Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Dunkin-Hartley kobayları, osteoartrit araştırmaları için yerleşik bir hayvan modelidir. Bu tür çalışmalar, yeni ajanların araştırılması veya hastalıkların tedavisi de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle eklem içi enjeksiyonlardan fayda sağlayabilir. Gine domuzlarında eklem içi diz enjeksiyonları için bir metodoloji ve ardından artrit ile ilişkili diz değişikliklerini değerlendiren mikro bilgisayarlı tomografi analizi hakkında bir metodoloji açıklıyoruz.

Abstract

Bu protokolün amacı, kobaylarda palpasyon kılavuzluğunda eklem içi diz enjeksiyonu tekniğinin uygulanmasında ve mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak değerlendirmede araştırmacılara rehberlik etmektir. Dunkin-Hartley kobayları, dizlerinde kendiliğinden osteoartrit geliştirdikleri için osteoartrit araştırmaları için sağlam modellerdir. Eklem içi ilaç dağıtımı, araştırma amaçlı bir ilacın in vivo etkilerini incelemek için yaygın bir yöntemdir. İnsanlarda, eklem içi enjeksiyon yoluyla uygulanan terapötik ajanlar ağrıyı hafifletebilir ve osteoartritin daha da ilerlemesini geciktirebilir. Herhangi bir türde olduğu gibi, bir iğnenin bir eklem boşluğuna sokulması, ağrı, topallık veya enfeksiyonla sonuçlanabilecek yaralanmaya neden olma potansiyeline sahiptir. Bu tür advers olaylar hayvan refahını tehlikeye atabilir, çalışma sonuçlarını karıştırabilir ve çalışma hedeflerine ulaşmak için ek hayvanlar gerektirebilir. Bu nedenle, özellikle çoklu, tekrarlanan eklem içi enjeksiyonlar gerektiren uzunlamasına çalışmalarda komplikasyonları önlemek için uygun enjeksiyon tekniklerinin geliştirilmesi zorunludur. Sunulan metodoloji kullanılarak, beş kobay genel anestezi altında bilateral diz enjeksiyonları yapıldı. Enjeksiyondan yedi gün sonra, osteoartrit şiddetinin analizi için hayvanlara insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. Anestezi veya diz enjeksiyonlarını takiben topallama, ağrı veya enfeksiyon dahil olmak üzere hiçbir olumsuz olay meydana gelmedi. Dizin X-ışını mikro bilgisayarlı tomografi analizi, osteoartrit ile ilişkili patolojik değişiklikleri tespit edebilir. Mikro bilgisayarlı tomografi verileri, yaşla birlikte artan kemik mineral yoğunluğu ve trabeküler kalınlık ile gösterildiği gibi, osteoartritin yaşlı hayvanlarda daha şiddetli olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, aynı hayvanlarda artrit şiddetini değerlendirmek için yerleşik ve yaygın olarak kullanılan bir puanlama sistemi olan histolojik değişiklikler ve Modifiye Mankin skorları ile tutarlıdır. Bu protokol, kobaylarda eklem içi enjeksiyonları rafine etmek için kullanılabilir.

Introduction

Osteoartrit (OA) 32,5 milyon ABD’li yetişkini etkilemektedir. Eklem kıkırdağının ilerleyici kaybı, eklem içindeki ve çevresindeki dokuların hafif iltihaplanması, osteofit ve kemik kistlerinin oluşumu ile oluşur ^1,2. Semptomlar tipik olarak hastalığın sonraki aşamalarında ortaya çıkar ve mevcut tedaviler sadece palyatif rahatlama sağlamanın yanı sıra sistemik yan etkilere sahiptir. Hastalık modifiye edici ilaçların eksikliği, hastalığın altında yatan mekanizmaların yeterince anlaşılmamasından kaynaklanmaktadır³. Sonuç olarak, OA’yı tedavi etmek için geliştirilmiş ajanlara yönelik kritik ve devam eden bir tıbbi ihtiyaç vardır.

