Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

Son yirmi yılda, fare kesici dişi, yetişkin kök hücre regülasyonu ve diş rejenerasyonu^ilkelerini araştırmak için paha biçilmez bir platform olarak ortaya çıkmıştır ^1,2. Fare kesici diş sürekli büyür ve hayvanın yaşamı boyunca kendini yeniler. Bunu, kendi kendini yenileyebilen ve dişin farklı hücre tiplerine farklılaşabilen hem epitelyal hem de mezenkimal kök hücreleri koruyarak yapar ^1,2. Dental epitelyal kök hücreler mine matriksini salgılayan ameloblastlara yol açarken, dental mezenkimal kök hücreler sırasıyla dentin, sement ve periodontal ligament oluşturan odontoblastlara, sementoblastlara ve fibroblastlara yol açar 3,4,5,6. Bu sürekli yeni hücre kaynağı, doku homeostazını korur ve çiğneme aşınması veya yaralanmalar nedeniyle kaybedilen eski hücrelerin değiştirilmesine izin verir ^7,8. Bu nedenle, dental kök hücrelerin korunmasını ve farklılaşmasını düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması, artan bir ilgi alanı olan dental rejenerasyonu anlamanın merkezinde yer almaktadır.

Anatomik olarak, yetişkin fare kesici dişinin büyük bir kısmı çene kemiği ile kaplıdır. Dişin insizal kenarı açıktayken, kesici dişin apikal ucu bir yuvaya oturur ve periodontal ligamentler ve bağ dokuları aracılığıyla çevre kemiğe sıkıca tutunur (Şekil 1A,B). Kesici dişin apikal ucu aynı zamanda dişin büyüme bölgesidir ve hem epitel tabakasında hem de mezenkimal pulpada diş sapı ve progenitör hücreleri korur 9,10,11,12,13. Spesifik olarak, diş epitelyal kök hücreleri, apikal tomurcuk olarak bilinen ve labial servikal döngü olarak da adlandırılan epitelin soğanlı ucunda tutulur (Şekil 1C). Bağırsak epiteli ve epidermise benzer şekilde, kesici dişteki epitelyal yenilenme, öncelikle aktif olarak döngüsel kök hücreler ve bunların transit-amplifikasyon hücreleri ^14,15,16,17 olarak adlandırılan, her ikisi de servikal döngünün iç kısmında bulunan yüksek oranda proliferatif ara torunları tarafından desteklenir. Bununla birlikte, kesici epitelin rejenerasyon sırasında hareketsiz kök hücreler içerip içermediği ve kullanıp kullanmadığı henüz belirlenmemiştir. Buna karşılık, apikal pulpada hem aktif hem de hareketsiz dental mezenkimal kök hücreler tanımlanmıştır ve hareketsiz kök hücreler, yaralanma onarımı sırasında aktive olan bir yedek popülasyon olarak işlev görür^13,18.

Fare kesici dişlerin yenilenmesi ve yenilenmesinin biyolojisi üzerine yapılan keşiflerin çoğu, örneklerin farklı zamansal kavşaklarda elde edildiği, sabitlendiği, işlendiği ve daha sonra belirli bir düzlem boyunca mikron inceliğinde dilimler halinde bölümlere ayrıldığı histolojik araştırmalardan kaynaklanmıştır. Bilim adamları, soy takibini veya genetik bozulmaları mümkün kılan farklı fare modellerinden alınan histolojik kesitlerin ayrıntılı analizi yoluyla, farklı progenitör popülasyonların hücre soylarının yanı sıra kesici diş homeostazını ve yaralanma onarımını kontrol eden genetik ve sinyal yollarını tanımladılar ^19,20,21. Bununla birlikte, bölümlerdeki hayati olmayan hücrelerin statik iki boyutlu (2B) görüntüleri, hücre şekli değişiklikleri, hareketleri ve hücresel kinetik gibi canlı dokudaki hücresel davranışların ve uzamsal organizasyonların tam spektrumunu yakalayamaz. Doku kesiti ile çözülemeyen bir zaman ölçeğinde meydana gelen bu hızlı hücresel değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek farklı bir strateji gerektirir. Ayrıca, bu tür bilgileri edinmek, diş hücrelerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini, farklı sinyal uyaranlarına nasıl tepki verdiğini ve doku yapılarını ve işlevlerini korumak için kendi kendini nasıl organize ettiğini anlamak için de kritik öneme sahiptir.

