Yöntem makalesi

İlaç Geliştirme Uygulamaları için Tüm İnsanlardan Oluşan Bir Hepatik Kültür Sistemi

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65992

⸱

20 Ekim 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Medicine, LifeNet Health, 2Biologics Division, LifeNet Health, 3LifeSciences Division, LifeNet Health, 4Research and Development, LifeSciences, LifeNet Health

Bu makalede

Özet

Son teknik gelişmeler, ilaç metabolizması ve toksisite uygulamaları için bir in vitro platformun ölçekli üretimini mümkün kılmıştır. Tamamen insanlardan oluşan bir 2D+ hepatik sistem (TV2D+), geleneksel iki boyutlu kültür yöntemlerini kullanarak fizyolojik olarak ilgili sonuçlar sağlar. Bu protokol, sistemin kurulumu, bakımı ve uygulanmasında son kullanıcıları destekleyecektir.

Özet

Farmakolojik ve toksikolojik çalışmalar için birincil insan hepatositleri (PHH'ler) için uzun vadeli, insanla ilgili bir kültür modeli bulmak zor olmaya devam etmektedir. Mevcut in vitro model platformları genellikle elverişsiz ve karmaşıktır, zaman içinde fenotipik stabiliteden yoksundur ve deneysel tekrarlanabilirlik ve esneklikten yoksun çoklu PHH lotlarını desteklemez. Burada, tipik olarak daha karmaşık üç boyutlu (3D) sistemlere eşlik eden zaman içinde uzun ömürlülüğü ve fenotipik kararlılığı korurken, standart iki boyutlu (2D) kültür tekniklerinden ve ekipmanlarından yararlanan, tamamen insan 2D+ hepatik sistemin (TV2D+) çözülmesi, kaplanması ve bakımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Sonuçlar, PHH tohumlama yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak TV2D+'da bağlanma ve yüzde plakalanabilirliğin yanı sıra kültürde en az 2 hafta boyunca stabil işlevselliği göstermektedir. Başarılı bir uzun vadeli kültür elde etmek için bir dizi PHH tohumlama yoğunluğu değerlendirilir. Düzgün bir şekilde kurulduğunda, TV2D+'daki PHH'ler hepatosit kolonileri halinde organize olur, hepatik spesifik bir belirteç ifade eder ve canlılığı, mimari bütünlüğü ve fizyolojik olarak ilgili albümin ve üre seviyelerini korur. Bu benzersiz özellik kombinasyonu, TV2D+ sistemini çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için uygun bir hepatik model haline getirir.

Giriş

Terapötik güvenlik ve etkinliğin tahmin edilmesi, klinik öncesi ilaç geliştirmenin önemli bir parçasıdır. Bununla birlikte, konvansiyonel preklinik in vitro hepatik modeller, in vivo karaciğer hücresel mikroçevresini doğru bir şekilde taklit etme ve zaman içinde hepatosit işlevselliğini ve morfolojisini koruma yetenekleri bakımından sınırlıdır. Yavaş döngülü bileşikleri değerlendirmek veya subakut veya kronik maruziyetle ilişkili sonuçları araştırmak için 1 haftadan uzun süre stabil metabolik yeterlilik sağlayan modellere ihtiyaç vardır. İn vivo hayvan testleri, insan hepatik klirens mekanizmalarındaki translasyonel tür farklılıkları nedeniyle ilaç etkinliğini ve riskini tahmin etmekte sıklıkla başarısız olur1. Geleneksel primer insan hepatosit (PHH) monokültürü veya sandviç kültürleri gibi mevcut in vitro 2 boyutlu (2D) hepatik modeller, kültürde fenotipik stabilite ve uzun ömürlülükten yoksundur, bu da zamanla temel hepatoselüler fonksiyonun ve mimari bütünlüğün kaybına yol açar2. Alternatif bir yöntem, 3 boyutlu (3D) hepatosit sferoidlerinin oluşumunu içerir ve 2D kültüre kıyasla daha uygun bir mikro çevre sunar. Bununla birlikte, bu yöntem, hammaddelerin mevcudiyeti, PHH donör lot seçimi, tekrarlanabilirlik ve artan küresel boyut 3,4,5,6 ile canlılık kaybı ile sınırlıdır. PHH'lerin besleyici hücrelerle sabit boyutlu, mikro desenli plakalara ekildiği çok hücreli platformlar tanıtıldı. Bu modeller daha uzun kültür süreleri sağlayabilse de, bu platformlarda kullanılan insan dışı besleyici hücreler, ilaç klirensine ve metabolik profilleredoğuştan gelen arka plan katkısı nedeniyle deneysel sonuçları değiştirebilir ve uygulamalarını sınırlayabilir 1,7. Yakın zamanda Weaver, et al8'de açıklanan TruVivo tamamen insan 2D+ hepatik sistemi (TV2D+), PHH'lerin geleneksel, ortak kültür ve 3D kültür yöntemlerinin bazı sınırlamalarını ele almak için geliştirilmiştir. Karaciğer besleyici olmayan hücreler, metabolizma ve parakrin üretimindeki türler arası farklılıkları azaltır ve primer hepatositler için gerekli desteği, genişleme, fenotip ve performanstaki sınırlamalar nedeniyle tek bir donör lotundan karşılık gelen parankimal olmayan karaciğer hücreleri tarafından sağlanamayan tekrarlanabilir, sağlam bir şekilde sağlar. Seçilen besleyici hücreler, kullanımdan önce tutarlı bir şekilde genişletilebildi ve dönüşüm veya farklılaşma ihtiyacından yoksundu. Glicklis ve ark.4 ve Khetani ve ark.5 tarafından tanımlandığı gibi, hepatosit sferoidleri gibi 3D kültür modelleri, donör değişkenliği ve 200 μm'den büyük sferoidlerde besin difüzyonunu etkileyen, canlılık ve işlevselliğin azalmasına yol açan sferoid boyutunda tutarlılığın korunması nedeniyle tekrarlanabilirlik ile ilgili zorluklara sahiptir. 3D küresel oluşum gibi, TV2D+ sistemi de PHH'lerin kendi kendine montajına dayanır; bununla birlikte, oluşan PHH kolonileri, tek bir agrega halinde sıkıştırılmak yerine, tek hücre derinliğinde kuyu yüzey alanı üzerinde dağılır. Bu kültür yöntemi, PHH'lerin kaplanmasına, kültürlenmesine ve çeşitli tohumlama yoğunluklarında temel işlevselliği sürdürmesine izin vererek donör değişkenliğini ele almak için yararlı olabilir. TV2D+ sistemi, manipülasyon sırasındaki kayıp veya 3D sferoidlerde genişletilmiş kültür gerçekleştirmek için gereken özel ekipman nedeniyle kullanıcı kullanımının sağlamlığını da artırabilir.