Hastalık süreçlerinin farklı bileşenlerini inceleyen çeşitli OA hayvan modelleri mevcuttur⁴. Ön çapraz bağın transeksiyonu ve medial menisküsün destabilizasyonu dahil olmak üzere çeşitli cerrahi modeller mevcut olsa da, bunlar invazivdir ve yüksek düzeyde teknik beceri gerektirir⁵. Kimyasal olarak indüklenen modeller, tipik olarak OA ağrı mekanizmalarını incelemek için kullanılan nispeten daha az invaziv prosedürlerdir⁶. Bu tür yaygın olarak kullanılan bir fare modeli, eklem içi diz içi monosodyum iyodoasetat (MIA) enjeksiyonu ile OA indüksiyonunu içerir. Bu model, MIA dozu⁷ değiştirilerek derecelendirilebilen tekrarlanabilir, sağlam ve hızlı ağrı benzeri bir fenotip üretir. Bu modelin indüklenmesine ilişkin teknik detaylar daha önce açıklanmıştır⁷. Bu tekniğin kobay gibi daha büyük kemirgenlere çevrilmesi, anatomik farklılıkları nedeniyle zordur. Bazı farklılıklar arasında, farelerde görülen distal füzyona kıyasla kobayda bitişik kemikleri ve eklem boşluğunu çevreleyen artmış kas sistemi ve eklemli bir fibula ve tibia bulunur⁸. Yaygın olarak bulunan bir kobay türü olan Dunkin-Hartley kobayları, bu hastalığı doğal olarak geliştirdikleri için yerleşik bir OA hayvan modelidir ve bu nedenle eklem içi enjeksiyonla uygulanan yeni terapötiklerin hastalığın ilerlemesi üzerindeki etkilerini araştırmak için sağlam bir model sunar⁹. Dunkin-Hartley kobayları üç ayda OA geliştirmeye başlar, erkekler hızlandırılmış bir gelişim ve daha şiddetli fenotip¹⁰ gösterir. Gine domuzlarında, OA yaşla birlikte ilerler ve 12 ayda, ilişkili patoloji görüntülemede^{belirgindir 11}. Dunkin-Hartley modeli gibi spontan OA modelleri, OA’yı indüklemek için herhangi bir müdahale gerektirmez ve böylece insanlarda hastalık fenotipinin gelişimini ve ilerlemesini özetler, böylece güçlü bir translasyonel model^{sağlar 10}. Ayrıca, OA’nın spontan gelişimi, yeni terapötikler belirli bir hayvanın tek bir dizinde tek taraflı olarak uygulandığında iç kontrole izin verir. Bu dahili kontrol, verileri analiz ederken hayvanlar arası değişkenliklerin etkilerini en aza indirir ve genel hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olabilir.

X-ışını Mikro Bilgisayarlı Tomografi (μBT) analizi, OA şiddeti^12’nin kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyan güçlü bir araçtır. μCT, dönen bir numuneden veya dönen bir X-ışını kaynağından ve dedektörden elde edilen çoklu, yüksek çözünürlüklü X-ışını görüntülerinin taranmasını içerir¹³. Daha sonra, üç boyutlu (3D) hacimsel veriler, yığılmış görüntü dilimleri¹⁴ şeklinde yeniden yapılandırılır. Mineralize kemik μCT’de mükemmel kontrasta sahip olduğundan, bu modalite 3D özellikleri değerlendirmek ve OA^15,16,17 ile ilişkili değişikliklerin kantitatif analizlerini yapmak için kullanılabilir. μCT, histopatoloji ve yürüme analizleri dahil olmak üzere daha yaygın olarak kullanılan araçlara göre çeşitli avantajlar sunar. Dokuların bir veya birkaç bölümünün histolojik değerlendirmesinin aksine, μBT tüm eklemi tarar ve OA lezyonlarının daha bütünsel bir değerlendirmesini sunar¹⁸. Yürüme analizi, zaman içinde eklem fonksiyonundaki semptomatik değişiklikleri ayırt edebilirken, eklem değişiklikleri OA ile ilişkili fonksiyonel değişikliklerden çok önce gelişir. μCT, topallık başlamadan önce OA gelişiminin daha hassas bir ölçümünü sağlayabilir. Özellikle ilgili iki kantitatif ölçüm, her ikisi de OA ^19,20’nin ilerlemesi boyunca arttığı için kemik mineral yoğunluğu ve trabeküler kalınlığı içerir. Daha sağlam ölçümler ve karşılaştırmalar elde etmek için analizi, farklı özelliklere sahip oldukları için subkondral plaka ve trabeküler kemiğe bölmek yardımcı olabilir.