Üç uzamsal boyutu zamansal çözünürlükle bütünleştiren bir teknoloji olan iki foton mikroskobu²² kullanılarak dört boyutlu (4D) derin doku görüntülemenin ortaya çıkışı, kültürlenmiş doku eksplantlarının, organoidlerin ve hatta dokuların yerinde uzay-zamansal incelemesini sağlayarak histolojik analizin doğal sınırlamalarının üstesinden gelir 23,24,25,26 . Örneğin, gelişmekte olan diş epitelinin 4 boyutlu canlı görüntülemesi, doku büyümesini, sinyal merkezi oluşumunu ve diş epitel morfogenezini koordine eden hücre bölünmelerinin ve göçlerinin uzay-zamansal modellerini ortaya çıkarmıştır 27,28,29,30,31,32. Yetişkin fare kesici dişinde, 4D görüntüleme son zamanlarda diş epitel yaralanması onarımı sırasında hücresel davranışları incelemek için uyarlanmıştır. Canlı görüntüleme, suprabazal tabakadaki stratum intermedium hücrelerinin, hasarlı epiteli yeniden oluşturmak için bazal tabakada doğrudan ameloblastlara dönüştürülebileceğini ortaya koydu ve geleneksel epitel hasarı onarımı paradigmasına^{meydan okudu 15}.

Burada, labial servikal döngüdeki epitel hücrelerine odaklanarak yetişkin fare kesici dişinin diseksiyonunu, kültürlenmesini ve görüntülenmesini açıklıyoruz (Şekil 1). Bu teknik, diş hücresi canlılığını 12 saatten fazla korur ve floresan etiketli hücrelerin tek hücre çözünürlüğünde canlı olarak izlenmesine izin verir. Bu yaklaşım, hücre hareketi ve göçünün yanı sıra normal kültür koşulları altında veya genetik, fiziksel ve kimyasal bozulmalara yanıt olarak hücre şekli ve bölünme oryantasyonundaki dinamik değişikliklerin araştırılmasına izin verir.

Tüm fareler, California Los Angeles Üniversitesi'nde (UCLA) veya Kudüs İbrani Üniversitesi'nde (HUJI) patojen içermeyen hayvan tesislerinde tutuldu. Fareleri içeren tüm deneyler, ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan yönetmelik ve protokollere göre gerçekleştirildi (ARC-2019-013; UCLA) veya (MD-23-17184-3; HUJI). Deneysel adımların genel bir iş akışı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm aletler, reaktifler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Çözelti ve jellerin hazırlanması

1. Diseksiyon ortamı: %0,5 glikoz içeren taze DMEM/F12 hazırlayın ve adım 2.4'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun.
   NOT: Canlı görüntüleme sırasında otofloresansı azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen DMEM/F12 kullanıyoruz.
2. 1x Kültür ortamı:% 50 DMEM / F12,% 50 sıçan serumu,% 1 glutamin ikamesi, 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz,% 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin kullanarak taze ortam hazırlayın. Adım 5.5'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun. Bu besiyeri, canlı görüntüleme sırasında kesici diş eksplantlarını kültürlemek için kullanılır.
   NOT: Sıçan serumu yüksek kalitede olmalı ve araştırmacılar tarafından veya ticari bir kaynaktan tüm doku kültürü için özel olarak hazırlanmalıdır. Özellikle, pıhtılaşma oluşmaya başlamadan önce kan santrifüj edilmelidir (oda sıcaklığında 1.200 × g'da 5 dakika). Santrifüjlemeden sonra ortaya çıkan fibrin pıhtısı sıkılmalı ve atılmalıdır³³.
3. Kültür jeli: Jelin amacı, görüntüleme sırasında numuneleri hareketsiz hale getirmektir ve taze olarak hazırlanır.
   1. Bir mikrodalga kullanarak 200 mg düşük erime noktalı agarozu 10 mL DMEM/F12 içinde çözerek DMEM/F12'de% 2 jel yapın. %2'lik jeli 37 °C'de tutun.
   2. % 50 sıçan serumu, 1 x glutamin ikamesi, 1 x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz, 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin karıştırarak 2x kültür ortamı (DMEM / F12 olmadan) yapın. 2x kültür ortamını (DMEM/F12 olmadan) 37 °C'ye ısıtın.
   3. Eşit hacimlerde% 2 jel ve 2x kültür ortamını (DMEM / F12 olmadan) karıştırarak% 1 kültür jeli yapın. Adım 5.1'de ihtiyaç duyulana kadar% 1 kültür jelini 37 ° C'de tutun.
      NOT: Jelleşmeyi önlemek için karıştırmadan önce tüm solüsyonların sıcak olduğundan emin olun. Yetişkin fare kesici dişlerini kültürlemek için %1 jelin uygun olduğunu gördük. Diğer dokular kültürlenecekse jel yüzdesi ampirik olarak belirlenmelidir.