TV2D+ sistemi, standart 2D kültürünü, tipik olarak 3D sistemlere eşlik eden uzun ömürlülük ve fenotipik kararlılıkla birleştirir. Burada açıklanan protokol, biyogüvenlik kabinleri, santrifüjler veCO2 inkübatörleri gibi standart ekipmanlarla donatılmış laboratuvarlarda temel doku kültürü becerilerine sahip kullanıcılar için adım adım yönergeler sağlar. Ortamın hazırlanması, çözülmesi, kaplanması ve elde edilen kültür sisteminin bakımı dahil olmak üzere süreçteki her adım ayrıntılı olarak özetlenmiştir. Protokol ayrıca temel hepatosit işlevsellik çıktılarını, albümini ve üreyi belirlemek için bir yöntemin yanı sıra normalizasyon için PHH ekini belirlemek için immünofloresan görüntü analizi içerir. Düzgün bir şekilde kurulduğunda, TV2D+'daki PHH'ler, doğal hepatik morfolojiyi taklit ederek hepatosit kolonileri halinde organize olur ve en az 2 hafta boyunca genişletilmiş canlılık, mimari bütünlük ve fizyolojik olarak ilgili albümin ve üre seviyelerini korur8. Sistem bir dizi PHH tohumlama yoğunluğuna izin verebildiğinden, arzu edilen donör özelliklerine sahip daha az plakalanabilir PHH lotlarının mevcudiyetini artırmada faydalı olabilir. Bu erişilebilirlik ve işlevsellik kombinasyonu, TV2D+'ı çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için uygun bir hepatik model haline getirir.

Protokol

Bu protokol, Lifenet Health'in etik komitesinin yönergelerini takip eder. Makale, insan katılımcılarla yapılan herhangi bir çalışmayı veya yazarlardan herhangi biri tarafından gerçekleştirilen hayvan çalışmalarını içermemektedir. Tüm hücreler, Lifenet Health tarafından araştırma amacıyla tamamen onaylanan donör dokusundan izole edildi.

1. Orta hazırlık

  1. Her besleyici hücre çözdürme ortamı, ek A, ek B ve ek C'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'lik bir su banyosunda veya 4 ° C'de 16-24 saat çözdürün.
  2. Besleyici hücre çözdürme ortamının tüm şişesini (10 mL) 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüpe ayırın.
    NOT: Hücre peletinin boyutunun 15 mL'lik bir konik tüp kullanılarak görüntülenmesi daha kolay olacaktır.
  3. Tam bir kaplama ortamı oluşturmak için bir şişe kaplama ortamına (75 mL) 4.5 mL ek B ve 11 mL ek A ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Komple kaplama ortamı, FBS %<5 v/v konsantrasyonuna sahiptir.
  4. Ayrı bir şişeye, tam bir kültür ortamı yapmak için 100 mL kültür ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 1 mL ek C ve 14 mL ek A ekleyin.
    NOT: Tam kültür ortamı, FBS konsantrasyonuna sahiptir<%1 v/v
  5. Kalan takviye C'yi ve takviye A'yı -20 °C'de 2. haftaya kadar saklayın.
    NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, takviyelerin raf ömrünü azaltacaktır. Sadece bir kez dondurulması-çözülmesi önerilir.
  6. Kullanmadan önce, 10 mL besleyici hücre çözdürme ortamını, hepatosit çözme ortamını, tam kaplama ortamını ve tam kültür ortamını 37 ° C'lik bir su banyosunda 20-30 dakika ısıtın.

