Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

3.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66047

⸱

21 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

Bu makalede

Özet

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

Özet

Tendonlar ve bağlar (T/L), kas-iskelet sistemini birleştiren güçlü hiyerarşik olarak organize edilmiş yapılardır. Bu dokular, sıkı bir şekilde düzenlenmiş kollajen tip I açısından zengin hücre dışı matrise (ECM) ve esas olarak paralel sıralar halinde konumlandırılmış T / L soy hücrelerine sahiptir. Yaralanmadan sonra, T/L, yüksek başarısızlık riski ve genellikle tatmin edici olmayan onarım sonuçları ile rehabilitasyon için uzun bir süre gerektirir. T / L biyoloji araştırmalarındaki son gelişmelere rağmen, kalan zorluklardan biri, T / L alanının, T / L oluşum sürecini in vitro olarak özetleyebilen standart bir farklılaşma protokolünden yoksun olmasıdır. Örneğin, mezenkimal öncü hücrelerin kemik ve yağ farklılaşması, sadece standart iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve spesifik stimülasyon ortamının eklenmesini gerektirir. Kıkırdak farklılaşması için üç boyutlu (3D) pelet kültürü ve TGFß takviyesi gereklidir. Bununla birlikte, tendona hücre farklılaşması, ideal olarak dinamik mekanik stimülasyona da tabi olması gereken çok düzenli bir 3D kültür modeline ihtiyaç duyar. Kendi ECM, otokrin ve parakrin faktörlerine sahip doğal bir mikro ortam sağlayan, kendi kendine monte edilmiş bir hücre tabakasından 3D çubuk benzeri bir yapı oluşturmak için 3 adımlı (genişleme, stimülasyon ve olgunlaşma) bir organoid model oluşturduk. Bu çubuk benzeri organoidler, zengin ECM içinde çok katmanlı bir hücresel mimariye sahiptir ve statik mekanik gerilmeye maruz kalmak için oldukça kolay bir şekilde ele alınabilir. Burada, piyasada bulunan dermal fibroblastları kullanarak 3 aşamalı protokolü gösterdik. Bu hücre tipinin sağlam ve ECM açısından bol organoidler oluşturduğunu gösterebiliriz. Tarif edilen prosedür, kültür ortamı açısından daha da optimize edilebilir ve dinamik eksenel mekanik stimülasyona doğru optimize edilebilir. Aynı şekilde, alternatif hücre kaynakları, T/L organoidleri oluşturma potansiyelleri açısından test edilebilir ve böylece T/L farklılaşmasına uğrayabilir. Özetle, yerleşik 3D T / L organoid yaklaşımı, tendon temel araştırması ve hatta iskele içermeyen T / L mühendisliği için bir model olarak kullanılabilir.

Giriş

Tendonlar ve bağlar (T/L), vücuda temel destek ve stabilite sağlayan kas-iskelet sisteminin hayati bileşenleridir. Kritik rollerine rağmen, bu bağ dokuları dejenerasyona ve yaralanmaya eğilimlidir, bu da ağrıya ve hareketliliğin bozulmasına neden olur1. Ayrıca, sınırlı kan temini ve yavaş iyileşme kapasitesi kronik yaralanmalara yol açabilirken, yaşlanma, tekrarlayan hareketler ve yanlış rehabilitasyon gibi faktörler dejenerasyon ve yaralanma riskini daha da artırır2. Dinlenme, fizik tedavi ve cerrahi müdahaleler gibi geleneksel tedaviler, T / L yapısını ve işlevini tam olarak eski haline getiremez. Son birkaç yılda, araştırmacılar T / L bozuklukları için etkili tedaviler aramak için T / L'nin karmaşık doğasını daha iyi anlamaya çalıştılar 3,4,5. T / L, esas olarak tip I kollajen lifleri ve proteoglikanlardan oluşan, hiyerarşik olarak organize, hücre dışı matris (ECM) baskın bir yapı ile ayırt edilir, bu da in vitro6'da kopyalanması zor bir özelliktir. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü modelleri, T/L dokularının karakteristik üç boyutlu (3D) organizasyonunu yakalayamamakta, bu da translasyon potansiyellerini sınırlamakta ve T/L rejenerasyonu alanındaki yenilikçi ilerlemeyi engellemektedir.