2. Yetişkin fare mandibulalarının çıkarılması

1. IACUC tarafından onaylanan standart prosedürleri kullanarak fareleri istenen yaşta ötenazi yapın.
   NOT: Burada CO₂ boğulmasını takiben servikal çıkık kullanıyoruz. Hayvan ötenazisi için düzenlemeler farklı bölgelerde farklılık gösterebilir. Araştırmacılar, deneyleri gerçekleştirmeden önce gerekli kurumsal onayı almalı ve yerel hayvan bakımı yönetmeliklerine uygunluğu sağlamalıdır.
2. Fareyi% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
3. Farenin başını kesin ve sol ve sağ mandibulaları çıkarın.
   1. Fareyi karnının üzerine yatırın, ardından boyun bölgesini kesmek ve fare kafasını vücudun geri kalanından ayırmak için #9 tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçağı kullanın.
      NOT: Farenks veya boyun bölgesinden de dokular toplanacaksa, dekapitasyon yapılmamalıdır ve doğrudan adım 2.3.2'ye geçilebilir.
   2. Fareyi ventral tarafı yukarı bakacak ve mandibulalara kolayca erişilebilecek şekilde ters çevirin.
   3. Hayvanın başını başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe tutarak sabitleyin.
   4. Alt çenenin derisini alt dudaktan boyun çizgisine doğru kesen orta sagital bir kesi yapmak için tıraş bıçağını kullanın.
      NOT: İnsizyon ve sonraki diseksiyonları yapmak için #15 cerrahi bıçak da kullanılabilir (adım 2.3.6-2.3.9).
   5. Kesi yapılırken, altındaki kasları ve çene kemiğini ortaya çıkarmak için başparmak ve işaret parmağını kullanarak kesilen deriyi açın.
   6. Alt çenenin bukkal tarafındaki masseter kaslarını kesmek için tıraş bıçağını kullanın, böylece sol ve sağ yarımların dış kısmı artık kas eklerinden arınmış olur.
   7. Oradaki kas eklerini çıkarmak için mandibulanın iç tarafındaki mylohyoid kasları kesin.
   8. İki hemimandible'ı birbirine bağlayan mandibular simfizde başka bir kesi yapın. Kesildikten sonra mandibula sol ve sağ yarıya ayrılacaktır.
   9. Tıraş bıçağını mandibular kondil ile temporal mandibular eklem arasına sıkıştırın ve hemimandible'ı başın geri kalanından dikkatlice çıkarın.
      NOT: Keserken aynı anda kesici dişi nazikçe çekmeyi faydalı bulduk. Alt çenenin kırılmamasına ve içindeki yumuşak dokulara zarar vermemesine özen gösterilmelidir.
4. Diseke edilmiş mandibulaları önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı ile hemen bir Petri kabına aktarın (adım 1.1) ve kalan kas dokularını #15 cerrahi bıçak kullanarak çıkarın.
   NOT: Numunelerin soğuk ortamda tutulması, hücre aktivitelerini yavaşlatır, bu da canlı görüntüleme sırasında proliferasyon veya hücre hareketi gibi belirli hücre aktivitelerinin gecikmeli ve hatta başarısız bir şekilde geri kazanılmasına neden olur.

3. Tüm fare kesici dişlerinin izolasyonu

NOT: Kesici dişin daha fazla izolasyonu, parlak alan diseksiyon mikroskobu altında yapılır.