Bu yöntemin genel amacı, araştırmacıların kobaylar üzerinde eklem içi enjeksiyonları başarılı bir şekilde gerçekleştirmelerine yardımcı olmaktır. Sunulan protokolde beş (n=2), dokuz (n=1) ve 12 (n=2) aylık bozulmamış, erkek Dunkin-Hartley kobayları; Prosedürler, eklem içi diz enjeksiyonları gerektiren diğer kobay suşlarına ve yaşlarına göre tahmin edilebilir. Dunkin-Hartley modeli gibi spontan OA modellerinde, hastalığın ilerlemesi ve seri tedaviye yanıt genellikle haftalar ila aylar arasında değişen uzun süreler boyunca izlenir⁹. Bu genişletilmiş protokol, birden fazla eklem içi enjeksiyonla sonuçlanır ve bu nedenle, ağrı, topallık veya enfeksiyonlar dahil olmak üzere advers olayları önlemek için uygun enjeksiyon tekniğine sahip olmak önemlidir, bunların tümü hayvan refahını etkileyebilir ve çalışma sonuçlarını karıştırırken ek hayvanlar gerektirir. Sunulan protokol, kobaylarda eklem içi enjeksiyonların metodolojisini ve ardından μCT verilerinin analizini açıklamaktadır.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışma 3R ilkesini takip etti.

1. Eklem içi enjeksiyon preparatları

1. Deneye başlamadan önce Dunkin-Hartley kobaylarının en az bir hafta tesise alışmasına izin verin.
   NOT: 5- (n=2), 9- (n=1) ve 12- (n=2) aylık erkek kobay kullanıldı. Erkekler hızlandırılmış bir gelişim ve daha şiddetli OA fenotipi gösterirler.
2. Diz bölgesini elektrikli tıraş bıçağıyla tıraş edin.
   NOT: Meme uçlarına medial olarak dikkat edin.
3. O₂ karışımında (akış hızı 2.5 L / dak) %3-5 izofluran veren bir izofluran odasında kobayları uyuşturun ve ardından kobayları tekrar nefes almayan bir anestezi devresine bağlı bir burun konisine aktarın. Enjeksiyon sırasında, tipik olarak 0.5-1 L / dak oksijen akış hızı ve% 1-3 izofluran ile cerrahi anestezi düzlemini korumak için izofluranı ayarlayın.
   NOT: Eklem içi enjeksiyonlar hafif, anlık ağrıya neden olur. Ağrılı uyaranların algılanmasını önlemek ve enjeksiyon doğruluğunu artırmak için işlem sırasında hayvanlar uyuşturulur. Sunulan çalışmada, steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar da dahil olmak üzere analjezik ajanların uygulanması, OA ilerlemesini etkileyecektir²¹. Anlık ağrı, sağlanan anestezi ve analjeziklerin modeli şaşırtma potansiyeli nedeniyle, hayvanlar enjeksiyondan sonra eklem palpasyonunda topallama ve ağrı belirtileri dahil olmak üzere yan etkiler göstermedikçe analjezikler uygulanmadı. Araştırmacılar rutin enjeksiyonlar için analjezik kullanımını düşünmelidir. Yan etkiler ortaya çıktığında analjezikler önerilir. Analjezik rejimler, çalışmalara başlamadan önce kurumsal veteriner hekim ile tartışılmalı ve IACUC tarafından onaylanmalıdır.
4. Ayak parmağı sıkışma tepkisi olmaması nedeniyle kobayın uygun anestezi derinliğinde olduğundan emin olun.
5. Kurumayı ve yaralanmayı önlemek için her iki gözünüze de steril oküler kayganlaştırıcı yerleştirin.
6. Betadini steril suyla %10’a kadar seyreltin.
7. 200 geçirmez etanolü steril su ile %70 etanole seyreltin.
8. Steriliteyi korumak için bir biyogüvenlik kabininde enjeksiyon için solüsyonlar hazırlayın. Sunulan protokolde, her iki dize enjekte etmek için steril bir araç (1x fosfat tamponlu salin) kullanıldı. Çözümler, araştırma hedeflerine göre değiştirilebilir.
   NOT: Steriliteyi sağlamak için enjeksiyon seansından hemen önce enjeksiyon için taze solüsyonları seyrelttiğinizden emin olun. Kullanılmayan solüsyonlar her enjeksiyon seansının sonunda atılmalıdır.
9. Steril tek kullanımlık insülin şırıngalarını enjeksiyon solüsyonlarıyla doldurun. Eklem boşluğunun hacimle aşırı yüklenmesini önlemek için elde edilebilecek en küçük hacmi kullanmaya özen gösterin. Bu çalışmada 50 μL kullanılmıştır.
10. Gine domuzu ve burun konisini, termal destek için bir ısıtma yastığı ve hafifçe yükseltmek için başın altına dolgu ile temiz bir yüzeye yerleştirin.
11. Enjeksiyon prosedürünü gerçekleştirirken cerrahi önlük, saç filesi, steril eldiven ve maske giyin.
12. Bir pamuğa %10 betadin dökün ve her iki diz bölgesini silin.
13. Bir pamuğa %70 etanol dökün ve her iki diz bölgesini silin.
14. 1.12 ve 1.13’ü iki kez daha tekrarlayın.
    NOT: Gösterim amacıyla, ilgili videoda diz ve enjeksiyon bölgesinin bir kez %10 betadin ve %70 etanol ile temizlenmesi gösterilmektedir. Enjeksiyon bölgesi daha sonra iki kez daha dairesel hareketler kullanılarak temizlendi ve bu solüsyonlar değiştirildi. Aseptik tekniğe ulaşmak için alternatif ovma solüsyonları ve alkol içeren üç seri ovma önerilir.