Son zamanlarda, 3D organoid modellerin geliştirilmesi, çeşitli doku tiplerinin temel araştırmalarını ve iskelesiz doku mühendisliğini ilerletmek için yeni olanaklar sunmuştur7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, miyotendinöz bileşkeyi araştırmak için, Larkin ve ark. 2006, sıçan kuyruğu tendonu10'dan türetilen kendi kendini organize eden tendon segmentleri ile birlikte 3D iskelet kası yapıları geliştirdi. Ayrıca, Schiele ve ark. 2013, mikro işlenmiş fibronektin kaplı büyüme kanallarını kullanarak, embriyonik tendon gelişiminin temel özelliklerini yakalayabilen bir yaklaşım olan 3D iskele yardımı olmadan hücresel lifler oluşturmak için insan dermal fibroblastlarının kendi kendine montajını yönlendirdi11. Florida ve ark. 2016 tarafından yapılan çalışmada, kemik iliği stromal hücreleri önce kemik ve bağ soylarına genişletildi, daha sonra kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı hücre tabakaları oluşturmak için kullanıldı, bunlar daha sonra doğal ön çapraz bağı taklit eden çok fazlı bir kemik-bağ-kemik yapısı oluşturmak için uygulandı, bağ rejenerasyonunun daha iyi anlaşılmasını amaçlayan bir model12. Tendon mekanotransdüksiyon süreçlerini aydınlatmak için Mubyana ve ark. 2018, tek tendon liflerinin oluşturulduğu ve mekanik yükleme protokolüne tabi tutulduğu iskelesiz bir metodoloji kullandı13. Organoidler, dokuların doğal mimarisini, mikro çevresini ve işlevselliğini taklit eden, kendi kendini organize eden 3B yapılardır. 3D organoid kültürler, doku ve organ biyolojisinin yanı sıra patofizyolojiyi incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir model sağlar. Bu tür modeller, farklı kök/progenitör hücre tiplerinindokuya özgü farklılaşmasını indüklemek için de kullanılabilir 14,15. Bu nedenle, T/L biyolojisi ve doku mühendisliği alanında 3D organoid modellerin uygulanması çok çekici bir yaklaşım haline gelmektedir 9,16. Organoid montajı için alternatif hücre kaynakları uygulanabilir ve tenojenik farklılaşmaya doğru uyarılabilir. Bu çalışmada gösterim için kullanılan ilgili bir hücre tipi dermal fibroblastlar 7,17,18'dir. Bu hücrelere, kemik iliği ponksiyonu veya liposuction ile karşılaştırıldığında daha az invaziv olan ve iyi proliferatif kapasiteleri nedeniyle oldukça hızlı bir şekilde büyük sayılara çarpılabilen bir cilt biyopsisi prosedürü ile kolayca erişilebilir. Buna karşılık, T / L'de yerleşik fibroblastlar gibi daha özel hücre tiplerinin izole edilmesi ve genişletilmesi daha zordur. Bu nedenle, dermal fibroblastlar, indüklenmiş pluripotent embriyonik kök hücrelere yönelik hücre yeniden programlama teknolojileri için bir başlangıç noktası olarak da kullanılmıştır19. Dermal fibroblastların, T/L'nin oluşumu ve sürdürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerin anahtar bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği bildirilen transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGFß3) gibi spesifik 3D kültür koşullarına ve sinyal ipuçlarına tabi tutulması, tendona özgü genlerin ekspresyonuna ve T/L-tipik ECM20'nin birikmesine yol açan in vitro tenojenik farklılaşmalarını güçlendirebilir, 21.

