Burada, büyük boyutlu bitkilerin genetik dönüşümünün in vivo çalışmaları için lokalize vakum infiltrasyonu için ilk protokolü sunuyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, ilk kez kakaonun planta geçici dönüşümünde Agrobacterium aracılı hale getirdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnatçı Bitkilerin Planta Dönüşümü için Vakumla Zorla Agroinfiltrasyon: Bir Vaka Çalışması Olarak Kakao
Bu makalede
Özet
Özet
Planta transformasyonunda geçici, bitki genetik transformasyonu için hızlı ve uygun maliyetli bir alternatiftir. Planta dönüşümü için çoğu protokol, Agrobacterium aracılı dönüşümün kullanımına dayanır. Bununla birlikte, şu anda kullanımda olan protokoller, büyük boyutlu bitkilerin vakum işlemine tabi tutulmasının fiziksel ve ekonomik kısıtlamaları nedeniyle küçük boyutlu tesisler için standartlaştırılmıştır. Bu çalışma, büyük boyutlu bitkiler için özelleştirilmiş lokalize vakum tabanlı agroinfiltrasyon için etkili bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemin etkinliğini değerlendirmek için, genetik dönüşüme karşı inatçı tropikal bir bitki türü olan kakao bitkilerinde kullanımını test ettik. Protokolümüz, kakao yapraklarının lokalize bir hava kısmına tekrarlarla 0.07 MPa'ya kadar vakum uygulanmasına izin vererek, Agrobacterium'un bağlı yaprakların hücreler arası boşluklarına sızmasını mümkün kıldı. Sonuç olarak, RUBY raportör sistemi için eksprese edilen ekli kakao yapraklarının planta dönüşümünde Agrobacterium aracılı geçici elde ettik. Bu aynı zamanda kakaonun planta geçici dönüşümünde aracılık edilen ilk Agrobacterium'dur. Bu protokol, vakum bazlı agroinfiltrasyon yönteminin benzer boyut kısıtlamalarına sahip diğer bitki türlerine uygulanmasına izin verecek ve inatçı odunsu, büyük boyutlu türlerde genlerin bitki karakterizasyonu için kapıyı açacaktır.
Giriş
Bitki genetik dönüşüm yöntemleri, genlerin biyolojik işlevlerini test etmek için gereklidir ve genom sonrası dönemde tahmin edilen çok sayıda karakterize edilmemiş gen göz önüne alındığında günümüzde özellikle yararlıdır1. Bu yöntemler, tamamen dönüştürülmüş çizgiler elde etmek veya genleri geçici olarak ifade etmek için kullanılabilir. Kararlı dönüşüm, konakçının aldığı yabancı DNA, konakçı genomuna tamamen ve geri döndürülemez bir şekilde entegre olduğunda ve genetik modifikasyonlar sonraki nesillere aktarıldığında meydana gelir. Geçici transformasyon olarak bilinen geçici ekspresyon, Agrobacterium tarafından hücreye aktarılan, konak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Agrobacterium tumefaciens kültürü
- Agrobacterium tumefaciens suşu LBA4404'nin elektroyetkin hücrelerini çözün.
- 1 mL maya malt ekleyin (YM; Tablo 1) 17 mm x 100 mm'lik bir kültür tüpüne et suyu. Bu tüpü daha sonrası için saklayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne, 30 μL çözülmüş Agrobacterium hücresi ve 35S:RUBY içeren 100-250 ng (5 μL'ye kadar) DNA ekleyin. Yavaşça karıştırın.
NOT: 35S:RUBY , Yunde Zhao'nun hediyesiydi. Numune arkını önlemek için, iyonik bileşiklerin varlığını mümkün olduğunca azaltın. Bu iy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, büyük boyutlu odunsu bitkiler için etkili bir agroinfiltrasyon yöntemi sunar. Bu protokolle, -0,07 MPa'lık bir vakum basıncı elde edebildik, bu da kakao yapraklarının etkili, lokalize infiltrasyonu ile sonuçlandı. Şekil 4'te, sızma sistemi kurulum sürecini ve Şekil 5'te son yapılandırmayı gözlemliyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, örnek olarak kakao bitkilerini kullanarak, odunsu bitkilerin planta geçici dönüşümü için verimli, düşük maliyetli bir agroinfiltrasyon protokolü sunduk. Yaprakların kütikülünün bitki dokularının dönüşümü için temsil ettiği iyi bilinen kısıtlama göz önüne alındığında, genellikle bu prosedüre karşı inatçı olan odunsu bitkilerde vakumla agroinfiltrasyonu kolaylaştırmak için bir strateji geliştirmeye odaklandık.
Vakum odası içinde elde edilen vakum basıncı, protokolün ana zo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Lic'e teşekkür ederiz. Jesús Fuentes González ve Néstor Iván Robles Olivares'e video görüntülerinin çekilmesindeki yardımları için. CIATEJ'den (Theobroma kakao bitkileri) Dr. Antonia Gutierrez Mora'nın cömert armağanlarını kabul ediyoruz. Ayrıca tesis desteği için CIATEJ ve Laboratorio Nacional PlanTECC, México'ya teşekkür ederiz. H.E.H.D. (CVU: 1135375), Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT) tarafından finanse edilen yüksek lisans çalışmaları yürütmüştür. R.U.L., Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) ve Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Hibe 7270-2018) tarafında....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY plazmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm elektroporasyon küveti | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Balıkçı Markası Elektroporasyon Küvetleri Plus |
| Kurutucu | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Dondurarak kurutucu | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | YM ortamı için 0,38 g/L ekleyin |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | YM ortamı için 10 g/L MES ekleyin |
| Sigma Aldrich | PHG0003 | (LB, YM ve yeniden süspansiyon ortamı için) 1,95 g/L (10mM) MgCl | |
| 2 | Sigma Aldrich | M8266 | süspansiyon ortamı için 0,952 g/L (10 mM) ekleyin |
| MgSO4 ve orta nokta; 7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | YM ortamı için 0.204 g/L |
| MicroPulser Elektroporasyon Aparatı | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | LB ortamı için 5 g/L ekleyin; YM ortamı için 0,1 g/L NanoDrop |
| Bir Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometresi | Thermo Fisher Scientific ekleyin. | 13-400-518 | |
| President Silikon Baskı malzemesi | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Altın-Bio | R-120-1 | (100 mg / mL) |
| Silikon Baskı malzemesi tabancası | Andent | TBT06 | |
| Spektinomisin | Altın-Bio | S-140-SL10 | (100 mg / mL) |
| Streptomisin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg / mL) |
| Sigma Aldrich | 95039-1KG-F'den | tripton enzimatik sindirim | LB ortamı için 10 g / L |
| Maya ekleyin MCD | LAB | 9031'i | : LB ortamı için 5 g / L ekleyin; YM ortamı için 0,4 g/L ekleyin |
Kaynaklar
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