1. Kesici diş yuvasını kaplayan ve kesici dişin apikal kısmını barındıran mandibulanın oval bölgesini görsel olarak tanımlayın.
2. Mandibulayı iç (lingual) yüzey yukarı bakacak şekilde konumlandırın.
3. Mandibulayı bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, kondilden azı dişlerine doğru bir yönde #15 cerrahi bıçak kullanarak üstteki zar kemiğini tıraş ederek oval bölgede bir pencere oluşturun. Bu, apikal kesici dişin yumuşak dokusunu iç yüzeyde ortaya çıkarır.
4. Mandibulayı, dış (bukkal) yüzey yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
5. Adım 3.3'te açıklandığı gibi dış mandibuladaki oval bölgede bir pencere oluşturun ve kenarda kalan kemik parçalarını almak için neşterin ucunu kullanın. Dişin apikal ucunun her iki taraftan da görünür olduğundan emin olun.
   NOT: Alttaki yumuşak dokuya zarar vermemek için kemikleri tıraş ederken aşırı basınçtan kaçının.
6. Tüm dişi izole etmek için kesici dişi çevreleyen kemikleri sistematik olarak kesin.
   1. Önce kondiler işlemi çıkarmak için apikal kesici dişin hemen bitişiğindeki bir düzlemde temiz bir kesim yapın.
      NOT: Kesici dişi kesmemeye dikkat edin.
   2. 3. azı dişinin hemen arkasında, ancak dişe zarar vermeden kesici dişin dorsalinde ikinci bir kesi yapın. Bu, koronoid süreci içeren kemiği çıkarır.
   3. Ventral mandibulayı kademeli olarak kademeli olarak çıkarmak için açısal işlemin ucundan kesici kısma doğru seri olarak kesin.
      NOT: Diş epiteli ve ilişkili periodontal dokular genellikle kemiğe yapışır ve ventral kemiğin büyük bir kısmı bir kerede kesilirse kolayca kopar. Kemiği kesici yumuşak dokudan ayırmak için, neşter (veya bir çift keskin tırtıklı olmayan forseps) kesici dişin apikal ucundaki iki doku arasına yerleştirilebilir ve alet hassas bir şekilde ileri kaydırılabilir.
   4. Alveolar kemiği azı dişleri ve hala kesici dişlere bağlı kalan kemiklerle kesin.
   5. Tüm kesici diş şimdi izole edilmiştir. Tamamen diseke edilmiş kesici dişi temiz, sıcak diseksiyon ortamı olan bir kaba aktarın (adım 1.1).
7. Gerektiğinde ek kesici dişleri izole etmek için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Farenin maksiller/üst kesici dişleri de yetişkin kök hücreleri korur ve diş rejenerasyonunu incelemek için kullanılabilir³⁴. Diş araştırmacıları tipik olarak alt kesici dişlere odaklanır çünkü bunlar daha erişilebilirdir ve üst kesici dişlerden daha kolay diseke edilebilir. Mandibular ve maksiller kesici progenitör hücreler arasındaki farklar henüz belirlenmemiştir.

4. Kesici epitelyal servikal halkayı ortaya çıkarmak için periodontal dokuların çıkarılması

1. Tüm kesici diş lingual tarafında yatarken ve dişi bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, apikal kesici dişi ve servikal halka bölgesini kaplayan periodontal dokuları sıkıştırmaya başlamak için bir çift #5 ince forseps kullanın.
2. Periodontal dokuyu apikal tomurcuktan dikkatlice soyun, böylece servikal döngünün (veya diğer ilgi bölgelerinin) lateral tarafı kapsam altında görünür hale gelir.
   NOT: Diş epiteline zarar vermemek veya mezenşimden ayrılmamak için özen gösterilmelidir. Kesici dişin ilgilenilen bölgede floresan sinyalleri varsa ve bir floresan diseksiyon mikroskobu mevcutsa, doku tiplerini ayırt etmeye yardımcı olmak ve diseksiyonlara yardımcı olmak için floresan sinyalleri kullanılabilir. Numunelerin hızlı bir şekilde kültür ortamına aktarılabilmesi ve eksplant kültürü yoluyla yeterince korunabilmesi için bölüm 2-4'ün verimli bir şekilde yürütülmesi önemlidir (aşağıya bakınız).