2. İnsan besleyici hücrelerin çözülmesi, sayılması ve kaplanması (Şekil 1A)

  1. PHH'leri tohumlamadan yaklaşık 1 saat önce besleyici hücreleri kültürleyin. Besleyici hücreleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözün.
    NOT: Uzun süreli maruziyetten kaçının (örn., >2 dakika) çözüldüğünü izleyerek ve ters çevrildiğinde kriyoviyalde sıvı gevşediğinde şişeyi çıkararak.
  2. Çözüldükten hemen sonra, besleyici hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
  3. Aseptik teknikler kullanarak, bir biyogüvenlik kabininde (BSC), 10 mL besleyici hücre çözme ortamına taze çözülmüş hücreler ekleyin.
  4. Şişeyi 1 mL hücre/çözdürme ortamı süspansiyonu ile bir kez yıkamak için 1000 μL'lik bir pipet kullanın ve toplayın.
  5. Oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
  6. Pipetleme veya vakum aspirasyonu ile hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletini 1 mL tam kaplama ortamında yeniden süspanse edin ve besleyici hücreleri sayın.
    NOT: Besleyici hücreler, otomatik bir hücre sayacında akridin turuncusu ve propidyum iyodür (AOPI) veya bir hemasitometre kullanılarak tripan mavisi kullanılarak sayılabilir. Hücre sayımları teknolojiye ve kullanıcıya bağlı olarak değişebilir. En iyi sonuçları elde etmek için, yinelenen örnekleri sayın ve seçilen metodolojide tutarlı kalın.
  7. Tam kaplama ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu 100.000 hücre / mL'ye seyreltin.
  8. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun oyuğu başına 500 μL (50.000 hücre) kollajen kaplı 24 oyuklu bir plaka üzerine plaka (bkz.
  9. NS yönünde 2 kez ileri geri hareket ve ardından aynı E-W hareketi ile plakayı Kuzey (N)-Güney (S)-Doğu (E)-Batı (W) hareketiyle sallayın. Bu sallama protokolünü toplam 3 tur boyunca 2 kez daha tekrarlayın.
    NOT: Hücre dağılımına yardımcı olmaya devam ederken plaka kapağına sıçramasını önlemek için orta kuvvet kullanarak sallayın (lütfen videoya bakın).
  10. 37 °C /% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin.
  11. Hepatositleri çözmeye devam etmeden önce besleyici hücre ekini görüntüleyin.
    NOT: Kabul edilebilir besleyici hücre bağlantısı görsel olarak yaklaşık% 50 birleşiktir.

3. Birincil insan hepatositlerinin çözülmesi, sayılması ve kaplanması (Şekil 1B)

  1. 30 dakikalık besleyici hücre kültürünü takiben, önceden ısıtılmış hepatosit çözme ortamını 0.2 μm polietersülfon (PES) filtre ünitesinden süzün.
  2. PHH'leri 37 ° C'lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözdürün.
    NOT: Uzun süreli maruziyetten kaçının (örn., >2 dakika) çözüldüğünü izleyerek ve ters çevrildiğinde kriyoviyalde sıvı gevşediğinde şişeyi çıkararak.
  3. Çözüldükten hemen sonra PHH'leri buzun üzerine yerleştirin.
  4. Bir BSC'de, PHH süspansiyonunu hepatosit çözme ortamına dökün.
    NOT: Mümkün olduğunda PHH hücresi süspansiyonlarını pipetlemekten kaçının. Çözülmüş PHH'lerin kriyoviyalden çözdürme ortamına transferi sırasında pipetleme yapılmaması çok önemlidir.
  5. Şişeyi 3-4 kez yıkamak için 1000 μL'lik bir pipet kullanın, 1 mL hepatosit/çözülme ortamı süspansiyonunu şişeye hafifçe pipetleyin ve yıkamayı tekrar çözdürme ortamına dökerek toplayın.
  6. Çözülmüş PHH süspansiyonunu 5 kez kapatın ve hafifçe ters çevirin.
  7. RT'de 8 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
  8. Pipetleme veya vakum aspirasyonu ile hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice atın. Konik borunun duvarına 3 mL tam kaplama ortamı ekleyin.
  9. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için konik boruyu yan yana sallayın.
  10. Yeniden süspanse edilen hepatositlere ilave 5 mL tam kaplama ortamı ekleyin.
  11. PHH'leri sayın.
    NOT: PHH'ler, otomatik bir hücre sayacında AOPI veya bir hemasitometre kullanılarak tripan mavisi kullanılarak sayılabilir. Hücre sayımları teknolojiye ve kullanıcıya bağlı olarak değişebilir. En iyi sonuçları elde etmek için, yinelenen örnekleri sayın ve seçilen metodolojide tutarlı kalın.
  12. Tam kaplama ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu istenen tohumlama yoğunluğuna (300.000-600.000 PHH/mL) seyreltin.
    NOT: Optimal hepatosit tohumlama yoğunluğu partiden partiye değişebilir. Belirli bir parti için önerilen tohumlama yoğunluğu, analiz sertifikasında (COA) sağlanacaktır. 24 oyuklu bir plaka için hepatositleri / mL'yi belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın.
    figure-protocol-1
  13. Plakalı besleyici hücrelerden, pipetleme veya vakum aspirasyonu ile ortamı çıkarın.
    NOT: Besleyici hücrelerin canlılığını sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir.
  14. Seyreltilmiş hepatosit süspansiyonunun oyuğu başına 500 μL (150.000-300.000 hücre), besleyici hücreler içeren önceden kaplanmış kollajen 24 oyuklu plaka üzerine hemen plakalayın.
  15. NS yönünde 2 kez ileri geri hareket ederek ve ardından aynı E-W hareketini yaparak plakayı NSEW hareketiyle sallayın. Bu sallama protokolünü toplam 3 tur boyunca 2 kez daha tekrarlayın.
    NOT: Hücre dağılımına yardımcı olurken plaka kapağına sıçramasını önlemek için orta kuvvet kullanarak sallayın.
  16. 37 °C/%5CO2'de 2-4 saat inkübe edin. Kültürün ilk 60 dakikası için, yukarıdaki 3.15 adımında olduğu gibi her 15 dakikada bir N-S-E-W hareketiyle plakayı sallayın.
  17. İnkübasyonun ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve BSC'ye yerleştirin.
  18. Plakayı sallayın ve pipetleme veya vakum aspirasyonu ile tüm kaplama ortamını çıkarın.
    NOT: Kültürün yaşayabilirliğini sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir.
  19. Hemen her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ekleyin.