2. Eklem içi enjeksiyon

1. İşlemin tamamı için kobayları sırtüstü pozisyona getirin.
2. Yeni bir çift steril eldiven giyin ve diz eklemini palpe edin.
   NOT: Sunulan protokol ve videoda otoklavlanmış nitril eldivenler kullanılmıştır. Aseptik teknik için otoklavlanmış nitril eldivenler veya cerrahi eldivenler dahil olmak üzere steril eldivenler kullanılmalıdır.
3. Dizinizi manuel olarak 90° esnetin.
4. Arka ayağı esneterek ve uzatarak eklem boşluğunun distal yönünün oluğunu bulmak için parmağınızı patellaya distalde hareket ettirin.
   NOT: Patella, bu pozisyonda doğrudan eklem boşluğunun üzerine yerleştirilmiş küçük, sağlam bir yapı olarak palpe edilebilir. Tibia, patellanın distalinde kemikli bir yapı olarak hissedilebilir. Tibia ve patellanın yeri belirlendikten sonra, oluk olarak hissedilen eklem aralarında, patellanın distalinde ve tibianın proksimalindedir.
5. İnsülin iğnesini eklem boşluğu içindeki patellanın distalindeki orta hattın üzerine dikkatlice yerleştirin. Eklem boşluğuna girmek için iğne cildin 1-2 mm altına sokulmalıdır.
   NOT: Diz bükülürken eklem boşluğu için en büyük erişim penceresi, orta hatta, patellanın doğrudan distalinde, uzvun ön yüzündedir. Orta hatta önden arkaya yönde enjekte edilmesi, kemikli yapılara nüfuz etmeden eklem boşluğuna doğru bir şekilde enjekte edilmesine yardımcı olacaktır. Eklem boşluğuna doğru bir şekilde enjekte edilmesi, özellikle diz büküldüğünde erişim penceresi daha dar olmasına rağmen, lateral-medial bir yaklaşım kullanılarak elde edilebilir.
6. Çözeltinin 50 μL’sini eklem içine yavaşça enjekte edin. İğnenin kolayca girdiğinden ve içeriğin direnç göstermeden enjekte edildiğinden emin olun.
   NOT: Eklem veya kemik hasarına neden olabileceğinden ve istenmeyen iltihaplanma ve/veya ağrıya neden olabileceğinden iğneyi çok derine sokmadığınızdan emin olun. Eklem boşluğuna karşılık gelen oluk bulunamazsa, iğne uyluk kemiği, patella veya kaval kemiğine nüfuz edebilir. Bu nedenle, peri-artiküler enjeksiyonları veya penetran kemiksi yapılarla ilişkili yaralanmaları önlemek için eklem boşluğuna karşılık gelen oluğu güvenle palpe etmek faydalıdır. Derinin altındaki enjeksiyon bölgesinde bir kabarcık oluşursa, enjeksiyon çok sığdır ve sıvı deri altı boşluğuna girmiştir. Kullanılan ajanın özelliklerine bağlı olarak, ilaç difüzyon yoluyla eklem boşluğuna girebilir veya başka bir enjeksiyon denemesine ihtiyaç duyulabilir.
7. Bittiğinde, iğneyi keskin nişancı kutusuna atın.
   NOT: Uygulama ve eğitim amacıyla, benzer büyüklükteki bir kemirgen veya kobayda bir kadavranın eklem boşluğuna bir boya içeren sıvı enjekte edin. Ardından, enjeksiyonun yerini doğrulamak için eklemi inceleyin.
8. Eklemi birkaç kez esneterek ve uzatarak dizinize masaj yapın, ilacın eklem boşluğu içinde difüzyonunu teşvik edin.
9. 1x PBS çözeltisi ile kontralateral uzuv üzerinde 2.1-2.5 adımlarını bir kez tekrarlayın.