5. Eksplant kültürü için doku gömme

1. 24 oyuklu bir plakadaki bir kuyucuğa 500 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve diseke edilen bütün kesici dişleri hızlı bir şekilde kuyuya aktarın. Kesici dişleri durulamak için plakayı birkaç kez döndürün.
2. Bir kültür kabına 400 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve durulanmış kesici dişleri tabağa aktarın.
   NOT: Perfüzyon kurulumuyla uyumlu, piyasada bulunan bir kültür kabı kullanıyoruz. Alternatif seçenekler için adım 6.4'e bakın.
3. Servikal halka bölgesini (veya ilgilenilen diğer bölgeleri) çanağın ortasına yerleştirmek için kesici dişi yönlendirin (Şekil 2A,B) ve apikal kesici dişin eğimini istenen görüntüleme düzlemi için ayarlayın.
   NOT: Doku oryantasyonu, tam jelleşmeden önce hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
4. Jel sertleştikten sonra, jel ile kaplanmaması için ilgilenilen bölgenin üstündeki herhangi bir jeli çıkarmak için bir çift ince forseps kullanın.
5. Numuneyi (~150 μL) kaplayacak şekilde tabağın kenarına yavaşça pipetleyerek yeterli hacimde ılık kültür ortamı ekleyin.
6. Doku çökelmesine ve 1 saat boyunca kültür durumuna uyum sağlamasına izin vermek için eksplant kültürünü 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.

6. Kesici diş eksplantlarının timelapse mikroskobu

NOT: Bu deneyde, sayısal açıklığı 1 olan 25x suya daldırma objektifi ile donatılmış dik bir mikroskop kullandık. Genel olarak, yüksek sayısal açıklığa sahip bir su daldırma merceği, derin doku görüntüleme için en uygunudur.

1. Mikroskobu ve iki fotonlu lazeri açın.
2. Kültür çanağını s'ye sabitleyintage adaptör ve perfüzyon adaptör halkasını üstüne monte edin (Şekil 2C).
3. Kültürü 37 °C'de tutmak için s'yi bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.
4. Adaptör halkasının giriş ve çıkışını bir mikro perfüzyon pompasına bağlayın ve pompada perfüzyon hızı 20'ye ayarlanmış olarak kültür ortamının perfüzyonuna başlayın. Bu, numunelerin üst kısmında kültür ortamının yavaş bir akışını (~5 mL/h) oluşturur (Şekil 2C).
   NOT: Dokuyu stabil bir şekilde kontrol edilen bir ortamda tutmak için sistemle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Diğer sistemler de kullanılabilir. 37 °C'lik bir ısıtma plakası ve şırınga pompalarına bağlı bir giriş ve çıkışa sahip ev yapımı bir perfüzyon kültürü kabının (Ek Şekil S1) bir kombinasyonu da kullanılabilir.
5. Adaptör halkasının üzerine bir Atmosferik Kontrol Bariyeri Halkası (ACBR) yerleştirin ve sadece kültür ortamıyla temas etmek için hedefi ACBR'den indirin (Şekil 2D).
6. Hem GFP hem de kırmızı floresan (örn. tdTomato) sinyallerini görselleştirmek için lazer dalga boyunu 920 nm'ye ayarlayın.
7. Örnekleri göz merceklerinden ve ardından mikroskobun yazılımından bulun.
8. Yazılımı kullanarak Z yığınlarını, çok konumlu görüntülemeyi ve zaman aralıklarını ayarlayın. Bu protokolü takip etmek için, 4 μm'lik bir z adımı boyutu ve 14 saat boyunca 5 dakikalık bir zaman aralığı kullanın.
   NOT: 5 dakikadan daha uzun bir zaman aralığının, düzgün hücre hareketlerini ve bölünmelerini yakalamak için genellikle yetersiz olduğunu bulduk.
9. Timelapse görüntülemeyi başlatın.
   NOT: Numune konumu ilk bir saat içinde değişebilir ve daha fazla ayarlama gerekebilir.
10. Aşağı akış veri işleme ve analizleri için dosyaları kaydedin.

Yetişkin fare kesici dişinin apikal bölgesi mandibula içinde yer alır (Şekil 1) ve bu nedenle, büyüme bölgesinde bulunan progenitör hücreleri görselleştirmek ve canlı izlemek için doğrudan erişilebilir değildir. Bu nedenle, tüm kesici dişin çene kemiğinden çıkarılması ve iki fotonlu timelapse mikroskobu için bir eksplant kültür sisteminde tutulması için bir yöntem geliştirdik (Şekil 2). Burada, diş epitelinin labial servikal döngü bölgesindeki hücre proliferasyonu ve hareketinin dinamik sürecini yakalayan temsili sonuçları açıklıyoruz.