Burada, hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal yetişkin insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler) kullanarak önceden kurulmuş ve uygulanmış 3 aşamalı (2D genişleme, 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma) organoid protokolünü tanımlıyor ve gösteriyoruz ve in vitro tenogenez7. Bu model in vivo T/L dokusuna eşdeğer olmamasına rağmen, hücresel farklılaşma mekanizmalarını araştırmak, in vitro T/L patofizyolojisini taklit etmek ve T/L kişiselleştirilmiş tıp ve ilaç tarama platformları oluşturmak için kullanılabilecek fizyolojik olarak daha ilgili bir sistem sunmaktadır. Ayrıca, gelecekte, çalışmalar, 3D organoidlerin iskelesiz T/L mühendisliği için uygun olup olmadığını, daha fazla optimizasyon ile değerlendirebilir ve aynı zamanda doğal T/L dokularının boyutlarına ve yapısal ve biyofiziksel özelliklerine çok benzeyen ölçeklendirilmiş mekanik olarak sağlam yapıların geliştirilmesi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm adımlar aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

1. NHDF'lerin kültürü ve ön genişlemesi

  1. Yetişkin kriyoprezervasyonlu normal insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler, 1 x 106 hücreli) içeren kriyo-şişeyi 37 ° C'de neredeyse çözülene kadar hızla çözün.
  2. %1 penisilin / streptomisin (kalem / strep) (NHDF ortamı) ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış önceden ısıtılmış fibroblast büyüme ortamı 2 (bazal ortam,% 2 fetal buzağı serumu (FCS), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve insülin içeren kullanıma hazır kit) yavaşça hücrelere 37 ° C'de ısıtılır.
  3. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 12 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamında yeniden süspanse edin.
  5. Hücreleri bir T-75 şişesine aktarın ve çapraz şekilde kısa bir süre çalkalayın. T-75 şişesini 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin.
  6. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. NHDF'leri% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar mikroskop altında gözlemleyin.

2. 2D genişletme

  1. İnkübatörün T-75 şişesini çıkarın ve NHDF ortamını çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın.
  2. Hücrelere 3 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de, hücreler şişeden ayrılana kadar (yaklaşık 3 dakika) inkübe edin.
  3. Tripsin etkisini nötralize etmek için 6 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  4. Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  5. 37 ° C'de önceden ısıtılmış% 10 fetal sığır serumu (FBS), 1x MEM amino asitleri,% 1 pen / strep ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) düşük glikozunda hücre peletini yeniden süspanse edin.
  6. NHDF'leri 10 cm'lik bir yapışkan hücre kültürü kabında 8 x 103 NHDFs/cm2 yoğunlukta (toplamda, 10 cm'lik tabak başına 4,4 x 105 NHDF) plakalayın. Çapraz bir şekilde nazikçe sallayın.
  7. 10 cm'lik hücre kültürü kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin
  8. Hücreleri% 100 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 5 gün) mikroskop altında izleyin.

3. 2D stimülasyon

  1. NHDF'leri içeren 10 cm'lik hücre kültürü kaplarını (adım 2.6 ve 2.7'den itibaren) inkübatörden çıkarın. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
  2. 37 ° C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 50 μg/mL askorbik asit ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikozlu ortam ekleyin.
  3. Petri kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  4. NHDF'leri 14 gün boyunca mikroskop altında izleyin.