3. Eklem içi enjeksiyondan iyileşme

1. İzofluranı kapatın ve hayvan bilincini geri kazanana kadar oksijenle% 100 akışı koruyun.
2. Hayvanı, ambulatuvar olana kadar termal destek için bir ısıtma yastığına yerleştirin.
3. Enjeksiyondan kaynaklanan şişliği azaltmaya yardımcı olmak için bariyer olarak bir kağıt havluyla dizinize 30 saniye boyunca bir buz torbası uygulayın.
4. Hayvan yürüyüşünü, onları eve geri göndermeden önce ayaktayken değerlendirin.
   NOT: Herhangi bir yürüyüş anormalliği belirtilirse, analjezikler ve destekleyici bakım gerekebilir. Normal hareketliliği sağlamak için anesteziden iyileştikten birkaç saat sonra yürüyüşlerini tekrar değerlendirmeniz önerilir.

4. Mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) taraması

1. Doku hasadı için,% 100 oksijen ve% 5 izofluran karışımı ile cerrahi bir anestezi düzlemi oluşturun.
2. Ayak parmağı sıkışma uyaranına yanıt eksikliği olan bir cerrahi anestezi düzlemini onaylayın. Kurumsal politikalara ve onaylanmış hayvan kullanım protokolüne göre intravenöz olarak ≥ 150 mg / kg pentobarbital uygulayarak hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
   NOT: Sunulan protokolde, beş kobayın her biri her iki dizine bir enjeksiyon aldı. Hayvanlar enjeksiyondan bir hafta sonra anestezi altına alındı ve insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı.
3. Cildi çevredeki kas sisteminden uzaklaştırarak her iki arka ayağı da hasat edin.
4. Daha sonra, uyluk kemiğinin orta şaftında ve ayak bileğinin proksimalinde Rongeurs ile arka ayağı ayırın.
   NOT: Kullanılan tarama yatağı ve numune tutucu, yetişkin bir kobayın tüm arka ayağını barındıramadı. Büyük numune tutucular, daha büyük numune boyutları için ticari olarak temin edilebilir.
5. μCT yapmadan önce dokuları fiksasyon için 72 saat boyunca nötr tamponlu formalin çözeltisine yerleştirin.
6. μCT tarama yazılımını açın ve görselin içeren numuneyi, görüş alanındaki dokuyu korurken μCT numune klasörüne sığacak uyumlu bir kaba yerleştirin.
7. μCT makinesini karanlık alan ve aydınlık alan maruziyetleri için üretici tavsiyelerine göre kalibre edin.
8. Numuneyi Al+Cu filtresi ile 18 μm’de tarayın. Ofset kamera ile 360 ° için 0,7 ° döndürme adımını kullanın.
   NOT: Tarama otomatik olarak kaydeder.

5. Kemik mikromimari parametrelerinin değerlendirilmesi için görüntü işleme

1. μCT görüntülerinin rekonstrüksiyonu için μCT rekonstrüksiyon yazılımını indirin ve yükleyin.
2. Yazılım klasörünü seçin ve yazılımı açmak için çift tıklayın.
3. Bir görüntü dilimine tıklayarak μCT görüntülerinden bir dilim seçin.
4. Yeniden yapılandırma dosyası hedefini seçin. Gözat’ı seçin ve Recon adlı yeni bir klasör oluşturun. Seçilen dosya formatı BMP(8) olmalıdır.
5. Yanlış hizalama telafisini kontrol edin.
   NOT: Genellikle, tahmin doğruya yakındır, ancak çakışan görüntüleri kaydırmak için manuel olarak ayarlanabilir, böylece sağ ve sol kenarlar mümkün olduğunca yakın hizalanır.
6. Ayarlar’ın altında Yumuşatma, Işın Sertleştirme, CS Döndürme ve Halka Artefaktları algoritmalarını uygulayın.
   NOT: Yeniden yapılandırmadan önce netliği belirlemek için önizleme görüntüsünü seçmek yararlı olabilir. İnce ayar ayarı, hangi ayarların en iyi olduğunu belirlemek için de yardımcı olabilir.
7. Yeniden yapılandırmayı işlemeye başlamak için Başlat’ı seçin.

