşünülen düşük sayıda akciğer sorunuyla karşı karşıyadır. Bununla birlikte, son yıllarda, marjinal akciğerleri değerlendirmek ve yenilemek için bir strateji olarak ex vivo akciğer perfüzyonunun (EVLP) geliştirilmesi göz önüne alındığında, bu senaryo olumlu yönde değişmiştir. EVLP'nin büyük nakil merkezlerinde kurulması, hem akciğer fonksiyonunun tanısal doğruluğunu artırarak hem de akciğer greftlerinin yenilenmesi için etkili bir platform oluşturarak akciğer nakli sayısında bir artışa yardımcı olmuştur. Bu bağlamda, etik ve lojistik konularla karşı karşıya kalmanın yanı sıra, akciğer nakli ile ilişkili immünolojik faktörlerin incelenmesinde, güvenilirlikleri, genetik manipülasyon olasılığı ve daha düşük maliyetleri göz önüne alındığında, kemirgen EVLP modellerinin geliştirilmesi önemli hale gelmiştir. Bu makale, bir sıçan EVLP modeli oluşturmak için bir protokolü açıklar ve perfüze akciğerlerle ilişkili inflamatuar profili gösterir. Bu, sıçan EVLP modeli hakkındaki bilginin yayılmasına yardımcı olacak ve bu devrim niteliğindeki teknikle ilişkili biyolojik tepkileri anlamamızı teşvik edecektir.
Giriş
Akciğer transplantasyonu, son yıllarda cerrahi yöntemlerdeki gelişmeler ve immünsüpresyon ile son dönem hastalıklar için terapötik bir strateji olarak kabul edilmiştir. Yüksek talebe rağmen, kabul edilebilir ölen akciğer donörlerinin sayısı diğer katı organlara göre daha düşüktürve gerçekleştirilen daha düşük akciğer nakli sayısına yakınsar 1,2,3. Donör havuzu eksikliğini gidermek için tıp camiası, akciğer bağışı kriterlerini genişletti ve daha önce cansız olduğu düşünülen organları nakil için potansiyel organlara dönüştürdü. Bununla birlikte, genişletilmiş kriterler, bağışlanan organdan kaynaklanan olası sistemik sonuçlar göz önüne alındığında, daha iyi bir anlayış ve müdahale için farklı çabalar gerektirmektedir. Ex vivo akciğer perfüzyonu (EVLP), normotermik akciğer korunması, akciğer fonksiyonlarının değerlendirilmesi ve daha önce bağış süreci için mümkün olmadığı düşünülen akciğerlerin yenilenmesini sağlayan bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6.
EVLP'nin büyük nakil merkezlerinde kurulmasından bu yana artan akciğer nakli sayısı göz önüne alındığında, akciğer koruma ve onarım stratejileri giderek daha fazla araştırılmaktadır. Bu anlamda, etik ve lojistik konularla karşı karşıya kalmanın yanı sıra, akciğer nakli ile ilişkili immünolojik faktörlerin incelenmesinde, güvenilirlikleri, genetik manipülasyon olasılığı ve daha düşük maliyetleri göz önüne alındığında, kemirgen EVLP modellerinin geliştirilmesi önemli hale gelmiştir 7,8,9. Burada, bir sıçan EVLP modeli oluşturmak için gerekli adımları açıklıyoruz ve perfüze akciğerlerle ilişkili inflamatuar profili gösteriyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri, Üniversite Sağlık Ağı'nda Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan Hayvan Kullanım Protokolü'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Erkek Lewis sıçanlarına (255-330 g) yiyecek ve suya ad libitum erişim verildi. Daha sonra, 12 saatlik gündüz-gece döngüsü ile kontrollü bir ortamda (18-22 °C) muhafaza edildiler. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, çözümler ve araçlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Ex vivo akciğer perfüzyon sisteminin başlatılması
- Tüm dönüştürücülerin izole edilmiş perfüzyon organ ekipmanına ve veri toplama sistemine bağlı olduğundan emin olun (Şekil 1). Ardından, veri toplama yazılımını açın.
- Perfüzyondan önce, EVLP devresini 1.000 USP birim sodyum heparin, 50 mg sefazolin ve 50 mg metilprednizolon ile takviye edilmiş 150 mL Steen solüsyonu ile doldurun.
- Ilık su banyosunu 20 °C'ye ayarlayın. Tüm EVLP sistemini ısıtmak için ılık su sirkülasyonuna başlayın.