4. Bakım

  1. 20-30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosunda alikot ve önceden ısıtılmış tam kültür ortamı. 24 oyuklu bir plaka için yaklaşık 13,5 mL ortam gereklidir.
  2. Kültürleri günlük olarak taze, önceden ısıtılmış tam kültür ortamı başına 500 μL ile besleyin.
    NOT: Kültürün yaşayabilirliğini sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir.
  3. Her 7 günde bir taze tam kültür ortamı hazırlayın.

5. Albümin ve üre ölçümü için kültür süpernatan örneklerinin toplanması

  1. 7, 10 ve 14. günlerde, Şekil 1C'de gösterildiği gibi, istenen numune kuyucuğundan/kuyucuklarından 500 μL ortamı bir mikrosantrifüj tüpüne/tüplerine toplayın.
  2. Numuneyi/numuneleri 320 x g'da 10 °C'de 4 dakika boyunca döküntüleri pelet haline getirin.
  3. Numune süpernatan(lar)ını yeni mikrosantrifüj tüp(ler)ine aktarmak için bir pipet kullanın ve peletin bozulmasını önleyin.
  4. Örnekleri albümin ve/veya üre tahlili üzerinde çalıştırın (sırasıyla bölüm 10 ve 11'e bakınız).
    NOT: Numuneler -20 °C ila -80 °C'de 2 hafta saklanabilir.

6. Boyama günü I

DİKKAT: Fiksasyon tamponu Paraformaldehit içerir. Paraformaldehit göz hasarına, cilt tahrişine ve organ toksisitesine neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın.

  1. 14. günde ortam numunelerinin toplanmasını takiben, Şekil 1C'de gösterildiği gibi, boyanacak her bir oyuğa 300 μL fiksasyon tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. En az 2 kuyu boyayın.
  2. 4 °C'de 20-60 dakika inkübe edin.
  3. 45 mL 1x PBS'ye 5 mL 10x stok çözeltisi ekleyerek 1x geçirgenleştirme tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: 1x geçirgenlik tamponu 4°C'de 1 ay saklanabilir.
  4. Buz üzerinde 300 μL 1x geçirgenlik tamponu ile 2 kez yıkayınız.
  5. Buz üzerinde 1x geçirgenleştirme tamponunda 1:1000 seyreltme kullanarak 300 μL primer antikor sitokeratin 18 ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Minimal olarak, yalnızca ikincil bir antikor kontrolü için 1x geçirgenlik tamponu ile bir kuyu inkübe edin.
  6. 4 °C'de 16-24 saat inkübe edin.

7. Boyama günü II

  1. Ertesi gün, birincil antikoru pipetleme veya vakum aspirasyonu ile çıkarın.
  2. Buz üzerinde 1x geçirgenlik tamponu kuyusu başına 300 μL ile 2 kez yıkayın.
  3. 1x geçirgenleştirme tamponunda 1:500 seyreltme kullanarak 300 μL floresan ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (yalnızca ikincil kontrol dahil).
    NOT: Floresan antikorları kullanırken ışıktan kaçının.
  4. Karanlıkta 4 °C'de 30-45 dakika inkübe edin.
  5. İkincil antikoru pipetleme veya vakum aspirasyonu ile çıkarın.
  6. Buz üzerinde 1x geçirgenlik tamponu kuyusu başına 300 μL ile 2 kez yıkayın.
  7. 1x PBS'nin kuyusu başına 300 μL ile 1 kez yıkayın.
  8. Her bir kuyucuğa 150 μL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) montaj ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karanlıkta RT'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Plaka parafilme sarılabilir ve 4 °C'de karanlıkta 1 hafta saklanabilir.
  9. Floresan mikroskop altında görüntüleyin. 10x objektif lensi kullanarak her bir kuyucuk için her bir floresan kanalın 5 görüntüsünü yakalayın (bir görüntünün ölçek çubuğuna sahip olduğundan emin olun).
    NOT: DAPI, 358 nm/461 nm'lik bir uyarma/emisyona sahiptir. Hem DAPI hem de ikincil antikor floroforu için uygun algılama filtreleriyle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın.

8. ImageJ analizi (Şekil 2)

NOT: ImageJ Sürüm 1.52a veya üzerinin kullanılması önerilir.