6. Yeniden yapılandırılmış görüntülerden mikromimari verilerin toplanması

1. Dataviewer’ı indirin ve yükleyin.
2. VOI’yi seçin ve daha sonra daha kolay analiz için örneği dikey olarak hizalayacak şekilde yönlendirin.
3. Düzenlenen VOI’yi yeni bir klasör olarak kaydedin.
4. Mikromimari parametrelerin kemik özellik analizi için CTAnalyser’ı indirin ve yükleyin.
   NOT: CTAnalyser’ın ücretsiz sürümünün işlevselliği sınırlıdır, bu nedenle tam bir lisans almanız önerilir.
5. Analizi, ayrı bir görüntü aralığı olarak kaydederek subkondral plaka ve trabeküler kemiğe bölün.
   NOT: Analizin bölünmesi gerekli değildir, ancak subkondral plak ve trabeküler kemik farklı özelliklere sahip olduğundan, ayrı analizler sağlam ölçümlere ve karşılaştırmaya yardımcı olabilir.
6. Başlamak istediğiniz görüntü dilimine tıklayarak subkondral plakadan başlayarak analiz edilecek görüntü aralığını seçin.
7. İlgilenilen bölge sekmesine tıklayarak kemiği kapsadığından emin olmak için her görüntü için ilgilenilen bölgeyi seçin.
8. İkili Seçim sekmesini seçin. Histogramı, arka plan ve kemik tamamen ayrı olacak şekilde ayarlayın.
9. Kemik Mineral Yoğunluğu (BMD) sekmesini seçin. Bu verileri yeni bir analiz verileri klasörüne kaydedin.
10. Özel İşleme’yi seçin ve Dahili sekmesine gidin.
11. Önce Eşikleme gerçekleştirin ve Otomatik Otsu’yu seçin, ardından Çalıştır’ı seçin.
12. Ardından Benek Kaldır’ı seçin ve Siyah benekleri kaldır’ı ve ardından Çalıştır’ı seçin.
13. Benek Giderme’yi tekrarlayın ve Beyaz benekleri kaldır’ı seçin, ardından Çalıştır’ı seçin.
14. 3B analiz’i seçin ve Temel değerler ve Ek değerler’i seçin.
15. Trabeküler kemik analizi için görüntüyü sıfırlamak üzere 6.2.2-6.4.5 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Çıktı dosyasının, BMD verileriyle aynı dosyaya sahip yeni bir klasörde olduğundan emin olun.

Representative Results

Discussion

OA’nın semptomatik tedavisindeki son gelişmelere rağmen, OA^24’ün başlamasını önleyen veya ilerlemesini geciktiren terapötik ajanlar tamamen eksiktir. Şu anda, şiddetli OA’nın tek tedavisi, maliyetli, invaziv olan ve hasta morbiditesi ve mortalitesi ile sonuçlanabilen eklem replasmanıdır²⁵. Sonuç olarak, OA’nın hayvan modelleri ile devam eden araştırmalara ve yeni terapötiklerin sürekli geliştirilmesine ciddi bir ihtiyaç vardır. OA’nın farklı bileşenlerini incelemek için spontan ve kimyasal veya cerrahi olarak indüklenen modeller dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri mevcuttur. MIA fare modelinde olduğu gibi kimyasalların enjeksiyonu, ağrıyı incelemek için hayati öneme sahiptir, ancak araştırmacıların OA gelişiminin ilerlemesini takip etmelerine ve hastalığın seyri boyunca istenen zaman noktalarında müdahale etmelerine izin vermez²⁶. Cerrahi yöntemler invaziv prosedürler gerektirir ve insanlarda OA’nın başlangıcını aslına uygun olarak yansıtamaz²⁷. Dunkin-Hartley kobayları doğal olarak OA geliştirir ve bu da onları yaygın olarak bulunan spontan bir OA²⁸ modeli haline getirir. Bu spontan model, mekanik OA gelişimini inceleyen translasyonel araştırmalar için idealdir, çünkü müdahale gerektirmez ve insanlardakileri yansıtan patolojik değişiklikler içerir⁶. Daha önce yayınlanmış çalışmalarda, Dunkin-Hartley kobaylarında spontan OA’nın ilerlemesi üzerindeki yeni terapötiklerin etkilerini test etmek için eklem içi enjeksiyonlar kullanılmıştır ^29,30,31.