2. Donör akciğer tedarik prosedürü
- Sıçanı intraperitoneal ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) enjeksiyonu ile veya yerel uygulamaya göre anestezi altına alın. Ayak parmağını kıstırma refleksini kontrol ederek uygun anestezi derinliğini onaylayın.
- Orotrakeal entübasyon yapın (14 G intravenöz kateter). Entübasyondan sonra, trakeal tüpü küçük hayvan ventilasyon sistemine bağlayın. Sıçanı 10 mL / kg tidal hacim, 60 nefes / dk hızı, 0.5 solunan oksijen fraksiyonu (FiO2) ve 2 cmH2O pozitif son ekspiratuar basınç (PEEP) ile havalandırın.
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
- Uygun makas ve forseps yardımıyla periton boşluğuna girin ve insizyonu kraniyal olarak taşıyın, medyan laparotomi yapın ve portal ven içine sodyum heparin (400 USP birimi) enjekte edin.
- Daha sonra, ksifoid işlemi yoluyla göğüs boşluğuna girin. Akciğere zarar vermemek için sternumun kraniyal rezeksiyonu ve diyaframın dikkatli radyal açıklığı ile sternotomiyi gerçekleştirin.
- Kalp ve akciğer bloğunu almak için, inferior vena kavada (IVC) ve sol kalbin tepesi boyunca bir kesi yapın.
- Mikro makas kullanarak, sağ ventrikül çıkış yolunda bir ön kesi yapın. Daha sonra, pulmoner gövdeye 18 G'lik bir intravenöz kateter yerleştirin ve akciğerleri 10 μg / mL prostaglandin E1 içeren 20 mL düşük potasyum dekstran (LPD) çözeltisi ile yıkayın.
- Yıkamadan hemen sonra, akciğerleri şişirilmiş bir durumda tutmak için inspirasyonun sonunda trakeanın alt üçte birini sıkıştırın.
- Kalp ve akciğer bloğunu hasat edin ve saklamak için LPD solüsyonuna yerleştirin.
NOT: Akciğer grefti, araştırma amacına göre sıcaklıklarda ve farklı zaman aralıklarında saklanabilir. Burada, buz üzerinde farklı uzunluklarda soğuk iskemik zaman (CIT) geçiren akciğerlerin temsili sonuçlarını gösteriyoruz.
3. Ex vivo akciğer perfüzyon prosedürü
- Ana pulmoner arterin (PA) altına ve ventriküllerin etrafına 0 ipek ligatür yerleştirin ve kanülasyonu kolaylaştırmak için pretikçe yerleştirin.
- PA kanülünü EVLP sisteminin giriş hattına bağlayın ve peristaltik pompayı %10 bakım akışıyla çalıştırın, bu da PA kanülündeki havanın dışarı atılmasını sağlar.
- Giriş kanülünü ana PA'ya (OD: 2.0 mm / Kafa Çapı: 2.5 mm) yerleştirin ve sabitleyin, ardından drenaj kanülünü kalbin tepesinden sol atriyuma (LA-Kafa Çapı: 4.0 mm) mitral kapaktan sonraki perfüzyon için. Mitral kapağı genişletmek için forseps kullanın, kanülasyonu kolaylaştırın.
- Soluk borusunda küçük bir delik açın ve trakeal kanülü yerleştirin (OD: 2.0 mm/L: 14 mm). Ardından sistemin havalandırma hattına bağlayın.
- LA kanülünü sistemin çıkış hattına bağlayın.
- NOT: Bakım akışının %10'unu perfüzyonun başlangıcı olarak ayarladık. Akciğerlere hava kabarcıklarının girmesini önlemek için, kabarcık tutucunun doldurulduğundan emin olun.
- Kardiyak debinin (CO) %20'sine ulaşmak için akış hızı perfüzyonunu kademeli olarak artırın.
NOT: Her iki akciğeri de perfüze etmek için, 250 g sıçan için tahmini 75 mL / dak'lık bir CO kullandık10,11. Klinik EVLP protokolümüz12'ye göre hedef akış hızına ulaşmak için perfüzyon akış hızı kademeli olarak 1 saate çıkarıldı. Perfüzyon parametreleri Tablo 113'te özetlenmiştir. - Perfüzyonun başlamasından 20 dakika sonra trakeal klempi çıkarın ve akciğer ventilasyonunu başlatın, ardından 35 ila 45 mmHg arasında PCO2 giriş perfüzünü korumak için EVLP gazı akışını başlatın (%8 CO2,% 6 O2,% 86N2).
NOT: Ventilasyon parametreleri Tablo 113'te özetlenmiştir.