  1. ImageJ'de ölçek çubuğu içeren bir görüntü açın. Düz Çizgi simgesine tıklayın ve ölçek çubuğunun tam uzunluğuna bir çizgi çizin [Şekil 2 (1)]
    NOT: Gerekirse, yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için Camı Büyüt simgesine tıklayın.
  2. Analiz sekmesine tıklayın. Ölçeği Ayarla'yı vurgulayın ve tıklayın.
  3. Bilinen Uzaklık'ı ölçek çubuğunun uzaklığına değiştirin. Uzunluk Birimleri'ni ölçek çubuğunun birimleriyle değiştirin. Global'i işaretleyerek ayarları genel olarak uygulayın. Ölçeği ayarlamak için Tamam'ı tıklatın.
    NOT: Bu ayar uygulandıktan sonra, açılan her görüntü, kullanıcı tarafından girilen birimlerde görüş alanının hesaplanan alanını gösterecektir.
  4. ImageJ'de yalnızca DAPI görüntüsü açın. İşlem sekmesine tıklayın ve Arka Planı Çıkar'ı vurgulayın. Lekelenmemiş alanlar siyah olana kadar arka planı bir seferde 50 piksel kaldırın.
    NOT: Görüntü arka plan içermiyorsa, bu adım gerekli değildir.
  5. Görüntü sekmesine tıklayın ve Tür'ü vurgulayın. Görüntüyü gri tonlamalı yapmak için 8 bit'e tıklayın [Şekil 2 (2)].
  6. Tüm DAPI parçacıklarını dahil etmek için görüntüyü manuel veya otomatik olarak eşikleyin (eşiği manuel olarak aşmamaya dikkat edin) [Şekil 2 (3)]. Image ( Görüntü ) sekmesini tıklatın ve Adjust (Ayarla) seçeneğini vurgulayın. Eşik'i tıklayın. Tamamlandığında Uygula'yı tıklayın.
  7. İşlem sekmesine tıklayın ve İkili'yi vurgulayın. Watershed'i tıklayın.
  8. Analiz sekmesine tıklayın ve Parçacıkları Analiz Et'i vurgulayın /tıklayın [Şekil 2 (4)]. Boyutu 5-Sonsuz ve Daireselliği 0,00-1,00 olarak ayarlayın. Göster açılır sekmesinde Anahatlar'ı seçin. Sonuçları Görüntüle, Özetle ve Delikleri Dahil Et işaretli olduğundan emin olun. Tamam'a tıklayın.
    NOT: Eşikleme arka plan pikselleri veriyorsa, istenen parçacık aralığı ayarlanabilir.
  9. Sayım sonucunu TOPLAM DAPI olarak kaydedin.
  10. ImageJ'de birleştirilmiş bir Cytokeratin 18/DAPI görüntüsü açın.
  11. Sitokeratin 18 için boyanmamış tüm DAPI parçacıklarını manuel olarak saymak için Çok Noktalı [Şekil 2 (5)] simgesini kullanın.
  12. Sonucu BESLEYİCİ HÜCRELERİ olarak kaydedin. Hepatosit DAPI'yi belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın.
    Hepatosit DAPI = Toplam DAPI - Besleyici Hücre DAPI

9. Toplam bağlı hepatositlerin kantitasyonu ve bağlanma yüzdesi (Plateabilite)

  1. Aşağıdaki denklemi kullanarak 24 oyuklu kültür alanı için bir ölçek faktörü oluşturun. Görüş alanı ölçümleri, açılan her görüntünün üst kısmında bulunabilir [Şekil 2 (2), yeşil kutu].
    figure-protocol-2
  2. Aşağıdaki denklemi kullanarak toplam bağlı hepatositleri hesaplayın.
    Bağlı Hepatositler = Ölçek faktörü × Hepatosit DAPI
  3. Aşağıdaki denklemi kullanarak hepatositlerin bağlanma yüzdesini hesaplayın.
    figure-protocol-3

10. Albümin tahlili

  1. 1:200'de seyreltilmiş numuneler üzerinde bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak albümin üretimini ölçün.
    NOT: Doğruluk için kullanıcı, numunelerin standart eğri doğrusal aralığına düştüğünü onaylar. Belirtilen kit, testi gerçekleştirmek için tüm malzemeleri ve talimatları sağlar.
  2. Aşağıdaki denklemi kullanarak numune konsantrasyonlarını bağlı hepatositlere normalleştirin.
    figure-protocol-4

11. Üre testi

DİKKAT: Kan üre azotu (BUN) asit reaktifi sülfürik asit içerir. BUN asit reaktifindeki sülfürik asit konsantrasyonu aşındırıcı olarak kabul edilir. Yutmayın. İyi havalandırılan bir alanda çalışın ve uygun KKD giyin.

  1. Üre sentezi, modifiye edilmiş bir diasetil monoksim yöntemi kullanılarak ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Standart #1 (100 μg / mL) yapmak için 53.3 μL 75 mg / dL üre 346.7 μL tam kültür ortamına seyreltin
  3. Tüpleri 2-8 olarak etiketleyin ve üre tahlili standartlarını oluşturmak için 1:2 seri seyreltme kullanın (Tablo 1).
  4. Siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 10 μL numune veya standart ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Numune içeren her bir kuyucuğa 150 μL BUN reaktifi ekleyin. BUN renk reaktifinin 1/3'ünü 2/3 BUN asit reaktifi ile karıştırarak BUN reaktifini hazırlayın. Hesaplamalara yardımcı olması için aşağıdaki denklemi kullanın.
    figure-protocol-5
    BUN renk reaktifi (mL) = Toplam BUN Reaktifi Gereken × 0.333
    BUN asit reaktifi (mL) = Gereken Toplam BUN Reaktifi × 0.667
  6. Plakayı 60 °C'de bir fırında veya inkübatörde 90 dakika inkübe edin.
  7. Plaka absorbansını hemen 540 nm ve 650 nm'de okuyun.
  8. Tüm örneklerden ve standartlardan boşluk ve arka plan absorbansını (650 nm) çıkararak standart bir eğri oluşturun. Doğrusal regresyon analizi ile en uygun çizgiyi oluşturun.
  9. Standart eğriden bilinmeyen numune konsantrasyonunu belirleyin.
  10. Aşağıdaki denklemi kullanarak numune konsantrasyonlarını bağlı hepatositlere normalleştirin.
    figure-protocol-6