Deneysel prosedürleri göstermek için, diş epitelinde yeşil floresan ifade eden iki farklı fare modeli kullandık. İlk fare satırı K14Cre'dir; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, burada K14Cre (MGI:2680713) bir Keratin 14 promotöründen 35 Cre rekombinazını eksprese eder ve R26rtTA aleli36'dan (MGI:3584524) epiteldeki ters tetrasiklin kontrollü transaktivatörün ekspresyonunu aktive eder. Doksisiklin uygulandıktan sonra, rtTA, tetO-H2B-GFP aleli37'den (MGI:3043783) histon H2B-GFP ekspresyonunu indükler ve epitel hücre çekirdeklerini yeşil floresan ile etiketler. Bu, özellikle hücre takibi ve hücre bölünmelerini tespit etmek için kullanışlıdır. Bu deneyde, H2B-GFP ekspresyonunu aktive etmek için kurban edilmeden önce hayvanları 24 saat boyunca doksisiklin yemi ile besledik. İkinci fare satırı K14Cre'dir; R26mT/mG, R26 mT/mG (MGI:3803814) bir Cre-reporter38. Cre aktivitesinin yokluğunda, hücreler kırmızı floresan ile membran lokalize tdTomato (mT) eksprese eder. Cre aracılı rekombinasyon üzerine, hücreler membran GFP'sini (mG) eksprese eder. K14Kre; R26mT/mG böylece epitel hücre zarlarını yeşil floresan ile etiketleyerek epitel olmayan hücreleri kırmızı bırakır. Bu, hücre şekillerinin, bölümlerinin ve hareketlerinin kolayca görselleştirilmesini sağlar.

Prosedüre mandibulaları diseke ederek başladık (Şekil 3A) ve ardından kesici dişi çevreleyen tüm kemikleri sistematik olarak çıkardık (Şekil 3B-G). Bu, hasarsız epitel ile bütün kesici dişler verdi (Şekil 3H). K14Cre'deki yeşil floresansı inceleyerek diş epitelinin sağlamlığını doğruladık; R26rtTA; tetO-H2B-GFP ve K14Cre; R26mT/mG fareler (Şekil 4A,B,E,F). Bu aşamada, opak periodontal dokular hala apikal kesici dişi kaplar ve bu nedenle servikal halka, ışık saçılımı nedeniyle bulanık görünür, bu da benzer şekilde aşağı akış hızlandırılmış görüntülemeyi engeller (Şekil 4C, G). Bu nedenle periodontal dokuları dikkatli bir şekilde çıkardık, böylece servikal halkalı diş epiteli her kesici dişin ayırt edilebildi (Şekil 4D,H).

Kesici dişler daha sonra düşük erime noktalı agaroza gömüldü ve Şekil 2'de gösterildiği gibi iki fotonlu canlı görüntüleme için bir perfüzyon kurulumunda kültürlendi. Bu egzersiz için, dental epitelin servikal loop bölgesine odaklandık ve 14 saatlik bir süre boyunca her 5 dakikada bir 4 μm aralıklarla z-stack görüntüleri yakaladık (Şekil 5A). Özellikle, H2B-GFP sinyalleri çoğunlukla aktif hücre bölünmelerinin olduğu servikal döngünün transit-amplifiye edici bölgesinde gözlenmiştir (Şekil 5B). Bunun nedeni, açık kromatinlerde daha yüksek H2B-GFP değişiminin ve bu aktif hücrelerdeki DNA replikasyonlarını takiben nükleozomlara dahil edilmesidir39.

Daha sonra ImageJ kullanarak hızlandırılmış görüntüleri inceledik ve H2B-GFP sinyallerinin40 ayrılmasına dayanarak, görüntüleme süresi boyunca çok sayıda hücre bölünmesi gözlemleyebildik (Ek Video S1 ve Ek Video S2). Bu, dokuların eksplant kültüründe yeterince korunduğunu ve hücrelerin aktif olduğunu gösterdi. Spesifik olarak, mitotik hücrelerde metafaz plakasında kromozomların yoğunlaşmasını ve hizalanmasını, ardından anafaz sırasında iki yavru hücreye ayrılmasını gözlemleyebildik (Şekil 5C-N, ImageJ eklentisi TrackMate kullanılarak manuel olarak izlendi). Bu bölümlerin çoğu bazal membrana göre dik veya eğik bir açıdaydı (Şekil 5C-K ve Ek Video S1). Bazal membrana paralel yatay bölünmeler de tespit edilebilir, ancak daha az sıklıkta meydana gelir (Şekil 5L-N ve Ek Video S2). Diş epitelinde sitokinezin genellikle 5-10 dakika içinde hızlı bir şekilde gerçekleştiğini belirtmek önemlidir. Sonuç olarak, 5 dakikadan uzun zaman atlamalı aralıklar bu bölümlerin bazılarını kaçırabilir.