4. Parametreler ve numune yönetimi
- EVLP sırasında her saat, dinamik akciğer kompliyansını ve pulmoner vasküler direnci (PVR) gerçek zamanlı olarak kaydedin.
NOT: Fizyolojik değerlendirmelerden 5 dakika önce, akciğerler şişirme basıncına genişletilmelidir. - Numune portundan her saat başı perfüzat numuneleri alın ve daha fazla analiz için sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma yapın.
NOT: Ek olarak, değerlendirmeden 5 dakika önce bir işe alım manevrası (20 cmH2O'ya kadar) gerçekleştiriyoruz, ardından pH, PCO2, PO2, elektrolitler, glikoz ve laktat ölçmek için kan gazı analizleri için perfüzatlar alıyoruz. - Perfüzyonu durdurun ve akciğerleri şişirilmiş bir durumda tutmak için trakeayı sıkıştırın. Daha sonra, akciğer örneklerini izole edin ve sıvı nitrojen içinde dondurun veya daha ileri çalışmalar için sabitleme solüsyonlarına yerleştirin.
NOT: Burada akciğerler 4 saat boyunca perfüze edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
20 dakika ile 18 saat arasında değişen CIT'li tüm akciğerler 4 saat boyunca perfüze edilebilir (Şekil 2)13. Uyum, 4 saatlik perfüzyon perfüzyon periyodu boyunca kademeli olarak azalan 18 saatlik CIT hariç çoğu grupta stabildi (Şekil 2A). Buna rağmen, gruplar arasında vasküler direnç, akciğer greft oksijenasyonu ve glukoz seviyelerinde anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 2B-D
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, bir sıçan EVLP protokolü oluşturmak için gerekli adımları açıklamıştır. Burada, donör akciğerlerinin 4 ° C'de 18 saate kadar soğuk statik korumadan sonra 4 saat boyunca perfüze edilebileceğini gösteriyoruz. Bu, akciğer kompliyansı, pulmoner vasküler direnç, perfüzat glikoz/laktat konsantrasyonu ve P/F oranının değerlendirilmesiyle gösterildi.
EVLP platformunun akciğer fonksiyonunun değerlendirilmesinde ve greft yenilenmesinde önemli bir araç olara...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
MC, Traferox Technologies Inc.'in hissedarı ve Lung Bioengineering Inc.'in danışmanıdır. MC, Beyond Air Inc. ve Synklino'dan araştırma desteği almaktadır. Yazarlar, bu yazıda bildirilen sonucu etkileyebilecek herhangi bir rekabet çıkarı olmadığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur (yayın ve lisans haklarının onayı [Sözleşme: BT25KGSKWF]).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 14 G intravenöz kateter | BD | 381167 | Orotraçal entübasyon |
| 16 G intravenöz kateter | BD | 381157 | Akciğeri yıkamak için kateter |
| 2-0 Dikiş Sofsilk | Covidien | S-305 | Trakeal tüp fiksasyonu |
| 3-0 Dikiş Sofsilk | Covidien | S303 | Arteriyel ve atriyal kanüllerin fiksasyonu |
| Sıçan için IPL-2 Çekirdekli İzole Perfüze Akciğer Sistemi | Harvard Aparatı | 734276 | Ex vivo akciğer perfüzyon (EVLP) sistemi |
| Ketamin (Narketan) | Vetoquinol | 440894 | Sedasyon/anestezi |
| Büyük Akciğer Arteri Kanülü | Harvard Aparatı | 73-0711 | |
| Sol Atriyal Kanül | Harvard Aparatı | 73-0712 | |
| Düşük potasyumlu dekstran glikoz çözeltisi (Perfadex) | XVIVO | 19811 | Koruma çözümü |
| Metilprednizolon sodyum süksinat (SOLU-MEDROL) | Pfizer | 14705 | Anti-inflamatuar |
| Prostaglandin E1 (Prostin VR) | Pfizer | RX297945 | |
| Küçük Hayvan Ventilatörü (Model 683) | Harvard Aparatı | 55-0000 | |
| Sodyum heparin | Leo Pharma | 453811 | |
| Steen Çözümü | XVIVO | 19004 | EVLP sırasında perfüzo akciğerlere tamponlu ekstrasellüler çözeltisi |
| Sugita Aneur klip kıvrımı | Mizuho | 07-940-86 | Trakeal kelepçe |
| Trakeal Kanül | Harvard Aparatı | 73-3384 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer Healthcare | 2169592 | Sedasyon/anestezi |
Kaynaklar
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
- Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
- Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
- Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
- Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
- Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
- Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
- Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
- Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