Sonuçlar

Hepatik kültür sisteminin genel kaplama, kültürleme ve temel işlevsellik testi yöntemi, Şekil 1'de gösterildiği gibi ortak birincil hücre kültürü tekniklerini ve analizini içerir. Hepatosit bağlanması ve yüzde plateabilite, 14. günde, Sitokeratin 18 ve DAPI boyamanın en az beş görüntüsünün ImageJ analizi kullanılarak hesaplandı (Şekil 2). Besleyici hücrelerle kültürlenen PHH'lerin temsili görüntüleri Şekil 3'te gösterilmektedir. Çeşitli hepatik tohumlama yoğunlukları, tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak görsel birleşme farklılıkları gösterdi ve 14 günlük kültür için tipik hepatik, küboidal morfolojiyi korudu. Test edilen her tohumlama yoğunluğu için hepatosit donör lotları A ve B'nin görüntüleri yakalandı (Şekil 4A

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6








Tartışma

Tarif edilen hepatik kültür sistemi, standart doku kültürü enstrümantasyonu ile donatılmış laboratuvarlarda kurulabilir. Besleyici hücrelerle kültürlenen PHH'lerden oluşan sistem, kullanıcının stabil albümin üretimi ve üre sentezi ile en az iki hafta boyunca PHH'leri kültürlemesine izin verir. PHH donör lot değişkenliği nedeniyle, sistemde kullanılmak üzere yalnızca önceden taranmış ve nitelikli PHH'lerin kullanılması önerilir. Bağlı PHH'lerin sayısı donör lotuna ve tohumlama yoğunluğuna göre değişse de, nispi plakalanabilirlik her donör lotunda benzer kalır. Önerilen tohumlama yoğunlukları tavsiye edilirken, yukarıdaki veriler hepatosit tohumlama yoğunluğunun farklı deneysel ihtiyaçlar için ayarlanabileceğini göstermektedir; bununla birlikte, daha fazla sayıda PHH'nin tohumlanmasının daha yüksek veya daha tutarlı fonksiyonel çıktılar sağlamayabileceğine dikkat edilmelidir. Değerlendirilen PHH lotlarının analizi, 150.000 PHH / kuyu ve 200.000 PHH / kuyu daha düşük tohumlama yoğunlukları kullanılarak albümin üretimi ve üre sentezi için en düşük CV'yi gösterdi; Bununla birlikte, herhangi bir tohumlama yoğunluğunda albümin ve üre arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. 250.000 PHH / kuyu ve 300.000 PHH / kuyu daha yüksek tohumlama yoğunlukları, 14 günlük kültür periyodu boyunca albümin ve ürede daha büyük bir azalma gösterir. Plakabilitedeki doğal donör değişkenliği, test edilen donör lotları için 250.000 PHH / kuyu ve 300.000 PHH / kuyuda albümin üretimi ve üre sentezinin tutarlılığını etkileyebilir. Büyük hepatosit sferoidlerine benzer şekilde, TV2D+ sisteminde PHH'lerin aşırı tohumlanması, PHH'lerin uzun vadeli kültürü ve işlevselliği üzerinde olumsuz etkilere sahip olabilir.

Çözdürme, kaplama ve bakımdaki tüm adımlar, başarılı kültür ve veri üretimi için kritik öneme sahiptir; Ancak, deneyimsiz kullanıcıların kaçınabileceği birkaç yaygın hata vardır. PHH'ler, sıcaklık dalgalanması, kayma gerilimi ve havaya maruz kalma 9,10'a bağlı hasara karşı oldukça hassastır. Uzun süreli çözdürme sürelerinden ve aşırı pipetlemeden kaçınmak için PHH'ler çözülürken önlemler alınmalıdır. Bir el dökme yönteminin, bir zamanlayıcının ve su banyosundan buza anında transferin kullanılması, PHH'lerin canlılığını ve plakalanabilirliğini etkileyebilecek bu yaygın hataları azaltacaktır. Ek olarak, tedarik zinciri sorunlarının daha yaygın hale gelmesiyle birlikte, kolajen kaplı plakalar elde etmek zor olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için kollajen tip I (5-10 μg/cm2) ticari solüsyonlar kullanılarak doku kültürü ile muamele edilmiş plakaların manuel olarak kaplanması kullanılabilir; Bununla birlikte, optimum performans ve tutarlılık için önceden kaplanmış kollajen plakaların kullanılması önerilir. Yalnızca besleyici hücre kültüründen PHH'lerin eklenmesine geçiş sürecinde, besleyici hücre tabakasının kurumasını önlemek kritik öneme sahiptir. Besleyici hücrelerin havaya maruz kalmasına asla izin vermeyin. Herhangi bir havaya maruz kalma süresi, uzun vadeli PHH kültürünü olumsuz yönde etkileyecek olan düşük besleyici hücre katmanı kalitesine yol açabilir. Ortam değişiklikleri arasında az miktarda artık ortamın kalmasına izin vermek en iyi uygulamadır. Bazen, PHH'ler izolasyondan kaynaklanan aşırı kalıntılar içerebilir ve bu da morfolojinin görüntülenmesini zorlaştırabilir. Bu soruna yardımcı olmak için, orta bir değişiklikten önce plakayı sallayın ve vakum aspirasyonu kullanın. Son olarak, bir ortam değişikliği gerçekleştirirken, kültürlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek harcanan ortamı dikkatlice aspire edin. Doğrudan hücre katmanına pipetlemeyi önlemek için kuyunun kenarından aşağı doğru taze orta hacimde pipetleyin. Kullanıcı ayrıca önerilen 3 kuyulu değişimi kullanarak her ortam değişiminde havaya maruz kalmaktan kaçınmalıdır (Bölüm 3 ve 4). Ayrıca günlük bir ortam değişikliğinin ideal olduğu ancak gerekli olmadığı da unutulmamalıdır.