Hücre bölünmesi olayları K14Cre'de de belirgindi; Tüm epitel hücre zarlarının yeşil olarak etiketlendiği R26mT/mG servikal döngüler (Şekil 6A). Mitotik hücreleri hücre yuvarlamaları ve ardından sitokinez ile tanımlayabildik (Ek Video S3) ve hem dikey hem de yatay hücre bölünmeleri gözlemlenebildi (Şekil 6B-G), bu nedenle H2B-GFP kullanılarak elde edilen sonuçlara benzer. Birlikte, bu sonuçlar, bu protokolün, farklı hücre altı yapıları floresan olarak etiketleyen fare genetik modelleriyle birleştirildiğinde, kesici diş eksplantlarındaki hücre davranışlarını araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Fare çenesi ve kesici servikal halkanın şemaları. (A) Kesici dişin önemli bir kısmı çene kemiğine gömülüdür. Büyüme bölgesi dişin apikal ucunda bulunur ve sürekli büyümesini destekler (koyu yeşil ok). (B) Periodontal dokularla çevrili apikal kesici dişin genişlemesi. Diş, sırasıyla ameloblastlar ve odontoblastlar tarafından oluşturulan yüksek oranda mineralize yapılar olan mine ve dentinden oluşur. (C) Apikal kesici dişin sagital kesiti, diş epitelyal progenitör hücrelerinin ve transit-amplifiye edici hücrelerin labial servikal döngüde bulunduğunu ve daha distal epitelde ameloblastlara yol açtığını gösterir (koyu yeşil kesikli ok). Labial servikal döngü ile karşılaştırıldığında, lingual servikal döngü boyut olarak daha küçüktür ve normalde ameloblast oluşturmaz. Dental mezenkimal kök hücreler diş pulpasında (mor bölge) bulunur ve odontoblastlara yol açar. Kısaltmalar: En = emaye; De = dentin; = ameloblast; Od = odontoblast; TAC'ler = geçiş amplifiye edici hücreler; laCL = labial servikal döngü; liCL = lingual servikal döngü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Canlı görüntüleme için fare kesici diş eksplantının bakımı. (A) Canlı görüntüleme için kesici dişin diseksiyonundan dokunun düşük erime noktalı agaroza gömülmesine kadar protokolün temel adımlarını gösteren şemalar. Görüntüleme sırasında sabit bir besin kaynağı sağlamak için bir perfüzyon düzeneği kullanılır ve kültür 37 °C'de tutulur. (B-D) Canlı görüntüleme için kültür kabının ve perfüzyon odasının ayarlanmasının adım adım gösterimi. Medya girişi ve çıkışı sırasıyla pembe ve sarı oklarla gösterilir. Kısaltma: ACBR = Atmosferik Kontrol Bariyer Halkası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tüm fare kesici dişinin izolasyonu. (A) Sağlam çene. (B-H) Tüm kesici dişi ortaya çıkarmak için kemikler yavaş yavaş çıkarıldı. B ve C'deki kırmızı kesikli çizgiler, kesici diş yuvasının lingual ve bukkal taraflarını kaplayan membran kemiğini tıraşladıktan sonra apikal kesici dişin açıkta kalan yumuşak dokusunu gösterir (protokolde 3.3-3.5. adımlar). (D-G) Mavi ok uçları, tüm dişi izole etmek için çıkarılan kondilleri, azı dişlerini ve alveol kemiklerini temsil eder (protokolde adım 3.6). Ölçek çubuğu = 2 mm (H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Canlı görüntüleme için periodontal dokuların çıkarılması. (A-H) (A-D) K14Cre'den temsili örnekler; R26rtTA; tetO-H2B-GFP ve (EH) K14Cre; Protokolün gösteriminde R26mT/mGfareler kullanıldı. Diseksiyon öncesinde, dental epitelde GFP ekspresyonu kemik içinden görülebiliyordu (A,E, sarı ok uçları). Beyaz kesikli çizgiler, kesilmemiş kesici dişleri ana hatlarıyla belirtir. E' lingual tarafı gösterir. İzole kesici dişlerde (B,C,F,G), GF floresansı başlangıçta apikal kesici dişleri (beyaz ve kırmızı ok uçları) kaplayan periodontal dokular tarafından