4. 3D olgunlaşması

  1. 10 cm'lik hücre kültürü kabını inkübatörden çıkarın ve DMEM yüksek glikoz ortamını çıkarın.
  2. Oluşan hücre tabakasını bir hücre kazıyıcı ile tabaktan nazikçe ve hızlı bir şekilde ayırın. Ayırırken, hücre tabakasını aynı anda 3D çubuk benzeri bir organoid haline getirin.
  3. NHDF organoidlerini alın ve 10 cm'lik yapışmayan (hücreler için) bir Petri kabına yerleştirin. Bu çanak türü, organoidden plastiğe hücre göçünü önlemek için kullanılır.
  4. Bu zaman noktasında veya bir gün sonra (3D olgunlaşmanın 0. günü veya 1. günü), ıslak ağırlık, histolojik değerlendirme (daha kompakt hale geldikleri için 1. gün organoidleri tercih edilir), RNA ve protein izolasyonu gibi daha ileri analizler için bazı organoidleri toplayın.
  5. Organoidin kenarlarını metal pimlerle aşağıdaki gibi sabitleyin:
    1. Organoidin bir tarafını bir cımbızla dikkatlice tutun ve başka bir cımbızla yaklaşık% 10 eksenel uzamayı manuel olarak gerdirin. %10 eksenel uzamayı tahmin etmek için bir milimetre kağıt veya cetvel kullanın.
    2. Ardından, cımbızla bir metal pim alın ve sabitlemek için organoid kenardan plastik tabağa manuel olarak bastırın. Bu işlemi ikinci pim ile organoidin ikinci kenarına tekrarlayın.
  6. 37 °C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 1x MEM amino asit, 50 μg/mL askorbik asit, 10 ng/mL TGFß3 ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikoz ortamı ekleyin.
  7. 10 cm'lik tabağı 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  8. Organoidleri 14 gün boyunca düzenli olarak izleyin.
    NOT: Pimler gevşeyebilir, bu nedenle adım 4.5'te açıklanan tekniğin aynısını kullanarak yeniden sabitleyin.
  9. 14 gün sonra, DMEM yüksek glikoz ortamını organoidlerden çıkarın. Organoidleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
  10. Hassas bir terazi kullanarak 0. ve 14. günlerde ıslak ağırlık için organoidleri ölçün.
    1. Tartıya 10 cm'lik boş bir tabak yerleştirin ve yalnızca organoidlerin ağırlığının ölçüldüğünden emin olmak için ağırlığı sıfıra getirin. Kültür ortamını 10 cm'lik tabaktan tamamen çıkarın ve organoid ıslak ağırlığı tek tek ölçün.
      NOT: Bu çalışmada, 0. günde, donör başına üç organoid ve 14. günde, donör başına iki organoid tartıldı.
  11. Çalışma amaçlarına göre, NHDF organoidlerinin bir kısmını daha ileri histolojik analizlerde uygulayın veya sonraki DNA, RNA ve protein izolasyonu için steril DNA / RNA içermeyen tüpler kullanarak hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından -80 ° C'de saklayın.
  12. Histolojik inceleme için, her bir organoidi 5 mL önceden soğutulmuş (4 ° C)% 4 paraformaldehit içinde PBS'de (nötr pH'a ayarlanmış) buz üzerinde 45 dakika boyunca sabitleyin, ardından RT'de PBS yıkayın (her biri 2 x 5 dakika).
  13. Organoidleri histoloji için cam kavanozlara yerleştirerek bir sükroz gradyanı kullanarak sabit organoidleri kriyoprotekte edin. Organoidleri 4 ° C'de 2 saat boyunca PBS çözeltisinde% 10 sükroz içinde inkübe edin, ardından% 20 sükroz / PBS'yi 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin ve son olarak, 4 ° C'de% 30 sükroz / PBS gece boyunca inkübe edin. Sükroz çözeltilerini önce pipetleyerek ve ardından yeni çözelti ile doldurarak değiştirin.
  14. Organoidleri kriyo-ortama gömün.
    1. Bir strafor kutudaki kuru buzun üzerine bakır bir plaka yerleştirin ve 10 dakika soğutun.
    2. Ardından, bakır plakanın üzerine kriyo-ortam ile önceden doldurulmuş plastik bir kriyo kalıbı yerleştirin ve organoidi cımbız kullanarak kriyokalıbın altına hafifçe bastırın. Kriyomedium tamamen donana kadar bekleyin.
    3. Uzun organoidler için, önce bir neşter ile ikiye bölün ve iki yarıyı kriyokalıba birbirine paralel hale getirin. Histolojik analize tabi tutulması amaçlanan her organoid için prosedürü tekrarlayın.
  15. Numuneleri kriyoseksiyona kadar -20 °C'de saklayın.
  16. Bir kriyotom kullanarak, organoidleri 10 μm kalınlığında kesitler halinde uzunlamasına kesin ve standart protokol8'i kullanarak hematoksilen ve eozin (H & E) gibi histolojik boyamaya tabi tutun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