Floresan mikroskoplar çoğu laboratuvarda yaygın hale gelse de, belirli görüntü analizi yapmak için gereken yazılım ek masraflara neden olabilir. ImageJ ücretsiz olarak indirilebilir, bu da onu kolay erişilebilir bir görüntü analiz aracı haline getirir. Protokoldeki adımlar, kullanıcının özellikle DAPI boyamanın partikül analizini optimize etmesi gerekebilecek bir temel sağlar; bununla birlikte, floresan görüntüleme yeteneğinin yokluğunda, 14. gündeki PHH bağlantı değerleri, partiye özgü analiz sertifikalarında sağlanır. Zayıf eşikleme, DAPI parçacıklarının yanlış sayılmasına neden olacaktır. Ayrıca, bir boyut hariç tutma ayarlamadan önce tek tek DAPI parçacıklarının yüzey alanını kontrol etmeniz önerilir. Bu, Oval simgesi [Şekil 2 (1), Düzenle sekmesinin altındaki daire simgesi] kullanılarak ve DAPI parçacığını kapsayan bir daire çizilerek elde edilebilir. Analiz sekmesi daha sonra seçilen DAPI parçacığının alanını ölçmek için kullanılabilir. Belirli ölçümler, Analiz sekmesi altındaki Ölçümleri Ayarla kullanılarak seçilebilir [adım 8.9 ve Şekil 2 (4)].

PHH'lerin kültürlenmesine yönelik mevcut yöntemler, geleneksel 2 boyutlu monokültürde hücre bağlanmasını artırmak için kolajen-I gibi kaplamalarınkullanılmasını içerir 11 veya yaygın olarak "sandviç kültürü" olarak adlandırılan bir teknik olan murin bazlı Matrigel gibi hücre dışı bir matris ile kaplamayı içerir12,13,14,15. Sandviç kültürü tekniği, geleneksel monokültüre kıyasla zaman içinde PHH morfolojisini ve polaritesini geliştirirken, her iki yaklaşım da çoğu kaplanabilir PHH için kültürde uzun vadeli fenotipik stabiliteden yoksundur. PHH'leri kültürlemek için kullanılan başka bir yöntem de 3D sferoidler yapmaktır; bununla birlikte, Glicklis ve ark.4 tarafından daha önce belirtildiği gibi, donör değişkenliği nedeniyle sferoid boyutunun tekrarlanabilirliği ile ilgili teknik zorluklar olabilir. Fizyolojik olarak daha uygun bir karaciğer modeli yapmak için çok hücreli modeller geliştirilmiştir. Ware ve ark.7 tarafından tanımlandığı gibi, mikropaternleme, murin fibroblastları ve PHH'lerle çevrili primer insan karaciğer sinüzoid endotel hücrelerinin kullanılması, daha uzun in vitro kültür sürelerini mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, mikro modelleme karmaşık ve zaman alıcı bir süreç olabilir ve insan olmayan besleyici hücreler, metabolik sinyallerde arka plana katkıda bulunabilir ve bu platformun belirli uygulamalarda kullanımını sınırlayabilir. Hepatositlerin ko-kültürü için besleyici hücreler olarak insan ve sıçan dermal fibroblastları ve sığır aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli karaciğer dışı hücrelerin kullanımı, karaciğer kökenli besleyici hücrelerin ko-kültürlerine benzer albümin sekresyonu ve sıkı bağlantı oluşumu göstermiştir16. Bununla birlikte, bu sistemdeki PHH'lerin stabilitesi ve işlevselliği üzerindeki etkiyi daha iyi anlamak için TV2D+ karaciğer olmayan besleyici hücreler ile kültürdeki PHH'ler arasındaki etkileşim mekanizmasının daha fazla araştırılması gerekmektedir. Daha önce Weaver ve ark.8 tarafından tarif edilen kültür sistemi, hepatik kolonilerde PHH'leri 42 güne kadar başarılı bir şekilde kültürleyebilir ve geniş safra kanalı ağları oluşturabilir. Bu sistemde kültürlenen PHH'ler, Sitokrom 1A2, 2B6 ve 3A4 aktivitesi ve Üridin 5'-difosfo-glukuronosiltransferaz (UGT) bazlı enzim aktivitesi, faz I ve II metabolit oluşumu, albümin üretimi ve üre sentezi dahil olmak üzere temel hepatik işlevselliği korudu in vitro Matrigel olmadan en az 22 gün. Bu kültür sistemi, farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için herhangi bir laboratuvara kolayca uyarlanabilen kararlı, fizyolojik olarak ilgili çıktılar üretir. TV2D+ sisteminde temel PHH işlevleri korunsa da, 3D küresel modelle doğrudan bir karşılaştırma yapılmamıştır; bununla birlikte, aynı PHH donörlerini kültür sistemleri arasında karşılaştıran gelecekteki çalışmalar, her iki yöntemin sınırlarını ve avantajlarını belirlemede değerli olacaktır.