kırıldı. F ve G'deki kırmızı floresan, epitel olmayan hücreleri etiketler. Periodontal dokuların çıkarılması, yeşil floresan servikal halkaların (D, H, yeşil ok uçları) net ve engelsiz bir şekilde görülmesini sağlar. Ölçek çubuğu = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); ve 300 μm (C,D,G,H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: K 14 Cre'nin timelapse mikroskobu; R26rtTA; tetO-H2B-GFP servikal döngü. (A) Zaman atlamalı kurulumu gösteren bir şema. (B) K14Cre'nin temsili bir z-düzlemi; R26rtTA; tetO-H2B-GFP kesici labial servikal döngü, esas olarak hücrelerin aktif olarak bölündüğü transit-amplifikasyon bölgesinde H2B-GFP ile nükleer etiketlemeyi gösterir. Sarı kutu, aşağıda gösterilen büyütülmüş görüntülerin genel alanını temsil eder. (C-K) BM'ye göre dikey ve eğik hücre bölünmelerini gösteren hızlandırılmış görüntüler. (L-N) Timelapse görüntüleri, BM'ye göre yatay hücre bölünmesinin bir örneğini gösterir. (D,G,J,M) Metafaz veya anafazdaki hücreler orta panellerde görüntülenir. İzlenen her bölümün şemaları sağda gösterilir. N = 36 μm (B) cinsinden ölçek çubuğu; 5 μm (C-N). Kısaltma: BM = bazal membran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: K 14 Cre'nin timelapse mikroskobu; R26mT/mG servikal döngü. (A) K14Cre'nin temsili bir z-düzlemi; R26mT/mG kesici diş, labial servikal döngü. Tüm epitel hücreleri membran GFP'sini eksprese eder. Sarı kutu, büyütmelerde gösterilen hücre izleme alanını temsil eder. (B-G) BM'ye göre hem (B-D) yatay hem de (EG) dikey hücre bölünmelerini yakalayan hızlandırılmış görüntüler. (C,F) Orta paneller mitotik hücre yuvarlamasını gösterir. İzlenen her bölümün şemaları sağda gösterilir. Ölçek çubuğu = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Kısaltma: BM = bazal membran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Ev yapımı perfüzyon kabı. (A) Bir perfüzyon kabı yapmak için 35 mm'lik bir kültür kabı kullanılabilir. Görüntüleme ters mikroskop kullanılarak yapılırsa bir cam tabanlı çanak kullanılabilir. (B) Bir çiviyi alevle ısıtın. (C) Isıtılmış çivi kullanılarak çanağın her iki tarafında iki açıklık (beyaz ok uçları) oluşturulur. (D) Epoksi yapıştırıcı kullanarak açıklıklardan biri medya girişi, diğeri medya çıkışı olarak olmak üzere iki adet kör uçlu 16 G iğne yapıştırın. Gaz perfüzyonu isteniyorsa, çanağa üçüncü bir açıklık / iğne eklenebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: K14Cre'nin canlı görüntülemesi; R26rtTA; tetO-H2B-GFP kesici diş labial servikal döngü, dikey ve eğik hücre bölünmelerini gösterir. Hücreler manuel olarak izlenir ve farklı renkli noktalar farklı anne/kız hücre çiftlerini temsil eder. Ölçek çubuğu = 30 μm (sol çerçeve); 7 μm (sağ çerçeve). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Bir K14Cre'nin canlı görüntülemesi; R26rtTA; tetO-H2B-GFP kesici diş labial servikal döngü, yatay hücre bölünmesinin bir örneğini gösterir. Yatay bölme 10 s işaretinde gerçekleşir ve mavi noktalar kullanılarak manuel olarak izlenir. Ölçek çubuğu = 30 μm (sol çerçeve); 7 μm (sağ çerçeve). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: Bir K14Cre'nin canlı görüntülemesi; R26mT/mG kesici labial servikal döngü, hem dikey hem de yatay hücre bölünmelerini gösterir. Hücreler manuel olarak izlenir ve farklı renkli daireler farklı anne/kız hücre çiftlerini temsil eder. Ölçek çubuğu = 30 μm (sol çerçeve); 7 μm (sağ çerçeve). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.