Farelerde eklem içi enjeksiyonlar daha önce tanımlanmış olsa da, anatomik farklılıklar kobaylarda bu prosedür için ek zorluklar oluşturmaktadır⁷. Eklem içi enjeksiyonlar kobay OA çalışmalarının ayrılmaz bir parçası olmasına rağmen, bu prosedür henüz sistematik olarak detaylandırılmamıştır. Açıklanan metodoloji ile, kobaylarda eklem içi enjeksiyonların rafine edilmesi için temel hususları vurguluyor ve böylece prosedürle ilgili komplikasyon potansiyelini azaltıyoruz. İnsanlarda eklem içi enjeksiyonları takiben sık görülen yan etkiler arasında ağrı, şişme, septik artrit ve nöropati bulunur ve bunlar kobaylarda enjeksiyon yapılırken potansiyel komplikasyonlar olarak düşünülmelidir³². Deneyimlerimize göre, eklem palpasyonunda topallama ve ağrı gibi yan etkiler, iğne eklem boşluğuna çok derine sokulduğunda ve/veya enjeksiyon sırasında kemikli bir yapıya temas ettiğinde ortaya çıkabilir. Enjeksiyonlarımızı canlı hayvanlar üzerinde gerçekleştirmeden önce uygulamak için kadavralara sahip olmak, enjeksiyonların daha doğru yapılmasına yardımcı oldu. Sığ bir enjeksiyon derinliği sağlamak için tekniğimizi geliştirirken, eklem içi diz enjeksiyonlarını takiben hiçbir yan etki gözlemlemedik. Bu nedenle, uygun enjeksiyon tekniği, özellikle aylarca süren çoklu enjeksiyon gerektiren çalışmalar için, hayvan refahını sağlamak için çok önemlidir. Prosedürdeki temel adımlar arasında aseptik tekniğin kullanılması; hayatta kalma prosedürlerini gerçekleştirmeden önce yeterli eğitim; enjeksiyon sırasında ağrı algısını ve hareketini önlemek için cerrahi bir anestezi düzlemi elde etmek; ve bileşiğin tekrar uygulanmasını gerektirebilecek kemik distal ve peri-artiküler enjeksiyonlarla teması önlemek için uygun enjeksiyon derinliğinin sağlanması.

OA ile ilgili değişiklikleri sistematik olarak değerlendirmek için, etkilenen dokunun görselleştirilmesine, segmentasyonuna, etiketlenmesine ve objektif ölçümlerine olanak tanıyan 3D görüntü yorumlamaları da dahil olmak üzere μCT analizlerini açıklıyoruz. Açıklanan yöntemler, zaman içindeki OA eklem ve kemik değişikliklerini sistematik olarak değerlendirmede etkili ve verimli olmuştur. μCT sonuçlarımız, 12 aylık Dunkin-Hartley kobaylarının, artan kemik mineral yoğunluğu ve artan trabeküler kalınlık ile gösterildiği gibi, 5 aylık kobaylardan daha şiddetli OA’ya sahip olduğunu göstermektedir. Bu, zaman içinde OA’nın kötüleştiğini, kemik mineral yoğunluğunu ve trabeküler kalınlığı¹³ değerlendiren μCT analizleri de dahil olmak üzere bu OA modelinde daha önce yayınlanmış sonuçlarla uyumlu hale getirdi. Önceki çalışmalar ve sunulan temsili sonuçlar, μCT^22,23 ile ölçüldüğü gibi zaman içinde KMY ve trabeküler kalınlıkta artış olduğunu ve arttığını göstermektedir. Ayrıca dizlerin histolojik olarak iki boyutlu olarak değerlendirilmesi μBT verilerinin geçerliliğini desteklemektedir. Histolojik olarak, 9 ve 12 aylık kobaylarda OA belirtileri 5 aylık hayvanlara göre daha belirgindir. OA ile ilişkili histolojik değişiklikler proteoglikan kaybı, fissürler ve hiposelülariteyi içerir. ¹⁰ Bu özelliklerin her biri yaşlı kobaylarda görülebilir. Ek olarak, daha yaşlı kobaylar, OA şiddeti^10’u değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir yöntem olan daha yüksek Modifiye Mankin skorlarına sahiptir. Histolojik analizlerimiz beklenen OA değişikliklerini gösterirken, μCT bir veya birkaç doku kesiti yerine tüm numuneyi taradığı için histolojik incelemeden daha derinlemesine bir OA değişiklikleri değerlendirmesi sağlar¹⁸. Ayrıca, hem 2 hem de 3 boyutta kemik lezyonlarının kapsamının daha objektif ölçümlerini sağlar¹⁸. Araştırmacılar, histolojik OA değişikliklerini puanlarken, Osteoartrit Araştırma Derneği Uluslararası histolojik değerlendirme kılavuzları¹⁰ gibi mevcut kılavuzlara başvurmalıdır. Araştırmacılar, OA gelişiminin derinlemesine karakterizasyonu için yürüyüş analizleri de dahil olmak üzere ek yardımcı testleri düşünmelidir³⁴. Yürüme analizleri zaman içinde fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkarabilse de, OA lezyonları topallık başlamadan çok önce gelişir ve μBT’yi hastalığın erken evrelerinde OA ile ilişkili değişikliklerin daha hassas bir ölçüsü haline getirir.