TV2D+'nın potansiyel uygulamaları arasında düşük cirolu bileşiklerin metabolik klerensinin ve ilaç-ilaç etkileşimlerinin değerlendirilmesi, ilaca bağlı karaciğer hasarı ve zirai kimyasalların risk değerlendirmesi yer alır. Yeni ve gelişmekte olan ilaçların hepatik klerensini doğru bir şekilde tahmin etmek, düşük cirolu bileşikleri değerlendirirken özellikle zor olan temel hepatoselüler işlevselliğin korunması ile stabil ve uzun süreli bir PHH kültürüne dayanır. Ek olarak, risk değerlendirmesi ve kimyasal kaynaklı karaciğer toksisitesi önemli sağlık sorunlarıdır ve mevcut modeller, akut maruziyete ikincil olabilecek potansiyel kronik kimyasal toksisiteyi doğru bir şekilde değerlendirmek için kültürde uzun vadeli stabilite ve işlevsellik sağlamamaktadır. TV2D + 'da kültürlenen sağlıklı ve hastalıklı PHH'ler, zaman içinde korunan fonksiyon ve lipid eğiliminde karakteristik farklılıklar gösterdi17. Bu çalışmalar, TV2D+'ı çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için umut verici bir araç olarak desteklemektedir.

Açıklamalar

JO, LW, EG, EL, SP ve JW, TV2D+ üreten kar amacı gütmeyen bir kuruluş olan LifeNet Health'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Mellissa Keller ve Wendy Hetman'a el yazması ve şekil incelemesi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mikro; m PES  Filtre ünitesi Thermo Fisher Bilimsel 565-0020Kullanıcı tercihi 
15 mL veya 50 mL konik tüplerThermo Fisher Scientific 352196 veya 352070Kullanıcı tercihi 
Alexa Fluor 555, keçi anti-tavşanThermo Fisher Scientific A-21428Diğer ikincil antikorlar
çalışabilir Anti-Sitokeratin 18 antikoru abcamab24561Aynı seyreltme AOPI
  kullanılarak gerekli;Nexcelom CS2-0106-5mLCellometer sayımı için kullanılır 
Biyogüvenlik kabini Labconoco3460801Kullanıcı tercihi 
Siyah duvarlı, şeffaf altlı, 96 oyuklu plaka Thermo Fisher Bilimsel 165305Kullanıcı tercihi 
SantrifüjThermo Fisher Scientific Sorvall X4R400 x g'a kadar hız yapabilen
Kollajen kaplı plaka, 24 oyukluGreiner Bio-One662950Sıçan kuyruğu kollajen kaplama
Slaytları saymaNexcelom CHT4-SD100-002Cellometer sayımı için kullanılır 
Kültür ortamı LifeNet Sağlık MED-TCCM
Kültür takviyesi LifeNet Sağlık MED-TCSC
DAPI Thermo Fisher Bilimsel 00-4959-52Montaj ortamı
DPBS (-Ca, -Mg)Thermo Fisher Scientific 14190250Kullanıcı tercihi 
Besleyici hücre takviyesi LifeNet Sağlık MED-TCSA
Besleyici hücre çözme ortamıLifeNet Health MED-FCTM
Floresan mikroskobu ZeissAxioObserver Z1Kullanıcıya özel filtrelerle donatılmıştır 
Hepatosit çözme ortamıLifeNet Health MED-HHTM4C-50ML
İnsan albümini ELISA kiti abcamab108788Aynı seyreltme kullanılıyorsa gerekli
İnsan besleyici hücrelerLifeNet Health PHFC24
Nemlendirilmiş inkübatör VWR97025-842%5 CO2 
>IC Fiksasyon tamponuThermo Fisher Scientific 00-8222-49Paraformaldehit bazlı, %10 formalin de kullanılabilir
ImageJNational Insitute of Health Sürüm 1.52a 1.52a veya daha yüksek 
Ters faz kontrast mikroskobu OlympusCK40-F100Kullanıcı tercihi 
Mikrosantrifüj tüpleriVWR20170-022Kullanıcı tercihi 
Mikropipetler (çeşitli boyutlarda)USA Scientific ErgoOneKullanıcı tercihi 
Geçirgenlik tamponu (10x)Thermo Fisher Scientific 00-8333-56Diğer geçirgenlik tamponları çalışabilir
Plaka okuyucu BMG LabtechCLARIOstarOkuma absorbansı 450-640 nm
Kaplama ortamı LifeNet Sağlık MED-TCPM
Kaplama takviyesi LifeNet Sağlık MED-TCSB
Primer insan hepatositleri LifeNet Sağlık çeşitli Katalog numarası lot numarasına göre değişiklik gösterebilir
İkincil antikor Thermo Fisher Bilimsel A-21428Kullanıcı tercihi 
Serolojik pipet kontrolörüGilson F110120Kullanıcı tercihi 
Saklama şişesi 100 – 500 mL VWR76311-770Kullanıcı tercihi 
Üre Azotu (BUN) Testi Stanbio0580-250
Su banyosuPolyScienceWBE0537 ° C'de kullanım için uygundur; Ç
içerir

Kaynaklar

  1. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  2. Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
  3. Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
  4. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  5. Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
  6. Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506(2021).
  7. Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
  8. Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504(2023).
  9. Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
  10. Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
  11. Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
  12. Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
  13. Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
  14. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  15. Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  16. Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
  17. Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer İnsan HepatositleriHepatosit EkimiUzun Süreli KültürFenotipik StabiliteBesleyici HücrelerKolajen Kaplı PlakalarEkim YoğunluğuHepatik Marker Ekspresyonu
İlaç Geliştirme Uygulamaları için Tüm İnsanlardan Oluşan Bir Hepatik Kültür Sistemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.