3D T/L organoid modeli daha önce burada ticari olarak satın alınan NHDF uygulanarak kurulmuş ve gösterilmiştir (n=3, donör başına 3 organoid, NHDF 5-8 pasajlarında kullanılmıştır). Model iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Şekil 2 , T-75 şişelerinde ön genişleme sırasında (Şekil 2A) ve ayrıca 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında 2D genişletme adımında kültürün başlangıcında ve 5 günlük kültürden sonra NHDF kültürünün temsili faz kontra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada gösterilen sonuçlar, T / L dokularını incelemek için NHDF 3D organoid modelinin kurulması ve karakterizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar. 3 aşamalı protokol, T / L nişinin tipik özelliklerini sergileyen 3D çubuk benzeri organoidlerin oluşumuna yol açtı. Bu model daha önce Kroner-Weigl ve ark. 20237 ve burada çok ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Şekil 2'de sunulan faz kontrast görüntüleri, genişleme ve stimülasyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

D.D. ve S.M.-D. BMBF Hibesi "CellWiTaL: İlaç araştırmaları için tekrarlanabilir hücre sistemleri - üç boyutlu hücresel yapılarda son derece spesifik tek hücrelerin transfer katmansız lazer baskısı" Teklif Nr. 13N15874'ü kabul edin. D.D. ve V.R.A., AB MSCA-COFUND Hibesini kabul etti: OSTASKILLS "Yeni nesil Osteoartrit araştırmalarının bütünsel eğitimi", GA Nr. 101034412. Tüm yazarlar teknik yardım için Bayan Beate Geyer'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Askorbik asit   Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya   A8960
10 cm yapışık hücre kültürü kabıSigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya 
10 cm yapışmayan petri kabı Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya 
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Hollanda   4583
Cryomold standardı Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Hollanda4557
D (+) - Sükroz AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, AlmanyaA2211
DMEM yüksek glikoz ortamı Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Almanya DMEM-HA
DMEM düşük glikozCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Almanya   DMEM-LPXA
Fetal sığır serumuAnprotec, Bruckberg, Almanya AC-SM-0027
Fibroblast büyüme ortamı 2 PromoCell, Heidelberg, Almanya   C-23020
H & E boyama kitiAbcamab245880
Yüksek çözünürlüklü kameralı ters mikroskopZeissNAZeiss Axio Observer ile  Axiocam 506
MEM amino asitleri Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Almanya   NEAA-B
Metal pimler EntoSfenks, Pardubice, Çek Cumhuriyeti 04.31
Normal insan dermal fibroblastları PromoCell, Heidelberg, Almanya C-12302
ParaformaldehitAppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya A3813
Penisilin/streptomisin Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya15140122
Fosfat tampon salin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya P4417
TGFß 3 Ar-Ge D Systems, Wiesbaden, Almanya   8420-B3
Tripsin-EDTA %0,05 DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Almanya   TRY-1B
CLS430167CLS430591

Kaynaklar

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844(2020).
  3. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
  4. Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
  5. Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299(2022).
  6. Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
  7. Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772(2023).
  8. Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
  9. Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406(2020).
  10. Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
  11. Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
  12. Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
  13. Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
  14. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272(2018).
  17. Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047(2020).
  18. Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
  19. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  20. Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
  21. Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
  22. Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936(2019).
  23. Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
  24. Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
  25. Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
  26. Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
  27. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  28. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  29. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

3 Boyutlu Organoid ModeliTendon OrganoidiLigaman OrganoidiDoku Mühendisliğiİskelelemesiz MühendislikMatriks BirikimiMekanik StimülasyonTenojenik Diferansiyasyon
İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.