Dunkin-Hartley kobayları, OA ilerlemesini ve yeni terapötiklerin etkilerini incelemek için sağlam bir model sağlarken, bu modelin sınırlamaları vardır. Spontan modeller tipik olarak, cerrahi veya kimyasal olarak indüklenen OA^35’i takiben değişikliklerin hızlı gelişimine kıyasla daha uzun bir çalışma süresi gerektirir. Bu, maliyetin ve çalışma süresinin artmasına neden olabilir. Daha önce açıklandığı gibi, OA’nın başlangıcı aynı yaştaki hayvanlar arasında farklılık gösterir ve bu da OA ile ilgili değişikliklerin seri olarak değerlendirilmesini gerektirebilir³⁶. Bu varyasyona rağmen, araştırmacılar tüm Dunkin-Hartley kobaylarının 3 aydan başlayarak OA geliştirmesini, subkondral ve trabeküler kemikte değişiklikler göstermesini ve ardından hayvan^10,19 yaşlandıkça ilerleyici OA değişiklikleri göstermesini bekleyebilirler. Araştırmacılar, her hayvanda bir uzuvya tedavi uygulayarak hayvanlar arası değişkenliğin etkisini azaltabilir ve karşı uzvun bir iç kontrol görevi görmesine izin verebilir. Sunulan metodolojinin kapsamı dışında olmasına rağmen, ultrason kılavuzluğunda enjeksiyonlar, enjeksiyon doğruluğunu daha da iyileştirmeye yardımcı olabilir ve kobaylarda kullanılmıştır³⁷. Burada önerilen çalışma, bu alanda yaygın olarak kullanılan bir teknik olan bu görüntüleme yöntemini kullanmadan palpasyon kılavuzluğunda enjeksiyonun fizibilitesini açıklamaktadır³⁷. μCT, patolojiyi ve kemik yapısını analiz etmek için güçlü bir araç olsa da, kapsamlı analitik özellikleri destekleyen yazılımların mevcudiyeti, analizlerde kullanıcılar arası değişkenliğe neden olabilir³⁸. Bu çalışmada, μCT tarama yatağının çapı 6.35 cm idi ve bu nedenle tüm kobay veya eklemin yerinde görüntülenmesi engellendi. Tüm hayvan görüntülemeyi kolaylaştırabilecek daha büyük yatak ataşmanları ticari olarak mevcuttur. Yazılım genellikle kullanıcı dostu olmasına ve önerilen birkaç ayar sunmasına rağmen, daha yüksek çözünürlük ve doğruluk için ayarları manuel olarak düzenlemek faydalı olabilir. Makine öğrenimi de dahil olmak üzere otomatik teknikler gelişmeye devam ettikçe, bu manuel ayarlamalar, standardizasyonu geliştirmek için yeni, otomatik yazılım teknikleriyle değiştirilebilir³⁹. Sunulan el yazması, kullanılan μCT ve ilgili yazılım için adım adım talimatları açıklarken, aynı analizler diğer markalar ve yazılımlarla da gerçekleştirilebilir; Araştırmacılar, farklı makineler ve/veya yazılımlar kullanırken görüntü analizlerini optimize etmek ve standartlaştırmak için ilgili kullanım kılavuzlarına başvurmalıdır. Değişkenliği azaltmak için, tüm numunelerde aynı ayarların korunması önemlidir. Görüntü analizlerinin öznelliği, birden fazla, kör deneyci tarafından yapılan analizlerin tekrarlanmasıyla daha da azaltılabilir.

Bu protokolün birincil amacı, kobaylarda teknik olarak zorlu bir prosedürün gerçekleştirilmesi ve ilişkili OA değişikliklerinin müteakip μCT analizleri hakkında ayrıntılı rehberlik sağlamaktır. Teknik ve veri analizlerinin standardizasyonu, maliyetin en aza indirilmesine ve verimliliğin artırılmasına yardımcı olacaktır.

Materials

200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples